ゼブラフィッシュの発生における急性腎障害のモデル化のための正確な細胞除去法

サマリー

この研究は、腎臓GFPトランスジェニックゼブラフィッシュを用いた分節型腎障害の新しいインビボモデルを提示する。このモデルは、腎上皮細胞の標的アブレーションの誘導を可能にし、ネフロン傷害および修復の細胞機構を示す。

要約

急性腎臓傷害（AKI）は、高い死亡率を有する一般的な病状である。腎臓の修復能力により、支持療法後に適切な腎機能を回復させることが可能である。しかし、細胞死を最小限に抑え、再生プロセスを強化するためには、細胞レベルでネフロン細胞の死滅および修復がどのように起こるかをより良く理解することが必要である。 zebrafish pronephrosは、哺乳動物ネフロンに類似した解剖学的セグメントを含むため、この目標を達成するための良いモデルシステムです。以前は、魚の腎障害を研究するために使用された最も一般的なモデルは、薬理学的ゲンタマイシンモデルであった。しかしながら、このモデルは、損傷の正確な時空間制御を可能にせず、したがって、腎臓修復に関与する細胞プロセスおよび分子プロセスを研究することは困難である。この制限を克服するために、この研究は、ゲンタマイシンアプローチとは対照的に、特定の緑色蛍光タンパク質（GFP）-ex青色レーザ光（405nm）を用いてネフロンセグメントをプレスすることができる。このAKIの新規モデルは、上皮損傷の他の方法が欠けている多くの利点を提供する。その主な利点は、強いインビボ動物モデルにおいて、損傷レベルと正確な時空間制御を「ダイヤル」する能力である。この新しい方法は、腎障害および修復機構の理解のレベルを有意に高める可能性を有する。

概要

急性腎不全とも呼ばれる急性腎障害（AKI） ^{1,2 は、}腎機能の突然の障害として広く定義されている³ 。この状態の理解のレベルは長年にわたって著しく向上しているが、罹患率と死亡率は高いまま^{である 1,2} 。この状態の現在の治療法は、薬物治療の複数の臨床試験の結果が陰性であったため、ほとんど支持的である^4,5 。腎臓は、それ自身を修復する能力を有する点で独特である。したがって、AKIの早期診断後の支持療法は、罹患率を制限する最良の方法である⁶ 。しかし、早期にAKIを検出することは困難であり、死亡率は透析が必要な患者では50-80％。腎臓が自分自身を修復する能力およびこの状態の治療選択肢の欠如により、このネフロン再生プロセスを強化する方法を開発することが重要である。

傷害や動物モデルのさまざまなエージェントを含むAKIの研究に使用される多くの異なるモデルがありました。腎臓障害の薬剤に関して、アミノグリコシド抗生物質ゲンタマイシンは、AKI7,8に至る腎毒性剤として使用されている。しかし、いくつかのグループは、ゲンタマイシン処理がゼブラフィッシュ胚⁹に対....

プロトコル

この研究は、国立衛生研究所の実験動物のケアおよび使用のためのガイドの勧告に従って実施された。このプロトコルは、NYITCOMのOsteopathic Medicine Institutional Animal Care and Use Committee（NYITCOM IACUC）によって承認されました。全ての手術および生体内実験は、トリカイン麻酔下で実施され、苦痛を最小限に抑えるためにすべての努力がなされた。

1.胚の入手と維持

1. 腎臓のGFP蛍光ゼブラフィッシュを横切って胚を得る。
   注：蛍光標識ゼブラフィッシュトランスジェニック系の例を表1に示す 。
2. 受精後24時間にE3溶液に28.5℃で胚を保つ。
3. 24時間後、培地を0.003％1-フェニル-2-チオ尿素（PTU）を含有するE3溶液と交換する。
   注：メラニン形成におけるチロシナーゼ依存性のステップをブロックするため、PTUを使用する色素沈着を防止する。ここでは、この解決策をE3-PTUと呼ぶ。
4. 受精した胚を28.5°Cで6 dpf以上になるまで上げます。その時点で腎臓は成熟しています。
   注：7-9 dpfウィンドウでは幼虫を使用することをお勧めします。
5. 40倍の倍率および緑色蛍光発光フィルターで蛍光解剖顕微鏡を使用して、明るい腎臓GFP蛍光....

結果

このプロトコルはET（krt8：EGFP）sqet11-9、ET（krt8：EGFP）sqet33-d10、およびTg（atp1a1a.4：GFP）を含む多くの腎臓GFPトランスジェニック系統でうまく使用されたことに注意してください。ここに示されている例の結果は、ET（krt8：EGFP）sqet11-9系統を用いて得られた。

図1は、光切断プロトコルの例を示す。平均GFP強度は、関心領域内でモニターされる（ 図1Aおよび映画1 ）。例示的な平均強度トレースを図1Bに示す 。

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ディスカッション

全レーザ出力はシステムによって異なることに留意されたい。しかし、％GFP光退色を使用すると、レーザー出力の変動とは無関係に、蛍光腎臓に送達され、暴露の長さによって補償される総エネルギーの読み出しが可能になる。しかし、この光切除法に対する異なる組織の応答は様々であることに留意してください。腎臓の成熟中でさえ、成熟した幼虫よりも若い胚でGFP蛍光の50％の減少を得ることは、はるかに困難である。このプロトコルを変更し、異なるアプリケーションに適応させる場合、光分解に対する組織反応性のこれらの差異を考慮する必要があります。したがって、傷害の量および傷害された腎臓上皮の予測される応答を適切に測定するために、GFP蛍光の減少パーセントをモニターすることが重要である。

この方法の主な利点は、腎障害の他の方法とゼブラフィッシュはそれが損傷の時空間的位置の正確な制御を可能にするものである。また、研究者は怪我のレベルを上下させることができます。傷害の量を制御するこの能力は、上皮細胞の応答の検査を可能にするべきであり、回復対アポトーシス対壊死の意思決定を助けるべきである。例えば、細胞移動は、部分的切除に.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ペトリ皿、35 x 10 mm	ジェネシー・サイエンティフィック	32-103	手続き型 使用法 ステップ2.4、2.7
ペトリ皿、100 x 15 mm	ミッドウェスト・サイエンティフィック	910	手続き型 使用法 ステップ1
デコレーション鉗子 - 電子顕微鏡科学 デュモン・ピンセット 5 デュモスター	・フィッシャー・サイエンティフィ	50-241-57	手続き型 使用法 ステップ2.1.1
プラスチック転写ピペット	グローブScientific	135030	手続き型 使用法: ステップ 2.5, 3.6
Tricaine	Sigma Aldrich	A5040-25G	手続き型 使用法: ステップ 2.3, 3.4
アガロー	フィッシャー サイエンティフィ	BP165-25	手続き型 使用法: ステップ 2.3
プルド ガラス プローブ (ガラス キャピラリー チューブから手動で製造)	フィッシャー サイエンティフィ	21-1640-2C	手続き型 使用法: ステップ 2.4
実体顕微鏡	ニコン	SMZ1270	手続き 使用法: ステップ 1.5
SOLA ライトエンジン	ルーメンコール	SOLA SM-5-LCR-SB	手続き 使用法: ステップ 1.5
Eclipse C2 Plus 共焦点顕微鏡システム	ニコン		手続き 使用法: ステップ 3
1x E3 ソリューション			生成に使用したレシピ: 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2 , 0.33 mM MgSO4 手続き型ステップ 使用法: 1.2, 1.3, 2.2, 2.3
PTU	Sigma	P7629-10G	手続き型ステップ 使用法: 1.3, 2.2, 3.4, 4.2
NIS Elements Software	Nikon	C2+	手続き型 使用法: ステップ3
レーザーユニット	Agilent	MLC 400	手続き型ステップ 3.11
プロピジウムヨウ化物(PI)	Sigma Aldrich	P4170-100MG	手続きステップ使用法:4.2

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