光シートベースの蛍光生活の顕微鏡または固定し、染色モドキTribolium castaneum胚

サマリー

光シートベースの蛍光顕微鏡による昆虫の胚の形態形成を撮像する技術の状態となっています。このプロトコルは、輪郭とモドキTribolium castaneumの胚に適した3つの取り付け技術を比較し、ライブイメージングに適して2つの新規のカスタムメイドのトランスジェニック系統を導入し、本質的な品質管理を説明し、現在の実験の限界を示しています。

要約

コクヌストモドキTriboliumののcastaneumは、発生遺伝学と進化の発生生物学における重要な昆虫モデル生物となっています。光シートベースの蛍光顕微鏡とモドキTribolium胚の観察は、従来の広視野および共焦点蛍光顕微鏡を介して複数の利点を有します。光シートベース顕微鏡のユニークな特性のために、生きた標本の3次元画像は、高信号対雑音比で記録することができ、大幅にいくつかの持続期間にわたって光退色ならびに複数の方向に沿って光毒性を減少させ日々。以上の4方法論開発の年とデータの継続的な増加に伴い、時間がモドキTriboliumコミュニティでだけでなく、大規模で昆虫コミュニティに光シートの技術の利用のための標準的な操作手順を確立することが適切と思われます。このプロトコルは、適切なF 3つの取り付け技術を説明しますまたは異なる目的、長期的なライブイメージングに適した2つの新規カスタムメイドトランスジェニックモドキTriboliumラインを提示し、固定胚の細胞内構造を標識するのに5つの蛍光色素を示唆して記録されたデータのタイムリーな評価のためのデータの後処理についての情報を提供します。代表的な結果は、長期ライブイメージング、光学セクショニングおよび複数の方向に沿って同じ胚の観察に集中します。それぞれのデータセットは、ダウンロード資源として提供されています。最後に、プロトコルは、ライブイメージングアッセイ、電流制限および他の昆虫種に概説した手順を適用するための品質管理について説明します。

このプロトコルは、主に標準的な実験設備をアウトパフォームイメージングソリューションを模索発達生物学者を対象としています。これは、開発し、ミクロスを絞り込む技術志向の研究室/コミュニティ間のギャップを埋めるために継続的な試みを促進します方法論的にコピーして、技術的な課題への「プラグ・アンド・プレイのソリューションを必要とする生命科学研究所/コミュニティ。さらに、それは注目の的に生物学的な質問を移動公理的アプローチをサポートしています。

概要

darklingのカブトムシ（ゴミムシダマシ科）の大ファミリーに属するコクヌストモドキTriboliumののcastaneumは 、農業と生命科学の中に長い歴史を持っており、果実はキイロショウジョウバエを飛ぶした後、第2最高の研究のモデル昆虫モデル生物です。最後の四十年の間に、それは、様々な理由のための胚の形態形成に、過去20年の間に、進化の発生生物学では、発生遺伝学における強力かつ人気のある昆虫のモデル生物になったと：

ショウジョウバエとモドキTribolium両方がHolometabolaに属しているが、約300万年前に^{1、2、3、4}分岐しました。 ショウジョウバエの胚発生は、一般に、高度に誘導されたとみなされているが、 モドキTriboliumは develのより祖先モードを示します昆虫種^{5、6、7、8、9}のかなり大きい割合で発見されるopment。その口器とアンテナは胚^{10、11、12、13、14、15}の間に既に出現すなわちまず、 モドキTriboliumは 、非インボリュートヘッドの開発を示します。第二に、 モドキTriboliumが短生殖発達の原理に従う、 すなわち、腹部のセグメントがgermband伸び^{16、17、18、19}の間に後部成長ゾーンから連続的に添加されます。第三に、 モドキTriboliumが開発し、後に劣化します2胚体外膜は唯一の腹側に胚をカバー羊膜、および完全に^20、21、22胚を包む漿膜を、 すなわち 。両方の膜は、非常に重要な形態形成²³と同様に、微生物^24、25、乾燥²⁶に対して保護的な役割を果たしています。第四に、胎生開発脚は幼虫のライフステージの間に完全に機能していると蛹変態^{27、28、29、30、31}時の大人の足のための原基としての役割を果たす。

それらの小さなサイズと控えめな要求に、研究室でモドキTriboliumの栽培は非常に簡単です。野生型の培養物（WT）株またはトランスジェニック系統は、典型的には約100~300成人から成り、フルグレイン小麦から成る増殖培地で3〜4センチ高い（約50g充填した1リットルのガラス瓶（フットプリント80センチメートル^2））内に維持することができます小麦粉は非アクティブ乾燥酵母を補いました。水の供給は不要です。これは、小規模または中規模の市販の昆虫インキュベーター内甲虫培養物の多数を維持するために小さな研究所を可能にします。 モドキTriboliumの後の発生段階（幼虫後約第四齢、蛹及び成虫）を容易にふるい分けすることにより成長培地から分離されます。同期胚は産卵中に短い期間の成人をインキュベートすることによって得られます。在庫管理は、典型的には22〜25°C（世代あたり約10週間）で行っている間に急速な発展のために、甲虫の培養物を、32°C（世代あたり約4週間）に保たれています。

最後の10年以内に、多くの標準テック新興モデル生物ブック³²にまとめたようhniquesは徐々に、 モドキTriboliumに適応され、最適化されています。非常に重要で、このような胚^33、幼虫^34、35または親^36、37 RNA干渉に基づく遺伝子ノックダウン、 のpiggyBac ^38、39又はミノス ⁴⁰トランスポザーゼシステムおよびCRISPR / Cas9ベースゲノムのいずれかと生殖細胞系変換などの高度な遺伝学的方法でありますエンジニアリング^41。また、 モドキTriboliumゲノムは^、42十年ほど前に配列決定されており、効率的かつゲノムワイドな同定及び遺伝子⁴⁴の系統的な分析を可能にするゲノムの第三ラウンドアセンブリ^43を解放^し 、中でありますまたは他の遺伝的要素^45、46。また、他の4つの鞘翅目の種のゲノムは、比較遺伝的アプローチ^{47、48、49、50}のために用意されています。配列決定ゲノムとの関連では、二つの大規模な遺伝子分析は、挿入突然変異誘発画面^51、画面^52、53をノックダウン系統的RNA干渉ベースの遺伝子、すなわち 、実行されています。

広視野共焦点または光シートベース顕微鏡（LSFM）と蛍光ライブイメージングは、多次元コンテキスト（ 表1）に（ すなわち、形態形成）時間の関数としてモドキTriboliumの胚の形態を観察することができます。広視野と共焦点蛍光顕微鏡では、excitエーション発光光が同じ対物レンズを介して導かれます。両方のアプローチにおいて、試料全体がすべて記録された2次元平面のために照射されます。したがって、試料は、非常に高いエネルギーレベルに供されます。 LSFMにおいて、焦点面における唯一のフルオロフォアは、2枚の垂直に配置された対物レンズ（ 図1）を用いて照明および検出の分離に励起されます。単一平面照明顕微鏡（SPIM）とデジタル走査されたレーザ光のシートベースの蛍光顕微鏡（DSLM、 図2） - - LSFMは、二つのカノン実装で来て、従来のアプローチに比べていくつかの重要な利点を提供する：（I）固有の光学セクショニング能力（ii）は、良好な距離分解能、（iii）の光退色を強く減少したレベル、（IV）、非常に低い光毒性、（V）高い信号対雑音比、（VI）、比較的高い取得速度、（VII）イメージング複数の方向および（vi沿って低い開口数の照明対物レンズ^54、55、56の使用へII）より深い組織浸透。

LSFMはすでに正常ほぼ全胚の形態形成^57を文書化すると背側の閉鎖²³の先頭に胚体外膜の破裂の原則を分析するためモドキTriboliumに適用されています。一般的にモドキTriboliumコミュニティで昆虫科学のためLSFMの魅力を高めるために、それは標準的な操作手順を確立し、方法、プロトコルおよび顕微鏡は、使いやすさのとなりのレベルにリソースのプールを改善するために非常に重要です発生生物学研究所での標準的なツールを-use、および生物学的な質問は注目の的に滞在。

このプロトコルはモドキTriboliumの基礎から始まります</ em>の栽培、 すなわちメンテナンス、生殖および胚のコレクション。次に、2つの実験戦略が示されている：（I）カスタムメイドのトランスジェニック系統のライブイメージングおよび蛍光色素（ 表2）を用いて染色した固定された胚の（ii）のイメージング。その後、わずかに異なる目的を持つ3つの取り付け技術は、（ 図3および表3）について詳細に説明する：（I）アガロースカラム、（ii）のアガロース半球および（iii）新規クモの巣ホルダ。プロトコルは、LSFMとデータ取得手順を説明します。イメージングモダリティとキーの考慮事項が概説されています。最後に、胚の検索について説明すると、基本的なデータ処理のための提案が提供されます。代表的な結果で、よりライブイメージングデータを2つの新規カスタムメイドおよびグリアブルー^58個のトランスジェニック系が示されており、それぞれの撮像データセットをダウンロード可能なリソースとして提供されます。また、画像蛍光色素の様々な染色された固定胚のデータが提示されています。議論は、品質管理、ライブイメージングアプローチの現在の制限および他の種へのプロトコルの適応に焦点を当てています。

プロトコルは、試料室及び典型的には、直径を有する金属、プラスチックまたはガラス製の円筒状の要素である標準化された試料ホルダ^{54、59、60、}のための回転可能なクランプ機構が装備されている光シートベースの蛍光顕微鏡用に書かれていますミリの範囲です。プロトコルはまた、両方のカノン実装、 すなわち SPIMとDSLM、ならびに二つ以上の照明および検出腕^61、62、63とのセットアップのために適しています。代表的な結果は、2つのスペクトル・チャネルのデータを示し、緑色（IL488nmレーザー、50分の525バンドパスフィルタを介して検出）および561 nmレーザーと赤色（照明、70分の607バンドパスフィルタを介して検出）を有する部分の光量が、プロトコルは、3つのまたは4つのスペクトル・チャネルに拡張することができます。

プロトコル

1.畜産モドキTriboliumの文化

注：標準的な条件は、25℃のインキュベーション温度、12時間明/ 12時間暗サイクルにおける相対湿度70％として定義されます。 モドキTriboliumの飼育についての詳細は、それぞれのガイドラインは⁶⁴利用可能です。このプロトコルは、キログラムの量で調製し、数ヶ月間保存することができる2つの異なる粉ベースのメディアを必要とします。

1. 小麦粉と非アクティブ乾燥酵母での作業に先立ち、24時間、-20℃で未開封のパッケージを格納し、それらを室温まで加温してみましょう。この手順は、潜在的な病原体を排除します。
2. 不活性な乾燥酵母を選別（w / w）の5％で選別フルグレイン粉を補うことにより、増殖培地を調製し、710μmのメッシュサイズを有するふるいを通して完全粒小麦粉および不活性乾燥酵母を渡します。
3. 250＆＃でふるいを405細かい小麦粉と不活性乾燥酵母を渡します181; Mのメッシュサイズは、次いで、不活性な乾燥酵母を選別（w / w）の5％選別405細かい小麦粉を補うことによって産卵培地を調製します。
4. 介して各モドキTribolium文化を渡します とふるい 800μmのメッシュサイズ。残りの増殖培地を捨てます。大きなガラス皿に幼虫、蛹および成人を転送します。
5. 何の子孫の文化が存在しない場合は、新しい子孫の文化を確立するために、新たなガラス瓶に約80幼虫および/または蛹を転送します。何の幼虫および/または蛹が存在しない場合は、代わりに約40の大人を取ります。成長培地の50グラムを追加し、標準的な条件下でインキュベートします。
6. 撮像培養を確立するために、別の新しいガラス瓶に約300の大人（500~700 mg）を集めます。成長培地の50グラムを追加し、標準的な条件下でインキュベートします。撮像培養は、胚の回収前に新鮮な増殖培地中で少なくとも24時間沈降することを可能にします。
7. 映像文化の成長培地を交換し、少なくとも2つずつたち胚のコレクションと一緒に行うことができますEKS、（3.2を参照）。 2〜3ヶ月後、子孫の文化からの新成人によって完全に映像文化を交換してください。
8. 非ホモ接合トランスジェニックラインを使用する場合は、非トランスジェニック動物を除去することにより、頻繁に子孫の文化をキュレート。各導入遺伝子は致命的ではない場合、または両方の染色体上に存在する無菌性を引き起こす場合、理想的には、ホモ接合線を生成します。ホモ接合性培養物は、典型的には、より高い平均蛍光レベルを有しており、唯一の遺伝子型が存在するので、全体的な実験条件は、狭いです。

2.顕微鏡のセットアップとキャリブレーション

注： モドキTribolium胚を約600から660ミクロンの前後の長さは約300から330ミクロンの横方向の直径を有しています。最も近代的なCCDカメラは、約9ミリメートル×7ミリメートルのセンサーチップサイズを有する11.4ミクロンの直径、及び6.45ミクロンの画素の画素距離、すなわち 。倍率10倍の対物レンズと組み合わせた場合、胚は0.645ミクロンの画素ピッチとTOTOに撮像することができます。最も近代的なsCMOSカメラは21.3ミクロンの直径、すなわち約16ミリメートル×14mmの大きいセンサチップサイズ、および6.5ミクロンのピクセルのピクセル距離を有します。 20X倍率対物レンズと組み合わせた場合、胚は0.325ミクロンの画素ピッチとTOTOに撮像することができます。

1. 顕微鏡照明および検出対物レンズを取り付けます。レーザーと蛍光フィルターは非常によく、フルオロフォアの吸収および発光スペクトルと一致していることを確認してください。
2. 顕微鏡にサンプルチャンバを取り付けます。 PBS pH7.4のまたは任意の他の適切な画像化緩衝液と試料室を充填します。
3. 上のスイッチや顕微鏡を校正。特注の光シートベースの顕微鏡（より具体的にDSLM実装のため）のための包括的校正ルーチンおよびトラブルシューティングのガイドラインは、PRを公表されていますeviously ^65。商用デバイスの場合、非常に慎重に、製造元の指示に従ってください。媒体の試料室を枯渇や楽器だけでなく、試料に大混乱を引き起こす可能性があります誤操作。

トランスジェニックまたはWT胚の3コレクション

1. 800μmのメッシュサイズの篩を通してイメージングコロニーを渡します。新しいガラス瓶に大人のカブトムシを収集し、産卵中の10グラムを追加します。光の中で25℃、70％相対湿度で1時間産卵培養物をインキュベートします。
2. 周り30~100胚を含有産卵媒体から大人を分離するために800μmのメッシュサイズを有するふるいを通して産卵培養を渡します。新しいガラスボトルに大人を転送し、新鮮な増殖培地の古いまたは50グラムのいずれかを追加します。
3. 観察は、均一な胚盤葉期（例えば、データセットDS0002）で開始する必要がある場合、25℃及び70％相対湿度で15時間産卵培地をインキュベートします。 TO germband後退（例えばデータセットのDS0001とDS0003）の先頭から開始、32℃及び70％相対湿度で23時間の胚をインキュベートします。他の発達段階が所望される場合、各文献^64、65を参照し、必要に応じて、インキュベーション時間及び/又は温度を適応させます。

4.胚Dechorionation

注：絨毛膜が卵殻の外側の層であり、タンパク質および多糖類から成ります。これは、吸収性を強く光が、適切な開発のためにではないが不可欠であるため、化学的に除去することができます。

1. 300μmのメッシュサイズの篩を通して産卵メディアを渡します。 100μmのメッシュサイズのセルストレーナーで胚を収集し、残りの産卵培地を廃棄します。
2. 以下のように6ウェルプレートを調製：10mLのPBS pHが7.4と9mLのPBSとB1とB2のウェルとA1、A2、A3とB3井戸を埋めます。その後、慎重に追加B1とB2に1 mLの次亜塩素酸ナトリウム。ステップ実体顕微鏡下で、4.8から4.3までの進捗状況を確認します。注意次亜塩素酸ナトリウムは腐食性があります。
3. ウェルA1にセルストレーナーを挿入（PBS pH7.4）で、穏やかに撹拌しながら1分間の胚を洗浄します。大きな小麦粉の粒子は、胚から切り離す必要があります。
4. B1ウェル（PBS pH7.4中の次亜塩素酸ナトリウム）にセルストレーナーを移し、30秒間激しくプレートを振ります。残りの小麦粉粒子は、胚から完全に切り離すべきです。
5. ウェルA2（PBS pH7.4）中にセルストレーナーを移し、穏やかに撹拌しながら1分間胚を洗浄します。
6. dechorionationため、B2ウェル（PBS pH7.4の中に次亜塩素酸ナトリウム）にセルストレーナーを転送します。絨毛膜が破裂するまで激しくプレートを振ると、胚から切り離されます。 dechorionated胚は普通シルエットを有するが絨毛膜は、裂傷エッジを有する薄い、半透明膜のように見えます。
7. 転送番目ウェルA3に電子セルストレーナー（PBS pH7.4）で、穏やかに撹拌しながら1分間胚を洗浄します。任意の絨毛膜断片はまだ洗濯後の胚に接続されている場合は、ステップ4.6を繰り返します。
8. B3ウェル（PBS液pH7.4）で胚を格納します。数時間の記憶は、胚を傷つけるが、開発が続いていることを心に留めておくことはありません。
9. 可能であれば非ホモ接合トランスジェニック系統については、いずれかの非蛍光胚を削除します。 WTまたはトランスジェニック胚の固定および染色のために、ステップ6に進み、トランスジェニック胚のライブイメージングのためにステップ5に進みます。

5.卵黄膜透過処理、固定、染色

注：卵黄膜は、卵殻の内側の層です。これは、蛍光色素のために不浸透性であるため、化学的に染色前に透過処理する必要があります。

1. 固定/透過化溶液（1.5mLの4％（PBSのpHは6.9でw / v）のパラホルムアルデヒドとのシンチレーションバイアルを充填ND 1.5mLのn-ヘプタン）。バイアルに絵筆で、胚を転送します。アルミホイルでカバーバイアルを光からフルオロフォアを保護し、毎分50の回転で揺動プラットフォーム上で30分間インキュベートします。注意パラホルムアルデヒドは、毒性及び腐食性、n-ヘプタンは、可燃性及び毒性です。
2. 固定液を除去し、胚を3mlに15分間3回、0.1％（v / v）のトリトンX-100を治療PBS pHを7.4にし、続いて一回15分間、3 mL中に1％（v / v）のトリトンX-100で毎分50の回転で、ロッキングプラットフォーム上でPBSのpHは7.4。注意トリトンX-100は、腐食性です。
3. 透過処理溶液を除去し、バイアルに0.5mLの染色溶液を加えます。例示的な染色溶液は、 表2に提供されます。毎分50の回転でロッキングプラットフォーム上で4℃で一晩ステイン胚。 表2で提案されている染料のため、洗浄が不要です。

アガロース実装6の調製

1. 1グラムの低溶融を追加アガロースを100mLのPBS pH7.4中及び小アガロース粒子が依然として存在する場合、粒子が完全に溶解するまで30秒間隔で加熱処理を繰り返し、800 W.におけるマイクロ波オーブン中で2~3分間混合物を加熱します。上記のように装着アガロースが固化したアガロースは、加熱により再液化することができ、新たに毎回を用意する必要がありません。あまりにも多くの水が蒸発する前に、このプロセスは、5~6回繰り返すことができます。
2. 加熱アガロースで2本の1.5mLの反応管に充填し、サーモ中35℃で、これらのチューブを保持し、アガロースは、約40〜45℃まで冷却することを可能にします。

7.胚試料室に取り付け及び挿入

1. オプション1：アガロースカラム（ 図3A〜Cは、まずカラム;表3、第二カラム）
   1. 蒸留水で1.0 mLシリンジを記入し、小さなゴム製のホースを用いてガラスキャピラリー開口部の1に取り付けます。蒸留水でキャピラリー途中まで記入してください。
   2. 絵筆で胚を選択し、他のガラスキャピラリー開口部の内側に配置します。胚が乾燥する前に次のステップに迅速に進みます。
   3. 液体アガロースに毛細血管を固執し、ゆっくりとキャピラリーに胚と一緒に液体アガロースの数μLを描きます。その後すぐに胚をアガロースと一緒に引きずられるように描画力を高めます。最後に、アガロースの数μLは、胚の上方および下方であるべきです。数分間わき毛細血管を設定し、アガロースが固化しましょう。
   4. 約5mmの長さにダイヤモンドガラスカッターでキャピラリーを短くしてください。残りの断片は、完全にアガロースで充填されるべきであり、胚は、第四分位内でなければなりません。
   5. 試料室にピンと鋼製シリンダーを挿入し、ピンの上にキャピラリ断片スティック。アガロースカラムには、数ミリメートルFを突出すべきです胚が含まれている部分と毛細血管の断片をROM。
2. オプション2：アガロース半球（ 図3A〜C、第二カラム;表3、第3列）
   1. 底部開口部に半球が形成されるまでアガロースで上から鋼管を埋めるためにそれを使用し、その後、1.0 mLシリンジに液体アガロースの200μLを描きます。半球の直径はパイプの直径に等しくなければなりません。アガロースが固化するまで数分待ちます。
   2. 絵筆で、胚を選択し、前端がアクセス可能となるようにブラシの先端の上に再配置します。薄膜でそれをカバーするために、液体アガロースにアガロース半球を浸し。
   3. 直立アガロース半球のポールの上にその前端との胚を置きます。周りのスチールパイプを回してブラシで胚の位置を修正します。必要に応じて、胚/半球の境界にアガロース2μLを添加することによって胚を安定化させます。理想的LY、胚の表面の半分以下は、アガロースで覆われるべきであり、側面は、できるだけ急峻であるべきです。
   4. ゆっくりと試料室に半球と胚との鋼管を挿入します。
3. オプション3：蜘蛛の巣ホルダー（ 図3A〜C、3列目;表3、第4列）
   1. 絵筆を持つ胚を選んで、脇に置きます。
   2. 、5-8μL液体アガロースでクモの巣ホルダの長穴を覆うだけ薄いアガロース膜が残るまでアガロースの大部分を除去。
   3. アガロースフィルム上に胚を置き、その位置を調整します。注意深く長穴のx軸中心に胚を移動し、長穴の長軸と、その細長い前後軸を整列させます。
   4. ゆっくりと試料室に取り付けられた胚とクモの巣ホルダーを挿入します。それは励起と発光と干渉しないようにクモの巣ホルダーを置き光、 すなわち、45°X軸とZ軸に対して。

8.光学シートベースの蛍光顕微鏡

1. 胚を撮影する必要がありますどのように多くの方向（および沿って方向）に沿って決定します。 （方向に沿って0°、90°、180°、270°）の四方は、典型的には、カバレッジとエネルギー負荷との間の良好なトレードオフを提供します。
2. 蛍光チャネル数を設定します。各チャネルのための主要なパラメータは、レーザー線、蛍光フィルタ、レーザパワーと露光時間です。長期的なライブイメージングのために、統合されたエネルギー負荷が胚の許容値を超えないことが重要です。 μW100〜300のレーザパワーが胚の生存率に影響を与えるべきではないながら、25~50ミリ秒の露光時間は、高速撮像を保証します。固定された試料について、露光時間及びレーザパワーは、少なくとも倍にすることができます。
3. ライブイメージングアッセイのために、時間の経過を設定します。コンプモドキTriboliumのLETEの胚発生は32-35°C ⁶⁴で室温（23±1℃）で約7日間と少し未満3日かかります。観察されるべき形態形成のイベントに応じた時間間隔を定義します。短い時間的間隔については、露光時間及びレーザパワーを（8.2を参照）を下げることを検討してください。
4. レーザーに曝すことなく、視野の中心にx軸及びy軸に沿って透過光モードで胚を置き。実装工程中に発生している可能性がいかなる損害について胚を検査するために90°ステップで360°で胚を回転させます。
5. 顕微鏡は、z軸と背腹軸、すなわち 、例えば、X軸と横軸を軸と胚軸を整列させるために、y軸の周りに適切に胚を回転させます。蜘蛛の巣ホルダー技術を使用している場合、アライメントができない場合があります。
6. 蛍光モードでは、FO Zスタックを定義します各方向Rとなります。目の前の空間バッファとして胚の後ろに25〜50ミクロンを追加します。バッファを含む、典型的なZスタックはモドキTribolium胚の周り350-400ミクロンをカバーします。また、4倍の横方向の間隔であるべきであるZ-間隔を定義するx軸に沿って間隔をIEと^66を Y軸。
7. 二つ以上の胚が並行して画像化されている場合は、次の胚と8.4で再起動してください。
8. 長期イメージングのために、サンプルチャンバが十分なPBS pH7.4のまたは他の画像化緩衝液で満たされていることを確認。また、試料室の開口部を覆います。
9. イメージング処理を開始します。長期的なライブイメージングのために、すべての胚のために、すべてのチャネルですべての方向に沿って正しい取得を監視します。時折胚が生きているし、適切な位置にあることを、次の日の間にご確認ください。

9.胚の検索と品質管理

1. イメージングが完了したら、と試料ホルダーを削除試料室からの胚。ライブイメージングアッセイからの胚のみが取得する必要があります。固定および染色された胚を破棄することができます。
2. ライブイメージングアッセイを行った場合、オブジェクトのスライドに胚を移します。アガロースカラム技術のために、外科用メス、マイクロナイフ又はかみそりの刃でアガロース周囲から胚を取り出します。アガロース半球技術ため、オブジェクトスライドに平坦な側面と半球を移します。胚の除去は必要ありません。クモの巣ホルダ技術のために、穏やかに絵筆を有するアガロース膜から胚を取り外します。幼虫が孵化するまで、標準的な条件下で、飽和湿度雰囲気中で小さなガラス皿中のオブジェクトスライドをインキュベートします。
3. 孵化後、24ウェルプレートの個々のウェルに幼虫を移し、各ウェルに増殖培地の500 mgの追加。標準的な条件下でインキュベートします。非画像WTおよびトランスジェニックlarvに結像幼虫の総開発時間と形態を比較AE（議論を参照）。 WTの開発を特徴づけるアッセイでは、明らかな形態学的な収差は、理想的には目立ってはなりません。
4. 幼虫たら、健康な成人に開発し、同じバックグラウンド系統の適切なWTパートナーとそれらを提供します。 2週間後、子孫の生産のために確認してください。また、インターParesにおけるそれらを交配して子孫の繁殖力を確認することを検討してください。画像形成された胚は肥沃な子孫を生み出す肥沃な大人に成長したときのみ、画像化手順は、非侵襲的とみなすことができます。

10.画像データ処理

注：画像データ処理のために、オープンソースの画像処理ソフトウェアImageJの⁶⁷またはその誘導体のFIJI ^68が推奨されています。どちらのバージョンだけでなく、包括的なドキュメントがwww.imagej.netで発見されています。 LSFMデータのための標準的なファイルフォーマットは、タグ付き画像ファイル形式（TIFF）です。固有のコンテナオプションは、STOを可能に例えば、Zスタックまたはドラッグアンドドロップを介して、ImageJの又はフィジー開くことができる単一のファイル内のz最大突起の時系列として画像スタックの怒り。

1. 必要に応じて、y軸（イメージ→変換→回転）と胚の前後軸を整列させるために、Zスタックを回転させます。回転パラメータがなく、時間の経過と蛍光チャンネルについて、各方向ごとに個別に設定する必要がありますのでご注意ください。
2. 沿って、Zスタックをトリミング最小限背景ようにx軸、y軸およびz軸（20 - x軸及びy軸に沿って40ピクセル、5 - z軸に沿った10面）はxに対して（まま - とy軸、長方形選択ツール、トリミング→次にイメージを使用;スライスキーパー→スタック→ツール）→Z軸用画像のために。トリミングパラメータが各方向にではなく時点と蛍光チャンネルごとに個別に設定する必要がありますのでご注意ください。
3. 各ZスタックのためのZ最大投影を計算します（画像→スタック→Zプロジェクト、最大強度を選択してください）。強度投影計算は一つの空間次元を削除データ簡略化の手順です。
4. 長期ライブイメージングデータのために、処理は10.1すべての方向、全ての時点および全ての蛍光チャネル⁶⁵ 10.3〜ステップ実行ImageJのまたはフィジーのスクリプトの使用を検討してください。理想的には、チャネルおよび方向ごとのすべてのzの最大突起を連結一つTIFF容器内の時系列として保存。あるいは、フィジーためBigDataViewer ⁶⁹プラグインは、テラバイト、大規模なデータセットをナビゲートするために使用することができます。
5. トランスジェニック系統及び撮像モダリティに応じて、時間スタックの動的強度の調整が原因光退色および/またはフルオロフォア発現変動に望ましいかもしれません。 ImageJ-またはFIJI-固有のブリーチ補正機能のいずれか（画像→ヒストグラムマッチング選択し、→ブリーチ補正を調整します）、またはdedicaテッドソフト^65が提案されています。
6. 胚が（イメージ→カラー→チャンネルをマージ）、及び/又は複数の方向に沿って複数の蛍光チャネルに方向（画像スタック→→ツール→は結合）とチャネルマージの水平方向の組み合わせを記録した場合に推奨されています。
7. 登録し、最終的にデコンボリューション⁷¹との組み合わせで、複数の方向⁷⁰に沿って取得した、Zスタックの融合は、均一な品質及び等方性解像度の優れた三次元画像の計算を可能にします。両方のプラグインは、オープンソースとフィジーのプリインストールされているが、それらは、試料の周りのランドマーク（蛍光微小球、 例えばビーズ ）の存在を必要とします。
8. 大規模な定量的データ抽出及び分析のためのオープンソースのソフトウェアフレームワークは、細胞核⁷²又はCELのセグメント化および追跡のための、例えば、も利用可能ですL形状認識^73。

結果

このプロトコルは、生活の蛍光イメージング又はLSFMで固定し、染色しモドキTribolium胚の実験の枠組みを記載しています。光退色及び光毒性の低いレベルに、その光学切片機能の直接の結果は、LSFMは長期的なライブイメージングのために特に適しています。

新規AGOC {ATub'H2B-mEmerald}＃1トランスジェニックラインは、α-チューブリン1プロモーター⁷⁴の制御下histone2B-mEmerald融合タンパク質を発現します。蛍光シグナルは、主に漿膜、卵黄嚢およびいくつかの神経細胞塊から得られるので、それは、エンハンサートラップのような発現パターン^51を示しています。この行を使用して、室温（23±1℃）で、胚発生の66時間はgermband引込み及び背側閉鎖（補足映画1）を覆う、記録しました。このラインヘッド...

ディスカッション

品質管理

ライブイメージングアッセイでは、準備と記録手順は、非侵襲的でなければならない、 すなわち観察中（コレクション、dechorionation、サンプルホルダーに取り付け）も統合されたエネルギー負荷を処理する機械的および化学的でもないが、試料の生存率に影響を与える必要があります。 WTの開発を特徴づける研究のために、それは胚が正常に取得され、記録処理を存続し、健康な成人に発展した実験からのみ利用データに推奨されます。大人は肥沃である必要があり、任意の形態学的収差を示してはならないし、その子孫も肥沃でなければなりません。特に長期のライブイメージングアッセイで生存率が低い、のための3つの主要な理由があります。

まず、胚の表面は、おそらくイオンとガス交換を妨げ、胚mechanを収縮ステップ7中アガロースで広範囲に覆われましたICALLY。影響を受けた胚は、初期胚発生中に画像化する場合は特に、一般的に、数時間のために目立たない開発突然逮捕し、迅速に蛍光シグナルを失います。クモ...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
全粒小麦粉	Demeter e.V.	1.13E + 08	US:全粒粉、UK:全粒
405上質な小麦粉	Demeter e.V.	1.13E + 08	米国:ペストリー粉、英国:軟粉
活性ドライイースト	Flystuff / Genesee Scientific	62-106
リン酸緩衝セイン(PBS)、pH 7.4	サーモフィッシャーサイエンティフィック	10010-023
次亜塩素酸ナトリウム、~12% 活性 Cl	Sigma Aldrich	425044-250ML	注意:次亜塩素酸ナトリウムは腐食性です
低融点アガロー	カールロス	6351.2
6 ウェルプレート	Orange Scientific	4430500
24 ウェルプレート	Orange Scientific	4430300
ガラスキャピラリー、内部 & Oslash; 0.46 mm	Brand GmbH + Co KG	7087 09
SYTOX Green	Thermo Fisher Scientific	57020	染色液の調製は表 2 で説明されています
ヨウ化物 YOYO-1 ヨウ化物	サーモフィッシャーサイエンティフィック	Y3601	染色液の調製は表2で説明
BOBO-3 ヨウ化物	サーモフィッシャーサイエンティフィック	B3586	染色液の調製は表2で説明されています
Alexa Fluor 488 Phalloidin	サーモフィッシャーサイエンティフィック	A12379	染色液の調製は表2で説明
Alexa Fluor 546 Phalloidin	サーモフィッシャーサイエンティフィック	A22283	染色溶液の調製は、表2
ふるい、800µで説明されています。mメッシュサイズ	VWRインターナショナル	200.025.222-051
ふるい、710µmメッシュサイズ	VWRインターナショナル	200.025.222-050	成長培地調製(ステップ1.1)
ふるい、300µmメッシュサイズ	VWRインターナショナル	200.025.222-040
ふるい、250µmメッシュサイズ	VWRインターナショナル	200.025.222-038	産卵培地調製用(ステップ1.2)
ガラス皿、およびOslash; 100 mm× 20 mm	Sigma Aldrich	CLS70165102
細胞ストレーナー、100 & マイクロ;m メッシュサイズ	BD Biosciences	352360
ペイントブラシ、ヘッド & Oslash; 2 mm	VWR International	149-2121
シリンジ、1.0 mL	B. Braun Medical AG	9166017V
シンチレーションバイアル	Sigma Aldrich	M1152-1000EA
パラホルムアルデヒド (PFA)	Sigma Aldrich	158127	注意:パラホルムアルデヒドは有毒で腐食性があります
n-ヘプタン &Ge;99%	Carl Roth	8654.1	注意:n-ヘプタンは可燃性で有毒です
Triton X-100	Sigma Aldrich	X100-100ML	注意:Trition X-100は腐食性です