生物学的サンプルからの癌幹細胞の検出と精製のためのDNA色素誘発側母集団表現型の活用

サマリー

生物学的試料からの幹細胞集団の特徴付けおよび単離を可能にする方法は、癌およびそれを超える幹細胞標的化治療の進歩にとって重要である。ここでは、色素誘発性の側方集団表現型を用いた癌幹細胞単離のための詳細なプロトコールを提供する。

要約

がんは幹細胞に起因する疾患であり、これらの細胞の根絶が主要な治療目標となっている。 Cancer Stem Cells（CSCs）の脆弱性を解読し、適切な分子標的を特定することは、細胞系やex vivo腫瘍組織などの異種試料での特異的差別を可能にする方法に依存しています。フローサイトメトリー/ FACSは、単一細胞レベルで生物学的サンプルをマルチパラメトリックに解剖するための強力な技術であり、下流の分析のために生きた細胞を回収するための選択方法である。 CD44およびCD133のような表面マーカーならびにアルデヒドデヒドロゲナーゼ酵素活性の検出は、FACSによる腫瘍サンプルからのCSCを定義および分類するためにしばしば用いられてきた。ここで方法論的詳細に示されている相補的アプローチは、一般に側方集団（SP）と呼ばれる蛍光dim細胞の明確な集団を同定するABC薬物トランスポーターによる機能的色素押出を利用する。 SPがん細胞は、標準的な幹細胞の特徴を示し、色素押し出し薬物輸送体（最も頻繁にはABCB1 / P-糖タンパク質/ MDR1 / CD243およびABCG2 / Bcrp1 / CD338）を阻害する物質を使用して廃止され、機能的に確認され得る。さらに、SPアッセイは、表面抗原の染色、アルデヒドデヒドロゲナーゼ検出、および死細胞識別（ 例えば 、7-AADまたはヨウ化プロピジウム（PI））などの他のフローサイトメトリー評価と適合する。したがって、我々は、表現型パラメータではなく機能的に基づいて、CSC同定、単離およびサブキャラクタリゼーションを機械的に行うための価値ある、広く適用可能な方法を記載する。もともとHoechst 33342をトリガー色素として使用していましたが、ここではバイオレットレーザー光源を備えたフローサイトメーターで分解可能な、より新しいViolet色素に基づくSP表現型に焦点を当てます。

概要

原発性癌治療の有効性は、この疾患の遺伝的および分子的理解の魅力的進歩、治療用抗体および小分子阻害剤などの標的薬物の出現のために、過去10年間で実質的に改善されている。対照的に、転移性および再発性の疾患は依然として典型的に治癒不可能であり、罹患率および死亡率はこれらの臨床的状況において依然として高いままである。 CSCは、腫瘍内の別個の亜集団を表し、クローン原性/腫瘍原性、多剤耐性および非対称細胞分裂^1,2などの標準的な幹細胞特性を付与される。したがって、CSCは、転移性の進行および腫瘍の異種性を促進するだけでなく、患者の再発の素因となる治療中も持続する。したがって、治療的CSC除去は、疾患の再発を予防し、がんの長期治癒を可能にする重要な医学的必要性である³ 。

脆弱性の特定およびCSCを根絶する戦略の解明は、その後の発現プロファイリングおよび/または機能検査のための生物学的サンプルからの精製を可能にする方法に大きく依存する。次に、そのような方法は、これらの細胞に特異的な表面、細胞内または機能的マーカーに依存する。 CSC特異的表面マーカーには、CD44、CD133、CD24およびCD90が含まれるが、これらに限定されず、乳癌および大腸癌を含む様々な腫瘍実体におけるCSC集団を同定するために使用されてきた⁴ 。別のマーカーで....

プロトコル

このプロトコルは、標準的な制度倫理審査委員会のガイドラインを完全に遵守しています。ここに示すプロトコールを用いてヒトまたは動物の組織を調査する場合、研究者はその機関または国の関連する審査委員会からの承認を得ることが義務付けられている。

注意：生物学的サンプルを安全に取り扱うための標準的な予防措置がこのプロトコルに適用されます。これには、手袋とラボコートを着用し、できる限りバイオセーフティキャビネットの下で作業を行うことが含まれます。

1.細胞の調製

1. 癌細胞株
   1. 適切な培地（ 例えば 、10％（ v / v ）FBS、2mM L-グルタミンおよび1×ペニシリン/ストレプトマイシンを補充したRPMI 1640）中で、37℃でそれぞれのヒトまたはマウス癌細胞株を培養し、収穫する0.05％トリプシン-EDTAまたはいくつかの他の脱アタッチメントによる消化を用いて、サブコンフルエンス（ すなわち、 70〜90％）の細胞審査手続。細胞数を測定し、カウントチャンバーおよびトリパンブルー染色を使用して生存率をチェックする。生存細胞の割合は85％を超えるべきである。
      注：SP区画を含むヒト癌細胞株の例には、MCF7 / HTB-22およびSKBR3 / HTB-30（乳癌）、A2780およびSKOV-3 ....

結果

A2780細胞の代表的なSP分析であり、これは、以前に細胞の1％未満を占めるSPを保持することが示されたヒト卵巣癌細胞株である⁹ 。細胞を、10％（ v / v ）FBS、2mM L-グルタミンおよび1×ペニシリン/ストレプトマイシンを補充したRPMI1640中で37℃で培養し、0.05％トリプシン-EDTAでの処理を用いて85％コンフルエンシーで採取した。細胞をPBSで洗浄し、70μmのカットオフストレーナーで濾過した。計数チャンバおよびトリパンブルー染色を使用して細胞数を測定し、1×10 ⁶細胞/ mL（新鮮培地）を10μMDCVで暗所で37℃で90分間染色した。並行して、そのアリコートを全く同じ条件下で20μMのFTCの存在下でインキュベートした。細胞を4mLのPBSで洗浄し、ABCG2に対するAPC結合抗体を、事前に滴定した濃度で「試験管」に添加した。インキュベート後4℃で25分間、細胞をPBSで洗浄し、7-AADを添加して死細胞を標識した。試料を氷上で冷却し、FACS装置で.......

ディスカッション

癌の臨床管理の進歩は、CSCを標的とする治療様式の開発にも依存する。生物学的サンプルからのCSCの確実な単離を可能にする方法は、適切な標的の同定を促進し、したがって、この努力において非常に重要である。 SP分析は、ABCの薬物トランスポーターを発現するCSC集団を同定するための確立された、そして貴重な技術であり、DCVの実施は、標準的なフローサイトメトリー機器へのその適用性を拡大した。メカニズム的には、SP識別は、ABC薬物輸送体による活性色素流出を利用して、低い蛍光に基づいてCSCを検出し、対応する非SPに残されたプロットの下側に特徴的な局在を伴う。重要なことに、DCVベースのSP検出は、堅牢で直接的な方法であり、最も重要なステップは、細胞の調製（ii）染色プロセス（iii）適切な阻害剤の選択そして（iv）フローサイトメトリー分析。色素押出は活性なエネルギーを消費するプロセスであるため、特に良好な細胞生存率で開始することが重要です。生存可能な（薬物輸送体を発現する）細胞のみがSPを産生することができる。さらに、色素濃度と細胞密度との比を最適化し、それによってSP細胞の分離を増強することがしばしば意味をなさない（これは、DCVと細胞の両.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Vybrant DyeCycle Violet	サーモフィッシャーサイエンティフィック	V35003	すぐに使える
ベラパミル塩酸塩	Sigma-Aldrich	V4629	エタノールに溶解
フミトレモルギンC	Sigma-Aldrich	F9054	DMSO
7-AAD(またはヨウ化プロピジウム - PI)	BioLegend	420403	すぐに使える
標準的な細胞培養試薬(例:、培地、FBS、L-グルタミン、抗生物質、PBS、トリプシン-EDTA、etc.)	異なるサプライヤー
目的のサンプル/細胞(例:、ヒトまたはマウスのがん細胞株、ヒトまたはマウスの腫瘍組織)	異なるサプライヤー
フローサイトメトリー機器(FACS;分析装置またはセルソーター)	異なるサプライヤー		紫色のレーザー光源は、
必要なFACSチューブ(丸底)	異なるサプライヤー		キャップ付きチューブを推奨
70&マイクロ;mカットオフストレーナー	異なるサプライヤー		オプションだが推奨
消化酵素ミックス(例:、コラゲナーゼ/ディスパーゼ/Dnase)	異なるサプライヤー		組織解離にのみ関連
関心のある表面マーカーに対するフルロクロム標識抗体	異なるサプライヤー		オプションの
ALDEFLUORキット	STEMCELLテクノロジー	01700	オプション

に溶解