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生体分子構造決定のための単分子レベルでの高精度FRET

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DOI：

10.3791/55623

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2017年5月13日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry, Clemson University, 2Department of Physics and Astronomy, Clemson University, 3Department of Biochemistry and Molecular Biology, Center for Membrane Biology, Graduate School for Biomedical Sciences, University of Texas Health Science Center

この記事について

サマリー

単一分子レベルでの高精度FRET実験のプロトコールをここに示します。さらに、この方法論は、N-メチル-D-アスパラギン酸（NMDA）受容体のリガンド結合ドメインにおける3つの構造状態を同定するために使用することができる。正確な距離を決定することは、FRET実験に基づく構造モデルを構築するための第一歩です。

要約

マルチパラメータ蛍光検出（MFD）モードにおいて、単分子レベルでのフォルスター共鳴エネルギー移動（FRET）を用いて高精度の眼間距離測定を行う方法に関するプロトコールをここに示す。 MFDは、光物理学的および実験的アーチファクトを減少させるために蛍光のすべての「次元」の使用を最大にし、剛性生体分子において〜1Åまでの精度での粒子間距離の測定を可能にする。この方法を用いて、N-メチル-D-アスパラギン酸（NMDA）受容体のリガンド結合ドメインの3つの構造状態を同定し、リガンド結合時の受容体の活性化を説明した。既知の結晶学的構造を実験測定と比較すると、より動的な生体分子については3Å未満で合意した。生体分子の全次元をカバーする一組の距離制限を集めることにより、動的生体分子の構造モデルを提供することが可能になるes。

概要

構造生物学研究の基本的な目的は、生体分子機械の構造と機能との関係を解明することである。生体分子（ 例えば、タンパク質や核酸）の最初の視覚的印象は、1950年代にX線結晶構造解析1,2によって生じました。 X線結晶解析は、結晶充填によって制約される高分解能、静的構造情報を提供する。したがって、X線構造モデルの固有の不動性は、ほとんどの生物学的機能に影響を及ぼす因子である生体分子の動的性質を排除する3,4,5。核磁気共鳴（NMR） 6,7,8 は、水溶液中の構造モデルを分解することによって、この問題に対する代替の解決法を提供した。大きな利点NMRは、構造、力学、および機能3,4,5の間の内在的な関係を明確にするのに役立つ、生体分子および立体構造アンサンブルの固有の動的性質を回復する能力である。それにもかかわらず、NMRは、試料の大きさおよび試料の大量によって制限され、より大きなシステムのための複雑な標識方法を必要とする。したがって、構造生物学における代替法を開発することが急務である。

歴史的に、フォルスター共鳴エネルギー移動（FRET） 9は、FRETが低精度の距離測定を提供するという誤解のために、構造生物学において重要な役割を果たしていない。このプロトコールの目的は、FRETがナノメートルスケールでの距離を決定する能力を再考することであり、そのような距離は、生体分子の構造モデルを構築するために使用することができる。最初の実験的検証FRET効率に対するR - 6依存の変化は、様々な長さのポリプロリンを「分光学的定規（spectroscopic ruler）」として測定することにより、1967年にStryerによって行われた。同様の実験が2005年の単一分子レベルで達成された11 。ポリプロリン分子は理想的ではないことが判明したので、後で二本鎖DNA分子を使用した。これにより、正確な距離測定のためのウィンドウが開き、FRETを使用して生体分子の構造特性を同定するというアイデアが開かれました。

眼間距離範囲が〜0.6〜1.3 R 0である場合、FRETは最適である。ここで、R 0はフォルスター距離である。単一分子FRET実験に用いられる典型的なフルオロフォアについては、 R 0は約50Åである。典型的には、FRETは、他の方法よりも多くの利点を提供し、その構造および動態を（i）蛍光の究極の感度のために、単分子FRET実験13,14,15,16は、個々のメンバーの構造を直接的に計数し同時に特徴付けることにより、異種アンサンブルを分解することができる。 （ii）複雑な反応経路は、アンサンブルの同期化が必要ないため、単一分子FRET研究で直接解読することができる。 （iii）FRETは、10年以上にわたる幅広い時間的領域にアクセスし、生物学的に関連する様々なダイナミクスをカバーすることができる。 （iv）FRET実験は、 インビトロおよびインビボの任意の溶液条件で行うことができる。 FRETと蛍光顕微鏡との組み合わせは、生きた細胞の分子構造および相互作用の直接的な研究を可能にする15,16 、 高精度20であっても17 ° 、 18 ° 、 19 °である。 （v）FRETは、ほぼ任意のサイズの系（ 例えば、ポリプロリンオリゴマー21,22,23,24、Hsp90 25 、HIV逆転写酵素26 、およびリボソーム27 ）に適用することができる。 （vi）最後に、生体分子のすべての次元性を含む距離のネットワークを用いて、静的分子または動的分子18,28,29,30,31,32,33,34,36の構造モデルを導出することができる。ref "> 35,36,37。

したがって、単一分子FRET分光法を使用して、距離制限構造モデル26に使用するのに十分正確な距離を導出することができます。これは、8つの次元の蛍光情報（ すなわち、励起スペクトル、蛍光スペクトル、異方性、蛍光寿命、蛍光量子収率など）を利用するマルチパラメータ蛍光検出（MFD）28,38,39,40,41,42を利用することによって可能である。巨視的時間、蛍光強度、および蛍光体間の距離）を正確かつ正確に提供して、距離制限を提供する。さらに、パルスインターリーブド励起（PIE）は、MFD（PIE-MFD） 42を用いて、直接励起アクセプター蛍光をモニターし、1：1ドナー - アクセプター化学量論を含むサンプルから生じる単一分子事象を選択する。典型的なPIE-MFDセットアップは、共焦点顕微鏡本体に接続された2パルスインターリーブ励起レーザーを使用し、光子検出は、異なるスペクトル窓および偏光特性の4つの異なるチャネルに分割される。詳細は図1を参照してください。

FRETは、FRET結果26,30と一致する原子的様構造モデルを達成するために、計算方法とFRETを組み合わせなければならないことに注意することが重要です。現在の議定書の目標は、関連する方法論を踏襲して、FRETに由来する距離を有する構造モデルを構築することではない。しかしながら、これらのアプローチは、他の技術（ 例えば、小角X線散乱または電子常磁性共鳴）、統合的な構造生物学の分野を生み出す43,44,45,46。現在の目標は、構造生物学の定量的ツールとしてFRETの道を開くことです。一例として、この方法を用いて、N-メチル-D-アスパラギン酸（NMDA）受容体のリガンド結合ドメイン（LBD）における3つの構造状態を同定した。最終的な目的は、前述の限界を克服し、測定距離を高精度で提供することによって生体分子の構造決定に使用される統合的方法の中でFRETをもたらすことである。

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プロトコル

PBS緩衝液の調製およびチャンバー処理

注：湿った化学実験を行うときは、実験室コートと使い捨て手袋を着用してください。レーザーを調整するときは目の保護具を使用してください。

  1. PBS緩衝液調製
    1. 4.5gのNa 2 HPO 4、0.44gのNaH 2 PO 4 、および3.5gのNaClを400mLの蒸留水に溶解する。 7.5のpHを確保し、液体サイクルで1時間（オートクレーブシステムに応じて）オートクレーブすることによって溶液を滅菌する。
    2. PBS溶液15mLを採り、それを木炭0.1gと混合する。 0.2μmの細孔サイズを有する標準的な20mLシリンジフィルターを用いて混合物を濾過する。室温でPBSバッファーを密封して保管します。
  2. 顕微鏡のチャンバーカバーガラス処理
    1. 500μLの蒸留水と5μLのポリソルベート20ノニオン性界面活性剤を添加する（材料リストを参照）チャンバーカバーガラスシステム（材料リストを参照）に入れ、よく混合します。 30分浸してください。ポリソルベート20溶液を除去し、蒸留水で2回洗浄する。乾燥させてください。
      注：チャンバはすぐに使用できる状態になっています。

DNAサンプルの調製

注記：二本鎖DNA（dsDNA）標準サンプルの作成については、設計された標識DNA鎖（材料リストを参照）を使用してください。設計されたオリゴは、決定された距離を損なう可能性のあるアーチファクトを回避するために、ポリマーの末端に染料を有してはならない。 DNA配列は、剛体として振る舞うように選択されるべきである。

  1. 1.5μLの供与体標識DNA鎖および4.5μLの相補的（アクセプター標識または非標識）DNA鎖を微量遠心チューブに加え、24μLのヌクレアーゼフリー水と混合する。
    注：選択したオリゴヌクレオチドの混合物に応じて、次のサンプルが生成されます：no-FRET、low-FRET、または高FRET dsDNAを含む。
  2. 95℃で10分間、90℃で10分間、80℃で10分間、70℃で10分間、60℃で10分間、50℃で次のプロセスを使用してDNAをハイブリダイゼーションします。 10分間、40℃で10分間、30℃で10分間、20℃で10分間、10℃で10分間、および5℃で保持した。
    注：生成されたdsDNAスタンダードは、長期保存のため-20℃の冷凍庫に保存するか、直ちに使用することができます。

3.タンパク質サンプルの調製

注：細菌系における目的のタンパク質の発現のための組換えDNAから出発して、距離が測定される残基をシステインに突然変異させることが可能である。これを行うには、標準的な部位特異的突然変異誘発技術を使用する（ 47） 。タンパク質の精製を容易にするために、組換えおよび変異したDNAを精製タグを含むベクター（ 例えば、Hisタグ）。 NMDAグルタミン酸イオン伝導性受容体（GluN1）LBD（ すなわち、 pET-22b（+）ベクターにクローニングされたNMDA GluN1 LBD）由来のグルタミン酸サブユニット1リガンド結合ドメイン（LBD）を使用した。

  1. タンパク質発現
    1. 選択した発現系48に DNAプラスミドを構築する。
      注：以下のステップは、可溶性タンパク質の発現が大腸菌で形質転換されると仮定する 。例えばトランスフェクトされた哺乳動物細胞49または形質導入された昆虫細胞50からの精製も可能であり、詳細な工程は他の場所で見出すことができる。選択した大腸菌株が目的のタンパク質に適切であることを確認する。例えば、ジスルフィド架橋を含むタンパク質の発現には、還元性の低い細胞内区画を有するコンピテント細胞の株が必要である（Materials List参照）。
    2. スターターに接種する E。単一の形質転換されたコロニー48を拾うために滅菌ピペットチップを用いて大腸菌培養物を培養する。それを100 mLの選択的LB培地（材料リストを参照）に落として、培養物を37℃で一晩増殖させる。
    3. LB培地を調製する（材料リストを参照）。オートクレーブして滅菌します。
    4. 一晩培養物を1：500の比の2Lの選択的LB培地に添加することにより、 形質転換大腸菌の大規模培養物を接種する。
    5. 次の数時間で600nmでの培養物の吸光度（Abs）をモニタリングすることにより培養物の増殖を評価し、600nmでの光学密度（OD 600 ）と呼ぶか、細胞密度計を使用する。測定値は時間とともに増加することに注意してください。
    6. 培養物が0.7のOD 600に達すると、0.5mMイソプロピル-β-d-1-チオガラクトピラノシド（IPTG）の最終濃度でタンパク質発現を誘導する。 大腸菌を20℃で20〜20分間振とうする。4時間。
    7. タンパク質を誘導した後、3,000×gおよび4℃で20分間スピンして大腸菌をペレット化する。上清を捨て、使用するまで-80℃で細胞内タンパク質を含む大腸菌ペレットを保存する。
  2. タンパク質の精製
    1. 溶解法（ 例えば、超音波処理、フレンチプレス、窒素キャビテーションなど ）を用いたLyse E. coli 51 。
    2. 185,000 xgおよび4℃で1時間、ライセートを遠心分離することにより、膜および細胞破片をスピンダウンします。
    3. Hisタグ付きタンパク質については、高速タンパク質液体クロマトグラフィー（FPLC）システム（ 材料表参照） 52を使用して、平衡化されたニッケル充填固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（IMAC）カラムに上清をロードする 。
      注：NMDA GluN1 LBDの平衡緩衝液：200mM NaCl、20mM Tris、および1mMグリシン、pH8。NM用溶出緩衝液DA GluN1 LBD：200mM NaCl、20mM Tris、1mMグリシン、および400mMイミダゾール、pH8。
      1. 低量（約12mM）のイミダゾールを含有する緩衝液でIMACカラムを洗浄する。
      2. 12mM〜400mMのイミダゾールの直線勾配を使用してIMACカラムからタンパク質を溶出させる。
    4. イミダゾール53を含まない平衡緩衝液中でタンパク質を一晩透析する。工程3.2.3.2からの溶出液を透析チューブに入れ、平衡緩衝液中に連続的に攪拌しながら2-3時間浸漬する。少なくとももう一度繰り返す。
      注：3.2.3-3.2.6のステップは、Hisタグ付きタンパク質の精製を前提としています。他の方法で精製する場合は、それに応じてプロトコルを調整してください。
    5. 透析したタンパク質の280 nmでの吸光度を測定し、ビールの法則（ 吸光度単位=εL c 、ここで、 ε 吸光係数（M -1 cm -1）、ここで得ることができる54 ; Lは光路長（cm）である。 cはタンパク質濃度（M）である）。
      注：Bradfordアッセイおよびビシンコニン酸アッセイを含む様々なタンパク質定量アッセイが利用可能である。両方とも正確な結果を提供します。
  3. タンパク質ラベリング
    1. 1：1：8タンパク質：供与体：受容体のモル比で、供与体（マレイミド反応性シアン - グリーン色素）および受容体（マレイミド反応性遠赤色色素）フルオロフォアを精製タンパク質に加える。
    2. タンパク質とフルオロフォア混合物を氷上で30分間インキュベートする。より長いインキュベーション時間が可能である。
    3. タンパク質をインキュベートしている間に、0.5mLのNi-Nitrilotriacetic acid（Ni-NTA）アガロースカラム（材料リストを参照）をパックし、3.2.3と同じ平衡バッファーを使用して平衡化します。
      注：タンパク質結合量に応じて、タンパク質のロード量を保持してください。
    4. 30分後タンパク質/フルオロフォア混合物をステップ3.3.3で調製したカラムにロードし、重力流によって精製する。
    5. 過剰のフルオロフォアを5mLの平衡緩衝液で洗い流す。
    6. 0.5mLの溶出緩衝液でカラムから重力により標識タンパク質を4回溶出する。タンパク質はすでに他のタンパク質から精製されているため、勾配は必要ありません。
    7. それぞれの溶出液をUV-Vis分光計でチェックして、どの画分に標識タンパク質が含まれているかを確認します。 230-700 nmの吸光度をスキャンして、タンパク質（280 nm）と各蛍光体（シアン - 緑色蛍光体の場合は493 nm、遠赤色蛍光体の場合は651 nm）からの吸光度ピークが確実に確認できます。溶出液。
      注：通常、タンパク質は画分2で溶出します。
    8. 炭処理PBS（ステップ1.1）で脱塩カラム（ 材料表参照）を平衡化する 。
    9. 重力流によって脱塩カラムに標識タンパク質をロードする。
      注：選択した脱塩カラムの容量に従って、ロードされたタンパク質の量を維持してください。
    10. 3.5mLのチャコール処理したPBSを用いて重力流で溶出させ、溶出液の0.5mL画分を集める。
    11. UV-Vis分光計を使用して、230-700 nmの各溶出液の吸光度をスキャンし、どの画分に標識タンパク質が含まれているかを確認します。
      注：3.3.8-3.3.11のステップは、基本的にバッファ交換ステップとして機能します。この目的に役立つ他のプロトコル（ 例えば、広範な透析）も可能である。あるいは、ステップ3.3.2からステップ3.3.8に直接進むこともできる。

4.アンサンブル条件で必要な測定（キュベットで）

  1. フォルスター定数の決定
    1. フルネームを得るために、最大吸光度波長に15nmでドナーを励起することにより、フルオロメーターで蛍光体蛍光発光（cps）をスキャンする発行スペクトル。励起波長から5nm後に開始し、150nm後に終了する発光を監視する。発光偏光子を54.7°に設定してマジックアングル条件を使用する 励起偏光子は0°〜56°である。
      注：ここで使用した供与体フルオロフォアでは、Absの最大値は490 nmで発生します。励起波長として475nmを用い、480〜650nmの発光をモニターする。アクセプターの場合、Absの最大値は645 nmで発生します。 630nmを励起波長に用い、635〜735nmの発光をモニタする。
    2. 蛍光光度計を使用して、400-700nmの範囲のアクセプターフルオロフォア（Abs A ）の励起スキャンを行い、発光偏光子を54.7°に設定することによってマジックアングル条件を使用する 励起偏光子は0°〜56°である。最大発光波長の後に放射モノクロメータを15 nmに設定します。最大エキシに正規化するtation値。
    3. 公開されている表では、アクセプターの吸光係数εA（M -1 cm -1 ） 56を特定するか、製造元から提供された値を使用します。
      注：この原稿で使用されたアクセプターフルオロフォアについて発表された値はεA647 = 270,000 cm -1 M -1 56である。
    4. f D 、Abs A 、およびεAがλより上で定義され、波長（nm）である場合、J =ΣfD・（Abs A・εA）・λ4を使用してスペクトル重なりを計算する。ワークシートを使用して、ステップ4.1.1〜4.1.3で得られたすべての波長依存値を列に列挙する。波長に合わせて調整してください。ドナー放出の最小波長（λmin）からアクセプター吸収の最大波長までの合計を実行するe（ λmax ）。
    5. 次の式を使用してフォルスター定数（R o ）を計算する。ここで、Jは、ステップ4.1.4で前に計算されたスペクトルオーバーラップであり、R 0 = 8.79 x 10 -5・J・κ2・ΦF、 κ2 配向係数、ΦF 、D は供与体フルオロフォアの蛍光量子収率であり、nはフルオロフォアが位置する媒体の屈折率である。
      注記：n = 1.33（水性緩衝液が使用される場合）およびκ2 = 2/3を使用する。
    6. 供与体フルオロフォアの量子収率値（ΦF 、D 、 環境に依存しない）を使用し、ステップ4.1.4で得られたスペクトルオーバーラップの値を使用して、eqを使用してフォルスター定数の最終値を計算するステップ4.1.5からの説明。
      注：量子収量が利用できない場合は、下の手順4.2に従ってそれを計算します。この場合、ドナーの寿命τD 、r = 4.0 nsに対応するΦF 、D = 0.8を使用します。
  2. 蛍光量子収率の測定
    注記：以下の手順では、ダイナミッククエンチングのみを想定しています。しかし、PIE-MFD実験は静的消光の場合でも量子収率を決定する上で有用である（結果参照）。
    1. 量子収率（Φr）が決定された受容体および供与体フルオロフォアの両方について、同様の吸光度および発光プロファイルを有する参照フルオロフォアを選択する。
      注：ドナーについては、Φr = 0.8およびτr = 4nsであるが、アクセプタについては、Φr = 0.32およびτr = 1.17nsであり、 wそれぞれシアン - 緑色蛍光体 - および遠赤色 - フルオロフォア - 標識オリゴヌクレオチドのΦrおよびτrに対応する。
    2. マジック角条件で時間相関単一光子計数（TCSPC）法を用いて時間分解蛍光減衰（f（t））を測定する。
    3. f（t）=Σi x i e -t /τiの形式で、単数または複数の指数関数的減衰関数を用いて蛍光減衰を適合させる。ここで、x i は母集団分数であり、τi 集団蛍光寿命である。
    4. 種平均寿命を計算すると、<τ> x =Σxiτi、 ここで、x i は母集団分数であり、τi 集団蛍光寿命である。
    5. 使用するe式ΦF 、D = <τD> x *Φr /τr 参照の蛍光寿命および量子収率ならびに供与体フルオロフォアの蛍光寿命を差し込むことによって、供与体フルオロフォアの蛍光量子収率を計算する。
      注：このメソッドは、動的消光を想定しています。他のΦF 、Dの決定については、Lakowicz 56に従う。

5. PIE-MFD単分子検出（SMD）の実験アライメント

注：測定中はライトを消す方が良いです。

  1. 機器の調整（図1）
    注：この実験には、 図1に示すように、倒立顕微鏡本体に2つのパルスレーザーと4つの検出チャンネルを備えた自家製MFDセットアップが使用されています。同様の商用システムがあります。
    1. 485 nmおよび640 nmレーザーとMFD設定のすべての検出器をオンにします。 TCSPCの取得とレーザーを制御するソフトウェアを開きます。レーザーの繰り返し周波数が40 MHzであることを確認してください。
    2. 60X 1.2 NA水浸対物レンズの画像面で485 nmパルスレーザ出力を60μWに設定し、パルスインターリーブ励起モード（PIE-MFD） 42で 640 nmパルスレーザ出力を23μWに設定します。
      注：PIE-MFDを設定するには、2つのレーザーパルスがレーザーコントローラーソフトウェアで遅れます。 485 nmレーザー励起の場合、検出TCSPCチャネル（TACチャネル）は1〜12,499（「プロンプト」チャネル）です。 640nmレーザ励起では、検出TCSPCチャネル（TACチャネル）は12,499〜50,000（「遅延」チャネル）である。
    3. 顕微鏡対物レンズとカバーガラススライドの間に目的の液浸液（二重蒸留水滴）を加えます。像面が溶液の内側にあり、ガラスから遠くにあることを保証するためにサーファガラスと液体の界面でレーザーが反射して2番目の明るい焦点を見つけた後、調整ノブを1.5回転させます。
    4. 50μLの蒸留水に100μMのRhodamine 1101μLをカバーグラスの中央に添加する。解決策が顕微鏡対物レンズの中心にあることを確認します。
    5. 取得ソフトウェア上の光子計数率を監視しながら、検出された光子数を最大にするようにピンホール（サイズ：70μm）の位置（x方向およびy方向）を調整します。
  2. 標準測定SMD（暗室での作業）
    1. 収集ソフトウェアの "* .ht3"形式58でタイムタグ付き時間分解（TTTR）コントロールパネルの "Start"ボタンをクリックすることにより、ステップ5.1.4のサンプルを使用してカウントレートを120秒記録します。
    2. オフライン蛍光相関分光法（FCS）を計算する59 、拡散の特徴的な時間、共焦点体積中の分子の数、三重項状態の動力学および分子の明るさ62を決定するために、 60 / 61 （ すなわち、 FCS測定）
      1. FCS用のソフトウェアを開きます（Kristine、MFD suite）。 [オプション] - > [設定を選択]をクリックして実験設定を選択します。同様の実験設定のファイルを選択し、「ファイルからパラメータを取得」をクリックして、ファイルのヘッダー情報を読み取ります。
      2. FCSを実行するには、 "Operate" - > "Correlate"を選択します。
        注記：チャンネル番号が正しく指定されていることを確認し、 "TAC Gate"（TCSPCチャンネル）をチェックして、プロンプトまたはディレイチャンネルを選択してください。
      3. フィット・ルーチンを開くには、 "Operate" - > "Correlation Curveのグローバルフィット"を選択します。ソフトウォー "式＃24"を使用するeをクリックし、「開始」をクリックします。
        注記：ソフトウェアの等式＃24は、3次元ガウス照明プロファイル（例えば、 61 ：1）にわたって自由に拡散する蛍光分子の自己相関関数（ G c ）
        figure-protocol-1
        ここでNは検出体積中の分子の平均数であり、 x Tは特徴的時間t T 、 t cを有する三重項状態動力学を発揮する分子の割合であり、 t cは相関時間であり、 t diffは幾何学的パラメータω 、 ωはガウス照明プロファイルを表す。適合後、共焦点体積中の拡散時間と分子数に注意してください。
    3. 10μLの100nMローダミン101を50μLの蒸留した水とよく混ぜる。この混合物をカバーガラスの上に置き、液滴が対物レンズの中心にあることを確認します。 TTTRコントロールパネルの "スタート"ボタンをクリックして、TTTR形式のデータを120秒間記録します。
    4. 50μLの蒸留水に100μMの遠赤色蛍光色素を1μL加え、よく混合します。このミックスを対物レンズの中心に置きます。 "Start"ボタンをクリックし、TTTRフォーマットで120秒間のデータを記録します。
    5. 50μLの蒸留水を対物レンズの中央に置きます。 "Start"ボタンをクリックし、300秒のデータをTTTR形式で記録します。
    6. 対物レンズの中心に50μLのPBSバッファーを置きます。 "Start"ボタンをクリックし、300秒のデータをTTTR形式で記録します。
    7. ステップ5.1.4の混合物1μLを蒸留水50μLと混合する。この混合物をカバーガラスに置きます。まず、 "Start"ボタンをクリックし、TTTRモードで10秒分のデータを収集します。次に、TTを分析するステップ5.3で説明したように、Burst Integration Fluorescence Lifetime（BIFL）解析ソフトウェア（Paris、MFD suite）を使用して、TRモードファイルを解析します。
      注：バースト選択および解析ソフトウェア26,61から、1秒あたりのバースト数を確認します。バーストレベルが10秒ごとに約35である場合、これは単分子測定に適しています。
    8. 単一分子測定標準として扱うために、TTTRフォーマットで計数率を1.5時間（ すなわち、 SMDでのTCSPC）記録し続ける。
      注：ファイルサイズが大きいため、raw * ".ht3"ファイルをより小さなサイズのファイルに分割し、BIFLを使用してロードして処理します。
  3. BIFLを用いた標準試料の分析
    1. BIFLソフトウェア（パリ）を開きます。
    2. 「設定の確認」自動ポップアップウィンドウでPIEの設定を選択し、同様の実験設定のファイルを選択してヘッダーを読んでください。 「ここからパラメータを取得する」をクリック"OK"をクリックします。ポップアップウィンドウが閉じ、パリのフロントエンドに統合されていることに注意してください。 "次へ"の下の "OK"をクリックします。
    3. 分析する測定値を選択するには、 "Data Path Array"の "Select"をクリックして分析するファイルを選択します。
      1. 「グリーン散乱」（水分測定用）、「グリーンBG」（緩衝液測定用）、「グリーン厚」（2nMローダミン110測定用）、「赤色散乱」（水分測定用）赤色BG（バッファーまたは水の測定用）、赤色の厚さ（20nMローダミン101測定用）、黄色の散乱（水の測定用）、黄色BG（バッファー測定用） 「黄色い厚い」（2nM遠赤色フルオロフォア測定用）。
      2. 「次へ」の下の「OK」をクリックします。
        注：「緑色」チャネルは、「プロンプト」TCSPCチャネルの緑色検出器の信号に対応します。ザ4;赤色」チャネルは、「プロンプト」TCSCPチャネルにおける赤色検出器の信号に対応する。「黄色」チャネルは、遅延TCSPCチャネル内の赤色検出器の信号に対応する。
    4. 単一分子選択パラメータを調整するには、「データをバースト的に切断する」の横にある「調整」をクリックします。新しいポップアップウィンドウで、インターポトン到達時間を「しきい値」に変更し、1分子当たりの光子の最小数を「min」（最小値）に変更することにより、平均インターフォート到着時間（「dt」）から2標準偏差＃。 " [戻る]をクリックすると、ポップアップウィンドウが閉じます。 「次へ」の下の「OK」をクリックします。
      注：しきい値は、ms単位で、バックグラウンドカウント率によって異なります。使用される光子の典型的な最小数は60である。
    5. 生成のための初期蛍光寿命「カラーフィットパラメータ」（ 例えば 、from、to、およびconvolution）を調整する「緑」、「赤」、「黄」の各色の蛍光減衰パラメータが表示されます。同じウィンドウで、「プロンプト」と「遅延」の「開始」と「終了」の値を調整します。 [戻る]をクリックすると、ポップアップウィンドウが閉じます。 「次へ」の下の「OK」をクリックします。
      注：2色励起チェックボックスが選択されていることを確認してください。 「From」および「to」は、蛍光減衰ヒストグラム（TACチャンネル番号）の最初および最後のビンに対応する。初期当てはめパラメータが適切に選択されると、適合関数が各チャネルの蛍光減衰に加えられる。
    6. すべての処理されたASCIIファイルを親フォルダに保存するハードドライブ上の場所を選択します。
      注：パリはすべての選択されたバーストを処理し、視覚化のために他のプログラム（ 例えば、 Margarita MFD suite）で使用できるものよりも複数のascii出力ファイルを作成します。

6. dsDNA標準とサンプル測定尿素

  1. チャンバーカバーガラスに500μLのPBSバッファーを加え、チャンバーと対物レンズの間に1滴の蒸留水を入れます。コントロールペダルの "Start"ボタンをクリックし、分析に使用するTTTRモードで5分のデータを収集します。
  2. 少量（通常約0.1μL、約1μMの濃度）dsDNA標準液をとり、それをPBS緩衝液に加え、よく混合する。まず、「開始」をクリックして10秒のデータを収集します。その後、バーストをチェックして、10秒間に35バーストを取得します（ステップ5.2.7および5.3と同様）。最後に、上記のように、TTTR形式のデータを> 2時間以上収集する。
  3. ステップ5.3.3のように、dsDNAサンプルの収集データを分析する。
  4. MFD suite（Margarita）を用いてバーストヒストグラムを視覚化し、FRET効率対<τD （A） > fまたはF D / F A対<τD （A） > fを表示する 。
    1. オープンt彼はマルガリータソフトウェアを選択し、 "ファイル" - > "すべてをインポートする*。?? 4と* .mtiファイル。さまざまなサブフォルダを含む親フォルダを選択します。
    2. 視覚化するパラメータを選択するには、パリから派生したパラメータの1つ（ 例えば、タウグリーンまたは<τD （A） > f ）の「X」（横軸）の横にあるをクリックします。同様に、視覚化するための所望のパラメータ（ 例えば、 FRET効率、F D / F A 、またはS PIE PIE）を選択するために、これを縦座標 "Y"に対して繰り返す。
      注：この場合、FRET効率、F D / F A 、またはS PIEは、緑色、赤色、および黄色のチャネルにおける適切なバックグラウンド計数率を補正します。ドナーとアクセプターの量子収率については、検出効率比（g G / g R ）については、クロストーク（α）のために使用される。ここでは、g G / g R = 3.7、α= 0.017であり、機器のみに依存する。バックグラウンドカウント率使用されるバッファーに依存し、量子収率値は予め決定される。
    3. "Display" - > "Overlay Equation"をクリックして、 "Overlay Equation"ウィンドウを開いてFRETラインを追加します。ポップアップメニューから静的FRET行を選択します。適切なドナーの寿命と量子収率のパラメータを選択して、適切なFRETラインを生成します。
      注：様々なFRETインジケータを関連付けるためのFRETラインを生成することができます。
  5. マルガリータにおけるFRET効率対化学量論比（S PIE ）を表示することにより、化学量論パラメータを用いてドナー励起源（β）によるアクセプタ励起の補正係数を決定する（下記の式1）。
    注記：βは、ドナー試料が化学量論スケールでS PIE = 1.0にピークを有するように選択される。アクセプターのみのサンプルはS PIE = 0.0の化学量論を有するべきであり、両方のラベルを有するdsDNAはS PIE〜0.5の化学量論を有さなければならない。br />注：装置はすぐに準備ができており、FRET標識サンプルを測定することができます。
  6. 6.3-6.4の手順に従って、セクション3で調製したFRET標識サンプルを測定し、分析する。

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結果

MFDセットアップ（レーザーライン：60μWで485nm、23μWで640nm、セクション5.1）を用いた典型的なsmFRET実験では、蛍光サンプルを低ピコモル濃度（10 -12 M = 1pM）に希釈し、サブナノ秒のレーザーパルスが励起分子を介して自由に拡散する標識分子を励起する共焦点顕微鏡で行う。典型的な共焦点体積は<4フェムトリットル（fL）である。このような低濃度では、一度に一つの分子しか検出されない。標識された分子から放出された蛍光は、対物レンズを通して集められ、ピンホールを用いて空間的に濾過される。このステップは、有効な共焦点検出ボリュームを規定する。次に、信号は、2つ（またはそれ以上）の異なるスペクトルウインドウ（ 例えば、 「緑」および「赤」）で平行および垂直成分に分割される。各光子検出器チャネルは、次に、時間相関単一光子計数（TCSPC）電子機器のデータ登録（ 図1 ）。

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ディスカッション

この研究では、PIE-MFD単分子FRET実験を使用して、高精度で粒子間距離を整列させ、較正し、測定するプロトコルが提示されている。すべての機器パラメータを慎重に較正することにより、測定距離の精度を高め、オングストロームの精度に達することができます。これを行うために、様々な多次元ヒストグラムを用いて、さらなる特徴付けのために集団を分析および同定する。測定されたサンプルの安定性を検証するために平均マクロ時間を使用して、供与体および受容体の光退色を補正し、化学量論的パラメータに基づいてFRET集団を選択することが可能である。しかしながら、受容体の光物理的特性は、標識の位置に応じて変化し得る。したがって、アクセプタ量子収率を適切に補正するために、 S PIE分布を使用することができる。ガンマ因子（χ）を決定するには、適切な光物理的特徴付けが必要であり、それは、他の補正事実（ 例えば、クロストークの場合は α、ドナーレーザーを用いたアクセプタ励起の場合はβ）を使用して、測定された眼間距離の精度を高めることができる。このアプローチは、2つの設計されたdsDNA標準試料を使...

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開示事項

すべての著者は、この記事の内容と競合する金銭的利益がないと宣言しています。

謝辞

VJとHSは、NIH R01 GM094246からVJへのサポートを承認します。 HSは、クレムソン大学創造的調査プログラムとクレムソン大学の光学材料科学技術技術センターからスタートアップ資金を受け取ります。このプロジェクトは、ガルフコーストコンソーシアムの学際的なバイオサイエンストレーニングのためのケックセンター（NIGMS助成金番号1 T32GM089657-05）と一般ヒト疾患の翻訳研究のためのシスラー基金研究奨学金によっても支援されました。内容は著者の責任であり、必ずしも国立衛生研究所の公式見解を表すものではありません。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
炭メルクKGaAK42964486 320
シリンジフィルターフィッシャーブランド09-719Cサイズ:0.20&マイクロ;m
チャンバーカバーガラスフィッシャーサイエンティフィック1554091.5ホウケイ酸ガラス、8ウェル
顕微鏡カバーガラスフィッシャーサイエンティフィック063014-9サイズ:24 x 60-1.5
ヌクレアーゼフリー水フィッシャーサイエンティフィック148859ヌクレアーゼ
フリーtween-20Thermo Scientific28320ポリソルベート20
アクセプターDNA鎖の10%溶液(高FRET)統合DNAテクノロジー1781248955´-d(CGG CCT ATT TCG GAG TTG TAA ACA GAG AT(Cy5)C GCC TTA AAC GTT CGC CTA GAC TAG TCC AAG TAT TGC)
アクセプターDNA鎖(低FRET)統合DNAテクノロジーズ 1779564245´-d(CGG CCT ATT TCG GAG TTG TAA ACA GAG ATC GCC TT(Cy5)A AAC GTT CGC CTA GAC TAG TCC AAG TAT TGC)ド
ナーDNA鎖DNAテクノロジー1779514375´ -d(GCA ATA CTT GGA CTA GTC TAG GCG AAC GTT TAA GGC GAT CTC TGT TT(Alexa488)A CAA CTC CGA AAT AGG CCG)DNA
鎖(FRETなし)Integrated DNA Technologies5´ -d(CGG CCT ATT TCG GAG TTG TAA ACA GAG ATC GCC TTA AAC GTT CGC CTA GAC TAG TCC AAG TAT TGC)
サーマルサイクラーエッペンドルフE6331000025ネクサスグラディエント
アレクサフロー488 C5 MaleimideThermo ScientificA10254
Alexa Fluor 647 C2 
Rhodamine 110Sigma-Aldrich83695-250MG
Rhodamine 101Sigma-Aldrich83694-500MG
LB Broth, MillerFisher ScientificBP1426for culture of E. coli
AmpicillinSigma-AldrichA0166100 & マイクロで使用。プラスミド選択を維持するための選択的LB培地中のg/mL最終濃度
Tetracyline Calbiochem5834612.5 µ で使用。ジスルフィド結合酸化を促進するためのOrigami B(DE3)株のゴア(フルタチオンレダクターゼ)変異を維持するための選択的LB培地中のg / mL最終濃度
マイシンフィッシャーサイエンティフィックBP906-515およびマイクロで使用。ジスルフィド結合酸化を促進するためのB(DE3)染色中のtrxB(rhioredoxinレダクターゼ)変異を維持するための選択的LB培地中のg/mL最終濃度
Origami B(DE3)コンピテントセルミリポア70837-3ジスルフィド架橋を持つタンパク質の発現のためのコンピテントE.大腸菌細胞
イソプロピル-&β;-D-チオガラクトピラノシド(IPTG)Fisher ScientificBP1755For induction of E. coli expression
HiTrap Chelating HPGE Life Sciences17-0409-01Hisタグ付きタンパク質の大規模FPLC精製用
イミダゾールSigma-Aldrich56749
Ni-NTA Agarose Qiagen30210
PD-10 脱塩カラムGE Life Sciences17-0851-01
AktaPurifierGE Life Sciences28406264FPLC 機器
透析チューブスペクトラムラボ13256215 kD MWCO 24 mm フラット幅、10メートル/ロール
ダイクロイクスSemrockFF500/646-Di01-25x36500/646 BrightLight
50/50ビームスプリッター偏光子Qioptiq Linos G33 5743 00010 x 10 フィルム偏光子
グリーンパスフィルターChromaET525/50mET525/50m 直径 25 mm マウント
レッドパスフィルターChroma ET720/150mET720/150m 直径 25 mm マウント
パワーメーターThorLabdPM200
UV-Vis 分光光度計VarianCary300Bio
Fluorolog 3 蛍光光度計堀場FL3-22-R3
Fluorohub TCSPCコントローラー堀場製作所Fluorohub-Bアンサンブル測定用TCSPCエレクトロニクス
NanoLED 485L堀場製作所485L青色ダイオードレーザー
NanoLED 635L堀場製作所635L赤色ダイオードレーザー
オリンパスIX73 顕微鏡オリンパスIX73P2F顕微鏡フレーム
PMA 40 ハイブリッド検出器PicoQuant GmbH932200, PMA 40緑色検出に最適化
PMA 50 ハイブリッド検出器PicoQuant GmbH932201, PMA 50ed シフター感度に最適化
485 nm レーザーPicoQuant GmbHLDH-D-C-485
640 nm レーザーPicoQuant GmbHLDH-D-C-640
Hydraharp 400 および TTTR 取得ソフトウェアPicoQuant930021ピコ秒イベントタイマーと時間相関シングルフォトンカウティングユニットには、TTTR取得ソフトウェア
SEPIA II SLM 828とピSEPIAソフトウェアPicoQuant910028レーザードライバーが含まれ、SEPIAソフトウェアコントローラーが含まれています。
コンピュータDelloptiplex 7010CPU:i7-3770 RAM:16GB
FRETポジショニングおよびスクリーニング(FPS)ソフトウェアHeinrich Heine UnviersityMFDスイートで利用可能なAccesibel Volume clacualtorが含まれています
インリッヒ・ハイネ http://www.mpc.hhu.de/software/fps.html Univiesityこれには、BIFLソフトウェアパッケージParisが含まれています。マルチパラメータヒソトラムの視覚化のためのマルガリータ、および確率分布分析ソフトウェアが利用可能で http://www.mpc.hhu.de/software/software-package.html
ズは、カナコ秒パルス用の ハ

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