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方法論記事

血液滴からの迅速な好中球走化性解析のためのオールオンチップ法

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DOI：

10.3791/55615

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2017年6月23日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Applied Technology, Hefei Institutes of Physical Science, Chinese Academy of Sciences, 2University of Science and Technology of China, 3Department of Physics and Astronomy, University of Manitoba, 4Department of Biosystems Engineering, University of Manitoba, 5Seven Oaks General Hospital, 6Department of Immunology, University of Manitoba, 7Department of Biological Sciences, University of Manitoba

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

この記事では、全血からのチップ上の好中球単離と、単一のマイクロ流体チップ上の走化性試験とを統合することにより、迅速な好中球走化性アッセイを行う詳細な方法を提供する。

要約

好中球の移動と走化性は私たちの体の免疫系にとって重要です。マイクロ流体デバイスは、リアルタイムビジュアライゼーション、化学濃度勾配生成の正確な制御、および試薬およびサンプル消費の低減におけるそれらの利点のために、好中球移動および走化性を調べるためにますます使用されている。近年、全血から直接的に、統合された、容易に操作される微小流体走化性分析システムを開発するために、マイクロ流体研究者によってますます努力がなされている。この方向では、最初のオールオンチップ法が、好中球の磁気陰性浄化と小血液量試料からの走化性アッセイとを統合するために開発された。この新しい方法は、25分で迅速なサンプル - 結果好中球走化性試験を可能にする。本稿では、このオールオンチップ走化性アッセイの詳細な構築、操作、およびデータ分析方法について、トラブルシューティング戦略、limi将来の方向性を示しています。この全オンチップ法を用いて、定義された化学誘引物質、 N-ホルミル-Met-Leu-Phe（fMLP）および慢性閉塞性肺疾患（COPD）患者からの痰を試験する好中球走化性アッセイの代表的結果を示す。この方法は、多くの細胞移動関連の調査および臨床応用に適用可能である。

概要

化学走性は、可溶性化学物質濃度勾配への細胞の移動の過程であり、免疫応答1,2,3 、組織発生4および癌転移5を含む多くの生物学的過程に決定的に関与する。好中球は最も豊富な白血球のサブセットであり、身体の本来の宿主防御機能を可能にし、適応免疫応答を媒介するのに重要な役割を果たす6,7 。好中球には、高度に制御された走化性機構が装備されており、これらの運動性免疫細胞は、病原体由来の化学誘引物質（ 例えば、 fMLP）および宿主由来の化学誘引物質（ 例えば、インターロイキン-8）好中球遊走および走化性は、様々な生理学的問題を媒介する炎症や癌などの疾患1,9。したがって、好中球走化性の正確な評価は、好中球の生物学および関連疾患を研究するための重要な機能的読出しを提供する。

広く使用されている従来の走化性アッセイ（ 例えば、トランスウェルアッセイ10 ）と比較して、マイクロ流体デバイスは、正確に制御された化学勾配の生成および小型化のために、細胞遊走および走化性の定量的評価に大きな期待を寄せている11,12,13 。過去20年の間に、様々な生物学的細胞型、特に好中球11の走化性を研究するために、様々なマイクロ流体装置が開発されてきた。時空間複合体における好中球遊走の特徴づけに多大な努力を注いだマイクロ流体デバイス14,15内に構成されたマイクログラディエントを含む。生物学的研究と並んで、マイクロ流体デバイスの応用は、疾患評価のために臨床試料を試験するために拡張されている17,18,19。しかしながら、多くのマイクロ流体デバイスの使用は、専門の研究室に限られており、大量の血液サンプルから長時間の好中球単離を必要とする。したがって、迅速な好中球走化性分析のための統合されたマイクロ流体デバイスを、一滴の全血から直接的に開発する傾向が高まっている（20,21,22,23 ）ef "> 23,24。

この方向に向かって、磁気陰性好中球精製とそれに続く走化性アッセイとを単一のマイクロ流体装置25に統合したオールオンチップ法が開発された。このオールオンチップ法は、1）接着に基づく細胞捕捉または細胞サイズに基づく濾過によって好中球を血液から単離する従来のオンチップ戦略とは対照的に、この新しい方法は、少量の全血からの好中球のオンチップ磁気分離、ならびに化学誘引物質刺激による走化性測定; 2）細胞ドッキング構造は、好中球の初期位置を化学勾配チャネルに近づけるのを助け、単一細胞追跡なしで簡単な走化性分析を可能にする。 3）好中球単離とケモトの統合単一のマイクロ流体デバイス上での軸解析により、実験ステップ間に中断がない場合、25分で迅速なサンプル - 結果の走化性分析が可能になる。

このペーパーでは、このオールオンチップ走化性アッセイの構築、操作およびデータ解析方法の詳細なプロトコールを提供します。この論文は、既知の組換え化学誘引物質および複雑な走化性試料を患者から試験し、続いてトラブルシューティングの戦略、限界および将来の方向性について議論することによって、好中球走化性を行うための開発された方法の有効な使用を実証する。

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プロトコル

すべてのヒト試料採取プロトコールは、ウィニペグのマニトバ大学の共同学部研究倫理委員会によって承認された。

マイクロフルイディックデバイス製造（ 図1A ）

  1. デザインと印刷透明マスク。
    1. 前に詳述したようにデバイスを設計してください。 図1Aを参照のこと。
      注記：デバイスには2つのレイヤーがあります。第1の層（高さ4μm）は、勾配チャネルの横の細胞を捕捉するための細胞ドッキングバリアチャネルを規定する。第2の層（高さ60μm）は、勾配生成チャネル、細胞装填のためのポートおよびチャネル、化学的入口リザーバおよび廃棄物出口を規定する。アライメントマークは、2つの層に対して設計されている。第2の層の場合、上流の蛇行入力チャネルの長さおよび幅は、それぞれ60mmおよび200μmであり、下流の長さと幅蛇行入力チャンネルはそれぞれ6mmと280μmです。
    2. 高解像度プリンタを使用して、第1および第2のレイヤーのフィーチャを透明マスクに印刷します。
      注：印刷解像度は、デザインの最小機能によって異なります。現在の設計では、10μmの最小フィーチャに対して32,000dpiが選択された。
  2. シリコンウェーハをクリーニングします。
    1. プラズマクリーナにシリコンウェーハを3枚入れます。 3分間真空を適用する。
    2. プラズマパワーをオンにし、レベルをHIGHに設定します。シリコンウェハを30分間処理するために酸素プラズマを使用する。
    3. プラズマクリーナーをオフにしてシリコンウェーハを取り出します。シリコンウェーハはデバイスモールドを製造する準備が整う。
  3. クリーンルーム施設でフォトリソグラフィーによって第1の層を製作する。
    注記：正確な製造パラメータは、製造施設によって異なる場合があります。
    1. 10mLのSU-8 2025を10mLのSU-8 2000をガラスブレーカに入れて設計されたフォトレジストを調製した。泡が消えるまで、混合物をヒュームフードに10分間放置する。
    2. 洗浄したシリコンウェーハを注意深くスピナーに適切なチャックで置き、真空をかけてシリコンウェーハを固定します。
    3. 慎重に、3 mLのフォトレジスト混合物をシリコンウェーハの中心に注ぎます。 500rpmで5秒間回転させる。次に、3000rpmで30秒間回転させて、シリコンウェーハ上に最終的な4μmの厚さのフォトレジストコーティングを得る。
    4. 慎重にスピンナーからシリコンウェーハを取り出し、ホットプレート上でシリコンウェーハを95℃で4分間ベークします。
    5. マスクアライナーにシリコンウェーハを慎重に置き、UV暴露時間を6秒に設定します。粘着テープを使用して透明ガラス板上に第1層の透明マスクを慎重に取り付ける。
    6. マスクが貼られた透明ガラス板をアライナーに静かに置き、マスクをシリコンウェーハに合わせます。 siを公開するliconウェーハをUVに曝して細胞ドッキング構造をパターニングする。
    7. 慎重にガラス板を取り外し、露出したシリコンウェーハを取り出します。 95℃で4分間、ホットプレート上でシリコンウェーハを焼く。
    8. シリコンウェーハをヒュームフードに移し、SU-8デベロッパーが入っているガラスパンに置きます。これを30秒間静かに振ってください。
    9. 新鮮なSU-8現像液を使用してシリコンウェーハを洗浄し、次にヒュームフード内のイソプロピルアルコール（IPA）を洗浄します。ヒュームフード内の窒素ガスでシリコンウェーハを乾燥させる。最初のレイヤーが準備完了です。
  4. 第1層の第2層を製作する。
    1. 接着テープを使用して、第1層のアライメントマークをカバーします。慎重に、スピナーの真空チャック上に第1の層を有するシリコンウェーハを置き、真空を適用してシリコンウェーハを固定する。
    2. シリコンウェーハ上に3 mLのSU-8 2025フォトレジストを注ぎます。シリコンウェーハを500 rpmで5秒間回転させます。次に2000rpmで30分間回転させるシリコンウェーハ上に最終的な厚さ60μmのフォトレジストコーティングを得る。
    3. スピンナーからシリコンウェーハを慎重に取り出し、ホットプレートに移します。 65℃で2分間焼く。
    4. 粘着テープを静かに取り外して、第1層のアライメントマークを露出させます。ホットプレート上にシリコンウェーハを置き、95℃で6分間ベークします。
    5. マスク・アライナにシリコン・ウェーハを慎重に置き、UV照射時間を18秒に設定します。
    6. 透明なガラス板の上に第2層の透明マスクを粘着テープで注意深く取り付けます。
    7. アライナーのガラスにマスクを貼った状態で慎重にアライナーに置き、アライナーの検査用顕微鏡を使用して、交差アライメントマークでマスクと第1層をシリコンウェハー上に合わせます。
    8. フォトレジストでコーティングされたシリコンウェハをUVに暴露して、細胞負荷および勾配チャネルをパターン化する。
    9. 慎重にガラス板を取り出してシリコンwを取り出しますアファー。シリコンウェーハをホットプレート上で65℃で2分間ベークし、次にシリコンウェーハを別の95℃ホットプレートに移し、6分間ベークする。
    10. シリコンウェーハをヒュームフードに移し、SU-8デベロッパーが入ったガラス皿に置きます。静かに6分間振とうする。
    11. 新鮮なSU-8現像液を使用してシリコンウエハを洗浄し、次にヒュームフード内のIPAを洗浄する。
    12. ヒュームフード内の窒素ガスを用いてシリコンウェーハを乾燥させます。ホットプレート上にシリコンウェーハを置き、金型を150℃で30分間ハードベークします。第2層は準備ができている。
  5. マスターモールド表面改質。
    注：ソフトリソグラフィにおけるモールドからのポリジメチルシロキサン（PDMS）の放出を容易にするために、SU-8モールドにシラン処理表面改質工程を適用する。
    1. 10μLのトリデカフルオロ-1,1,2,2-テトラヒドロオクチル（トリクロロシラン）溶液をマイクロピペットチップに入れます。マイクロピペットチップを15mLプラスチックチューブに入れ、チューブのキャップを緩めます。
    2. チューブとSU-8パターニングされたシリコンウェーハをデシケータの中に置き、1時間真空を適用する。マスクモールドは、PDMSデバイスを製造する準備が整う。
  6. PDMSデバイスを製作します。
    1. プラスチックビーカーにPDMSベース40gと硬化剤4gを混合してPDMS溶液を調製します。準備されたSU - 8マスター型をペトリ皿に置き、44g PDMS溶液を注意深く鋳型上に注ぐ。
    2. ペトリ皿をデシケーターに入れ、PDMS溶液を20分間脱気するために真空を適用する。次に、ペトリ皿をオーブンに入れ、PDMSを80℃で2時間硬化させます。
    3. ベーキング後、ペトリ皿を取り出してクリーンベンチに置きます。 PDMSスラブを慎重に切断してSU-8モールドから剥がします。
    4. 直径3mmのパンチャーを使用して、細胞ローディングポートを打ち抜きます。直径6mmのパンチャーを使用して、化学薬品注入口リザーバーと廃棄物排出口を打ち抜きます。
    5. 埃を取り除く粘着テープを使用してPDMSスラブの表面に塗布する。 PDMSスラブときれいなスライドガラスをプラズマ装置に入れます。真空を3分間適用する。
    6. プラズマパワーをオンにし、レベルをHIGHに設定します。静かに空気弁を調整し、PDMSスラブとガラススライドを3分間プラズマで満たします。
    7. プラズマパワーをオフにし、真空を解放する。慎重に、ピンセットを使用してPDMSスラブとスライドガラスを取り出します。
    8. スライドガラスの上にPDMSスラブを（直面しているフェイスダウンの）チャンネル構造に直ちに置きます。軽くPDMSスラブを押してガラスに接着させます。すぐに脱イオン水でマイクロ流体チャネルを満たしてください。マイクロ流体デバイスの製造および組み立てが完了する。

2.マイクロ流体細胞の移動アッセイの準備

  1. マイクロ流体装置の準備。
    1. ストックフィブロネクチン溶液（1 mg / mL）50μLを950に希釈して50μg/ mLのフィブロネクチン溶液を調製する81;バイオセーフティーキャビネット内のLダルベッコリン酸緩衝食塩水（DPBS）。
    2. Roswell Park Memorial Institute培地（RPMI-1640）9 mLとRPMI-1640 1 mLを4％ウシ血清アルブミン（BSA）と混合して遊走培地を調製する。
    3. 装置から脱イオン水を除去する。
    4. フィブロネクチン溶液100μLをコンセントからデバイスに加えます。全てのチャンネルがフィブロネクチン溶液で満たされるように3分間待つ。カバーされたペトリ皿にマイクロ流体デバイスを室温で1時間置く。
    5. デバイスからフィブロネクチン溶液を除去する。出口から100μLの移動培地を加える。 3分間待って、すべてのチャンネルが移動媒体で満たされていることを確認します。
    6. デバイスを室温でさらに1時間インキュベートする。この装置は次に走化性実験の準備が整う。
  2. ケモタキシス実験のための化学誘引物質溶液調製。
    1. tで100nMのfMLP溶液を調製する。1mLの移動培地で培養した。ストック溶液FITC-デキストラン（10kDa、1mM）5μLをfMLP溶液と1.5mLチューブに混合する。
      注：FITC-Dextranはグラジエント測定に使用されます。あるいは、グラジエントインジケータとしてRhodamineを使用してください。次いで、fMLP化学誘引物質溶液は、走化性実験のために準備される。
  3. 喀痰試料の調製。
    注：COPD患者の喀痰標本の勾配によって誘発された好中球走化性を、このオールオンチップ法の臨床診断用途として試験した。
    1. COPD患者から喀痰サンプルを採取するためのヒト倫理プロトコールを取得する。
      注：ウィニペグのセブンオークス総合病院（マニトバ大学認可）でサンプルを採取する承認を取得しました。
    2. すべての被験者から書面による同意書を入手する。
    3. COPD患者の自発的な喀痰検体を採取する。 500μLの喀痰サンプルを1.5mLのチューブに入れます。
    4. 500μLの0.1％ジチオトレイトールを1.5mLチューブに入れ、静かに混合する。チューブを37℃の水浴に15分間置きます。
    5. サンプルを753×gで10分間遠心分離し、上清を集める。上清を865×gで5分間遠心分離し、最終上清を集める。使用前に、回収した上清を-80℃冷凍庫に保存してください。
    6. 走化性実験の準備ができたら、痰溶液を解凍する。 900μLの移動培地を1.5mLチューブに移し、バイオセーフティキャビネット内で100μLの痰溶液と混合する。次に、喀痰溶液は走化性実験の準備が整う。
  4. 血液サンプル収集。
    1. 健康なドナーから血液サンプルを採取するための人間倫理プロトコールを取得する。すべての献血者から書面による同意書を入手する。
      注：ここでのサンプルは、ウィニペグのヴィクトリア総合病院で得られたものである（マニトウ大学共同学術研究倫理委員会）。
    2. 静脈穿刺により血液試料を採取し、EDTA被覆チューブに試料を入れる。実験の前にチューブをバイオセーフティキャビネットに保管してください。

3.オールオンチップ走化性アッセイ操作

  1. オンチップの細胞分離（ 図1B ）。
    1. バイオセーフティキャビネット内の1.5 mLチューブに全血10μLを入れる。
      注：血液サンプル採取の詳細はセクション2.4にある。
    2. 好中球単離キット（材料の表を参照）から2 mLの抗体カクテル（Ab）と2μLの磁性粒子（MP）を1.5 mLチューブに添加し、穏やかに混合する。これは、好中球以外の血液中の細胞を標識する。
    3. 血液-Ab-MP混合物を室温で5分間インキュベートする。
      注：これは、血液中の抗体標識細胞を磁気的に標識する。
    4. 2つの小さな磁気ディスクをセルローディングpの両側に取り付けますデバイスのort。装置のすべてのポートから培地を吸引します。
    5. 2μLの血液-Ab-MP混合物を細胞装填口からマイクロ流体装置にゆっくりとピペットで移す。
      注意：磁気標識された細胞は、細胞ローディングポートの側壁に捕捉され、一方、好中球は、デバイスに流入し、細胞ドッキング構造に捕捉される。
    6. 十分な好中球が細胞ドッキング領域に閉じ込められるまで数分間待ちます。
  2. 走化性アッセイ（ 図1C ）。
    1. マイクロ流体装置を37℃の温度制御された顕微鏡ステージ上に置く。
    2. 2つのピペッターを使用して、100μLの化学誘引物質溶液（fMLPまたは痰溶液）および100μLの移動培地を指定の注入口リザーバーに加えます。これは、加圧によって補助される連続的な層流化学的混合によって、勾配チャネル中に化学誘引剤勾配を生成するバランス構造。
      注：COPD患者の喀痰採集の詳細は2.3節に記載されている。
      1. 培地対照実験では、両方の入口リザーバに移動培地を加えるだけです。
    3. 勾配チャネル中のFITC-デキストランの蛍光画像を取得する。
    4. コマンド "File | Open"を使用してImageJソフトウェアにイメージをインポートします。
    5. "Analyze | Plot Profile"コマンドを使用して、グラジエントチャンネルの蛍光強度プロファイルを測定します。
    6. さらにプロットするために測定データをスプレッドシートにエクスポートします。
    7. 温度制御された顕微鏡ステージまたは従来の細胞培養インキュベーターで15分間装置をインキュベートする。
    8. データ分析のために細胞の最終位置を記録するために10X対物レンズを用いてグラジエントチャネルをイメージ化する。
    9. 必要に応じて、デバイス内の細胞移動を経時顕微鏡で記録します。

4.細胞移動Data分析（ 図1C ）

  1. 下記のように、ドッキング構造からの細胞移動距離を計算することにより、走化性アッセイを分析する。 図1Cを参照のこと。
  2. イメージをNIH ImageJソフトウェアにインポートします（ver.1.45）。
  3. グラデーションチャンネルに移動した各セルの中心を選択します。
  4. 選択したセルの座標を最終的な位置として測定します。ドッキング構造の端にある点の座標を初期基準位置として測定します。
  5. 測定された座標データをスプレッドシートソフトウェア（Excelなど）にエクスポートします。セルの移動距離を、セルの最終位置と勾配方向に沿った初期基準位置との間の差として計算する。
  6. マイクロメーターまでの距離を較正する。走化性の尺度として全細胞の移動距離の平均および偏差を計算する。
  7. Migの比較スチューデントt検定を用いた培地対照実験に対する化学誘引物質勾配の存在下での非定量距離。
  8. 細胞移動の時間経過画像が記録されている場合、細胞の移動および走化性を細胞追跡分析15によってさらに分析することができる。
    注：オールオンチップ走化性アッセイを構築および実施するために必要な材料は、材料表に詳述されている。

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結果

好中球は、マイクロ流体デバイス内の直接の一滴の全血から陰性に選択される。単離された好中球の純度は、Giemsa染色で確認され、その結果は、好中球の典型的なリング形状およびローブ形状の核を示した（ 図2A ）。これは、少量の全血から高純度で効果的なオンチップ好中球単離を示す。さらに、ドッキング構造は、化学勾配（ 図2B ） 25を適用する前に、勾配チャネルの隣の細胞を効果的に整列させることができる。

勾配の生成は、連続的な層流化学混合に基づいており、流れは、入口および出口溶液の異なるレベルからの圧力差によって駆動される。外部ポンプは不要です。化学勾配tは、勾配チャネルを横切るFITC-デキストランの蛍光強度プロファイルによって特徴付けられる、微小流体装置内で数分以内に確立される。勾配は少な...

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ディスカッション

この論文では、全血から好中球を直接単離した後、走化性試験を単一のマイクロ流体チップ上に直接行うための詳細なプロトコールが記載されている。このメソッドは、簡単な操作、高純度好中球のネガティブ選択、迅速なサンプルから結果の走化性試験、試薬とサンプルの使用量の削減、正確な細胞移動データ解析の有用な機能を提供します。大まかな見積もりとして、入力全血試料からの好中球の少なくとも25％が装置内のドッキング構造に効果的に入り、Giemsa染色により、好中球の純度が高いことがわかった。

この開発されたオール・オン・チップの走化性分析法は、様々な細胞移動研究および臨床応用において大きな可能性を秘めている。この方法の研究適用は、培地単独での好中球走化性をfMLP勾配と比較することによって実証された。同様に、この方法を用いてCOPD spuの好中球走化性を試験することができる臨床診断のための細胞機能性バイオマーカーの開発の例として、この方法により、研究者は、異なる化学誘引物質に対する好中球走化性を個々にまたは組み合わせて容易に試験することができる。研究者はまた、この方法を用いて潜在的に変化した走化性応答...

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開示事項

開示する利益相反はありません。

謝辞

この研究は、カナダの自然科学・工学研究評議会（NSERC）とカナダ健康研究所（CIHR）からの助成によって部分的に支えられています。ウイニペグのビクトリア総合病院とウイニペグのセブンオークス総合病院の応用臨床教育研究所は、ヒト被験者から臨床サンプルを管理していただき、ありがとうございました。 Hagit Peretz-Soroka博士に、アッセイ操作の戦略についての有益な議論に感謝します。 ワイルドー大学のCarolyn Ren教授とXiaoming（Cody）Chen博士に、撮影プロセスにおける豊富なサポートに感謝します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
デバイス製造
マスクアライナーABMN/A
スピナーSolitec5000
ホットプレートVWR11301-022
プラズマクリーナーハリック プラズマPDC-001
真空デシケーターフィッシャーサイエンティフィ08-594-15A
デジタルスケールオーハウスCS200
SU-8 2000 マイクロケムSU-8 2000
SU-8 2025 フォトレジストマイクロケムSU-8 2025
SU-8 現像液マイクロケムSU-8 現像
シリコン社LG2065
イソプロピルアルコールフィッシャーサイエンティフィックA416-4
(トリデカフルオロ-1,1,2,2-テトラヒドロオクチル) トリクロロシランGelest78560-45-9
ポリジメチルシロキサン
(PDMS)		エルスワース 接着剤2065622
ペトリ皿フィッシャーサイエンティフィックFB0875714
スライド フィッシャーサイエンティフィック12-544-4
カッティングパッドN/AN/Aオーダーメイド
パンチャーN/AN/Aカスタムメイド
名前ソースカタログ番号コメント
オンチップ細胞分離および走化性アッセイ
RPMI 1640フィッシャーサイエンティフィックSH3025502
DPBSフィッシャーサイエンティフィックSH3002802
ウシ血清アルブミン
(BSA)		Sigma-AldrichSH3057402
フィブロネクチンVWRCACB356008
fMLPSigma-AldrichF3506-10MG
磁気ディスクインディゴインスツルメンツ44202-1直径 5 mm、
厚さ 1 mm
FITC-デキストランSigma-AldrichFD10S
Rhodamine
Sigma-Aldrich		R4127-5G
ギムサ染色液Rowley Biochemical Inc.G-472-1-8OZ
EasySep Direct Human
Neutrophil Isolation
Kit		STEMCELL
Technologies Inc		19666
DithiothreitolSigma-AldrichD0632
Nikon Ti-U inverted fluorescent microscopeNikonTi-U
Microscope environmental chamber.InVivo ScientificN/A
CCD カメラニコンDS-Fi1
ック 液

参考文献

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