方法論記事

マルチスペクトルイメージングフローサイトメトリーを用いたLC3、p62、およびLAMP1共局在の測定によるオートファジーフラックスの評価

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DOI:

10.3791/55637

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2017年7月21日

1Amnis Biology Department, MilliporeSigma

この記事について

サマリー

ここでは、LC3スポット計数とともに、3つのオートファジーマーカーの明るい詳細画像を比較し、それらの共局在化を定量化する分析的特徴を有するマルチスペクトルイメージングフローサイトメトリーを用いて、客観的、定量的および統計的に堅牢な方法でオートファジーを測定した。

要約

オートファジーは、成長および分化中に蓄積する正常または機能不全の細胞成分がリソソームを介して分解され、リサイクルされる異化経路である。オートファジーの間、細胞質LC3タンパク質は脂質化され、オートファゴソーム膜に補充される。次いで、オートファゴソームはリソソームと融合してオートリゾソームを形成し、オートファゴソームベシクルおよびその内容物の分解が起こる。 LC3に結合するユビキチン関連タンパク質p62もまた、自食性の流れをモニターするために使用される。オートファジーを受けている細胞は、p62、LC3、およびリソソームマーカーの共局在を示すはずである。免疫蛍光顕微鏡法は、細胞ごとにLC3涙点、p62および/またはリソソームを視覚的に同定するために用いられてきた。しかし、客観的かつ統計的に厳格な評価を得ることは困難である。これらの問題を克服するために、マルチスペクトルイメージングフローサイトメトリーと、3つのオートファジーマーカー（LC3、p62およびリソソームLAMP1）からの尾部画像を検出し、それらの共局在を定量化し、LC3スポット計数と組み合わせて、客観的、定量的および統計的に堅牢な方法でオートファジーを測定する。

概要

以下ではオートファジーと呼ばれるマクロオートファジーは、損傷または機能不全の成分、長命のタンパク質、およびオルガネラがリソソームを介して分解され 、リサイクルされる異化経路である1 。オートファジーは、オートファゴソームの形成を伴うダイナミックな多段階プロセスである。オートファゴソームとリソソームとの融合、オートリゾソームの形成、および自己オリゴソーム2の内容物の分解が含まれる。哺乳類の系でオートファジーを同定するために使用される重要な生物学的マーカーは、オートファゴソーム膜を構成する微小管関連タンパク質1A / 1B-軽鎖3（LC3）である。オートファジーの間、サイトゾルLC3-1はホスファチジルエタノールアミンにコンジュゲートしてLC3-IIを形成する;次いで、LC3-IIは、自己貪食膜3に取り込まれる。自食性フラックスのためのもう1つの広く使用されるマーカーは、物理的にliであるオ​​ートファジー受容体配列sequestome 1（SQSTM1、p62）オートファジー膜4、5 NKSオートファジー貨物。

伝統的にオートファジーを測定するために使用されてきた方法は、ウェスタンブロットと蛍光顕微鏡です7 。しかし、これらの方法のいずれもがこれらの技術の両方に関連する課題があるとして「ゴールドスタンダード」、2、6であると考えられています。ウエスタンブロットはホモジネートサンプルを使用しているため平均値しか得られないため、観察者は個々の細胞で何が起こっているかを見ることができません。一方、蛍光顕微鏡法は、単一細胞レベルで観察者に情報を与えるが、スループット能力に欠け、客観的かつ統計的に厳密な評価を得ることが困難である。近年、マルチスペクトルイメージングフローサイトメトリー（MIFC、 Table of Materialsを参照）によるLC3およびp62の測定は、定量能力、ハイスループット能力、多重化可能性、すべての細胞を画像化する能力による稀少性があります。 （ 材料の表を参照）、そのコンパニオン解析ソフトウェアと共に、MIFCを使用してオートファジーを測定するために最も広く用いられる方法の一つは、LC3の涙点またはオートファゴソーム8、9、10、11、12、13、14のスポットカウントを介するものです、15、16、17。しかし、オートファゴソームの増加は、オートファジーの増加が必ずしも起こるわけではありません。これは、プロセス2の封鎖にもなる可能性があるためです。 LC3-IIの代謝回転は、細胞の存在下および非存在下で細胞を分析することによって自食流を測定するための有用なパラメーターであり、クロロキンのようなリソソーム分解阻害剤が存在しない。クロロキンは、それによって18を発生する可能性がリソソーム分解の前にオートファジーフラックスを阻止することにより、オートファジーの程度の尺度としてオートファゴソーム形成の定量化を可能にする、リソソームにオートファゴソームの融合を阻害します。また、P62は、主にオートファジーによって分解され、オートファゴソームとその内容のリソソーム分解がブロックされている場合、P62の蓄積は、17、19を期待されています。

オートファジーは多段階のプロセスであり、LC3またはp62の測定だけでは、細胞内で何が起きているのかを完全に把握することはできません。最近の刊行物はautolysosome 2、17、20、21の同時形成を検討する必要性を強調してきました。 MIFCは17、20、21、22、23、24、25、26 - 15リソソームにオートファゴソームの共局在を撮像しautolysosomeの形成を測定する一意できます。さらに、MIFCを用いたp62とLC3の共局在化もまた、自食流束5を測定するために検討されている。参照される分析ソフトウェアでは、共配置を測定する「特徴」は「明細部類似性​​R3」（BDS）と呼ばれ、2つの画像の小さくて明るい画像の詳細を比較するように特別に設計されている。 BDSは、3ピクセル以下の半径を有する局所化された輝点の対数変換されたピアソンの相関係数である。言い換えると、BDSは、2つの異なる蛍光チャネルからのピクセルのバーリング。輝点は、相関している（ すなわち、同じ空間的位置）か、相関していない（ すなわち、異なる空間的位置）かのいずれかである。したがって、相関係数は0（無相関）と1（完全相関）との間で変化する。係数がゼロと無限大26、27との間の範囲を増加させるために対数変換です。 BDSだけでは十分ではないかもしれません。 Rajan et al。 BDSのみを使用すると、偽陽性または偽陰性の結果につながる可能性があることが判明した21 。 BDSは、オートファジーの2つのマーカーの共局在を評価するが、オートファゴソームの数は考慮しない。オートファゴソームの数を説明するために、Rajan et al。 LC3穿刺21のスポットカウントを含む。 Rajan et al。 BDSに対するLC3スポットカウントの二変量散布プロットを使用して提案された。この二変量プロットを使用して、2つの集団最初に同定されたもの：高レベルのLC3スポットを有する細胞を有するもの、および低レベルのLC3スポットを有する細胞を有するもの。高LC3スポット集団は、低い共局在（ すなわち、自己好中球の蓄積）細胞および高い共局在（ すなわち、自己リソソームの蓄積）を有する細胞という2つの集団にさらに分類された。この二変量プロットは、ごく少数のオートファゴソームを有する細胞と、オートファゴソームおよび/または自己リソソームを蓄積する細胞を区別することを可能にする21 。

今まで、MIFCコンパニオン解析ソフトウェア（ 表の表を参照）の単一の「フィーチャタイプ」を使用して、LC3、p62、およびLAMP1（リソソームマーカー）の同時共局在化は不可能でした。しかし、バージョン6.1で最近導入された新機能は、Bright Detail Colocalization 3（BDC3）と呼ばれています。 BDC3は、3つの画像のそれぞれからの明るいディテール画像（この場合、LC3つのプローブ（ すなわち、 LC3、p62、およびLAMP1）の共局在を定量する。 BDC3機能は、3つの画像に拡張されるように修正されたピアソンの相関係数を計算します。 3つの画像の輝点は相関しているか相関していないので、相関係数は0（無相関）と1（完全相関）の間で変化する。係数は、0と無限大の間のダイナミックレンジを増加させるために対数変換されます。 BDC3フィーチャを使用してBDSフィーチャを切り替えることにより、Rajan らが提示した解析方法1つのシステムで同時にオートファジーを測定するために3つの最も使用されるマーカーを組み込むことができます。オートファジーのこれらの3つのマーカーを単一アッセイで共局在させる能力は、オートファジーの誘導および調節に対する新規な洞察につながる可能性がある。以下のプロトコールは、Jurkat細胞においてオートファジーを誘導するステップを概説する。細胞をLC3、p62、およびLAMP1抗体で標識する;マルチスピスでデータを取得する外部イメージングフローサイトメーター;自食流束を評価するためにデータを分析する。

プロトコル

培養培地およびリソソーム分解阻害剤の調製

  1. 1.1。 〜500mLの1x RPMI培地を調製する。 500mLに5mLのMEM非必須アミノ酸（100x）、5mLのピルビン酸ナトリウム（100mM）、5mLのペニシリン - ストレプトマイシン - グルタミン（100x）、および25mLのウシ胎児血清（FBS） RPMI - 1640 1x培地のボトル。培地は、バイオセーフティキャビネット内で調製する必要があります。 RPMI培地を2〜8℃で保存する。 Jurkat細胞に添加する前にRPMI培地を37℃に加熱してください。
  2. 100 mMクロロキン（リソソーム分解阻害剤）を調製する。 0.05gのクロロキン二リン酸塩を秤量し、15mLの遠心分離管内の1mLの細胞培養グレードの水に加える。クロロキンが溶解するまでボルテックスする。

細胞の培養

  1. 培養80mLのJurkat細胞E6-1をRPMI培地で37℃、5％CO 2で培養する。
    注：細胞を培養する場合または固定する前にJurkat細胞で作業する場合、すべての作業はバイオセーフティキャビネットで行う必要があります。
  2. オートファジーを誘導する前に、細胞/ mLを決定するために、血球計または別の細胞計数装置を用いてJurkat細胞を計数する。

3.細胞内でオートファジーを誘導する

  1. 指数関数的増殖期のJurkat細胞を取り出し、50mL遠心管内でそれぞれ20mLの4つのサンプルに分ける。チューブに "Control"、 "Control + Chloroquine"、 "Starved"、 "Starved + Chloroquine"とラベルを付けます。
    注：Jurkat細胞の濃度は2.5〜5 x 10 5 cells / mLでなければなりません。
  2. 各サンプルにCa 2+またはMg 2+ （HBSS）を含まないハンクス平衡塩溶液30 mLを加えて細胞を洗浄する。 250xgで10分間遠心分離する。上清を廃棄ビーカーに注ぎます。
  3. コントロールサンプルを20 mLのRPMI培地に再懸濁させ、25 mLを使用して上下にピペッティング軽いボルテックスを行った後に使用した。同様に、飢えたサンプルをCa 2+またはMg 2+ （EBSS）を含まない20 mLのEarle's Balanced Salt Solutionに再懸濁する。
  4. 25mLの無菌使い捨てピペットを使用して、対照および飢餓状態のサンプルを、「対照」、「対照+クロロキン」、「飢餓状態」および「飢餓+クロロキン」と標識されたT75フラスコに移す。
  5. 「Control + Chloroquine」および「Starved + Chloroquine」フラスコの20 mLの細胞培地に100 mMクロロキン20μLを加えます。穏やかにフラスコを旋回させてクロロキンを混合する。すべてのフラスコを37℃、5％CO 2インキュベーターに2時間入れます。

LC3、LAMP1およびp62の固定および標識のための緩衝液の調製

  1. PBS中の4％ホルマリン固定溶液10mLを調製する。 4mLの10％ホルマリンストックを1mLの10×ダルベッコリン酸緩衝液Ca 2+またはMg 2+を含まない生理食塩水溶液（PBS）および15mL遠心管内の超純水5mL。
    注意：注意。ホルマリン/ホルムアルデヒドは、吸入または飲み込むと有毒である。目、呼吸器系、および皮膚を刺激する。吸入または皮膚接触による感作を引き起こす可能性がある。目に重大な損傷を与える危険性があります。潜在的な発癌物質です。
  2. PBS中の1％ホルマリン最終再懸濁溶液10mLを調製する。 10mLのホルマリンストック1mLを15mLの遠心分離管内の1×PBS9mLに加える。
  3. 500mLの1x PBSのボトルに10mLのFBSを加えることによって500mLの洗浄バッファーを調製する。
  4. ステップ4.3で調製した49.5mLの洗浄バッファーに0.5mLの10％triton X-100を加えることにより、50mL遠心分離チューブ中の50mLの透過性緩衝液を調製する。
  5. 抗SQSTM1 / p62-Alexa 488（AF488）抗体/透過化緩衝液の作業溶液を、5μLの抗SQSTM1 / p62-AF488を495μLの透過性緩衝液に加えて調製するtep 4.4。最終抗体濃度が5μg/ mLであることを確認してください。
    注：サンプルに添加する直前に、抗体透過化緩衝液を使用してください。溶液から光を保護する。
  6. ステップ4.4で作成した透過性緩衝液495μLにマウス抗LC35μLを添加して、マウス抗LC3 /透過性緩衝液操作溶液を調製する。最終抗体濃度が20μg/ mLであることを確認してください。
    注：サンプルに添加する直前に、抗体透過化緩衝液を使用してください。溶液から光を保護する。
  7. ステップ4.4で作製した透過性緩衝液495μLにAF647標識ロバ抗マウスIgGを5μL加えることにより、ロバ抗マウスAlexa 647（AF647）/透過性緩衝液作業溶液を調製する。最終抗体濃度が20μg/ mLであることを確認してください。
    注：サンプルに添加する直前に、抗体透過緩衝液を使用してください。保護する彼は光からの解決策です。
  8. 抗ヒトCD107a（LAMP1）-PE抗体/透過化バッファー作業溶液を、ステップ4.4で作製した透過性緩衝液475μLに25μLの抗CD107a（LAMP1）-PEを添加して調製する。最終抗体濃度が21μg/ mLであることを確認する。
    注：サンプルに添加する直前に、抗体透過緩衝液を使用してください。溶液から光を保護する。
  9. 1x PBSの896μLに5μg/ mLのDAPI4μLと10％のトリトンX-100100μLを添加することにより、10倍のDAPI核染色液を調製する。

5.Jurkat細胞にLC3、LAMP1、およびp62を標識する

  1. サンプルあたり2 x 10 6個の細胞を除去する（ステップ2.2のように細胞を数える）。適切なサンプル名（ すなわち、コントロール、コントロール+クロロキン、飢餓、又はスターブド+クロロキン）で標識された15-mLの遠心チューブ内の各試料を置き。
    1. そこにあるように洗浄バッファーを加えなさい各15mL遠心分離管内で15mLの総容量。 250xgで10分間サンプルを遠心分離する。上清を吸引する。
  2. 100μLの4％ホルマリン固定溶液を各細胞ペレットに加える。 P200ピペットでピペットで上下に再懸濁する。室温で10分間インキュベートする。固定工程中に、サンプルを標識されたシリコン処理されたポリプロピレン製マイクロ遠心管に移す。
    注：細胞を過剰に固定しないでください。この結果、ラベル付けの結果が悪くなる可能性があります。
  3. 10分の固定ステップの後、各サンプルに1mLの洗浄バッファーを添加する。 P1000ピペットでピペットを上下に動かしてサンプルを混合する。 250xgで5分間遠心分離する。上清を吸引する。
  4. 100μLの抗SQSTM1 / p62-AF488抗体/透過緩衝液を各サンプルに添加する。 P200ピペットでピペットで上下に再懸濁する。室温で暗所で30分間インキュベートする。
  5. 細胞を1mLの各サンプルに透過性緩衝液を加える。 P1000ピペットでピペットを上下に動かしてサンプルを混合する。 250xgで5分間遠心分離する。上清を吸引する。
  6. 各抗体作業溶液について、5.4-5.5のステップを繰り返します。
    注意：抗体操作溶液は、マウス抗LC3 /透過化緩衝液作業溶液、ロバ抗マウス-AF647 /透過緩衝液作業溶液、および抗ヒトCD107a（LAMP1）-PE抗体/透過緩衝液使用溶液である。各抗体は、別々にリストされた順序で行う必要があります。抗体間の望ましくない交叉反応性を最小限に抑えるために順序を選択した。
  7. 100μLの1％ホルマリン溶液を加える。 P200ピペットでピペットで上下に再懸濁する。各サンプルに10μLの10倍DAPI核染色を加える。各サンプルを軽くボルテックスして混合する。暗所で室温で10分間インキュベートしてから、機器上のサンプルを実行してください。
    注：この時点で、サンプルはbeはMIFC上で実行されるか、2〜8℃で最大1週間光から保護されて保存されます。

6.単色コントロールのラベル付け

  1. 各単色コントロール（ すなわち、 AF488、PE、AF647、およびDAPI）について、サンプル集団のいずれかから得られる1×10 6 Jurkat細胞を採取する。 AF488、PE、AF647、またはDAPIのいずれかと表示された15 mL遠心チューブに1 x 10 6細胞を入れる。
  2. 各15 mL遠心チューブに15 mLの全容量があるように洗浄バッファーを加えます。 250xgで10分間サンプルを遠心分離する。上清を吸引する。
  3. 100μLの洗浄バッファーをAF488、PE、およびAF647チューブに加えます。
    注：DAPIチューブの場合は、手順6.8に進みます。
    1. P200ピペットでピペットで上下に再懸濁する。 1.5 mLのチューブに移す。
  4. 抗CD45-AF488、抗CD45-PEまたは抗CD45-AF647のいずれか5μLをそれぞれAF488、PE、またはAF647チューブに加える。ボルテックスで混合する。ightly。
  5. 室温で暗所でAF488、PE、およびAF647チューブを30分間インキュベートする。
    注：抗CD45抗体の代わりにLC3、p62、LAMP-1抗体などの他のマーカーを使用することができます。しかし、CD45は単色コントロールの信頼できるマーカーです。
  6. AF488、PE、およびAF647細胞を、各サンプルに1 mLの洗浄バッファーを加えて洗浄します。
    1. P1000ピペットでピペットを上下に動かしてサンプルを混合する。 250xgで5分間遠心分離する。上清を吸引する。
  7. 100μLの1％ホルマリン溶液を加える。 P200ピペットでピペットで上下に再懸濁する。
    注：この時点で、サンプルはMIFC上で実行するか、2〜8℃で最大1週間光から保護して保存することができます。
  8. 100μLの1％ホルマリン固定溶液をDAPIチューブに加える。
    1. P200ピペットでピペットで上下に再懸濁する。室温で30分間インキュベートする。
    2. 10を加える1; 10×DAPI核染色剤のDAPIサンプルへのL。軽くボルテックスして混合する。機器上で実行する前に、室温で暗所で10分間インキュベートする。
      注：この時点で、サンプルはMIFC上で実行するか、2〜8℃で最大1週間光から保護して保存することができます。

7. MIFCの開始とキャリブレーション

  1. シース、システムキャリブレーション試薬（ 表の表を参照）、脱泡剤、洗浄剤、および殺菌剤容器が満杯であり、廃液タンクが空であることを確認してください。そうでない場合は、容器を満たして廃液タンクを空にします。
  2. システムの電源を入れ、ソフトウェアをダブルクリックします（ 表の表を参照）。アプリケーションを起動します。これでMIFCソフトウェアが起動します。
  3. スタートアップボタンをクリックし、 すべてのキャリブレーションとテストを開始が選択されていることを確認します。これにより、システム、ロードシース、システム較正試薬、システムのキャリブレーションを行います。

8. MIFCでのサンプルと単色コントロールの実行

  1. [ファイル ]タブに移動し、 [ デフォルトテンプレートを読み込む ]を選択して、 デフォルトテンプレートを読み込みます。
    注：デフォルトのテンプレートには、生の最大ピクセルドットプロットが含まれています。
  2. それぞれのボタンをクリックして、488 nm、405 nm、642 nm、SSCレーザーをオンにします。各レーザーボタンの隣に希望するパワーを入力してレーザーパワーを設定します。 図1を参照してください。
    注：この実験では、488 nm、405 nm、642 nm、およびSSCのレーザー出力はそれぞれ200 mW、20 mW、150 mW、および5 mW（Ch06）です。 MIFCのデフォルトのテンプレートの倍率は40Xに設定されています。デフォルトの感度はHiで、 すべてのチャンネルが有効です。
  3. 倍率スライダが40Xに設定されていること、高感度モードが選択されていること、およびすべてのチャンネルが画像ギャラリーに表示されていることを確認します。 図1 は、この実験で使用された機器の設定を示しています。
  4. Loadボタンをクリックし、1.5 mLチューブを装置にロードして、「Starved + Chloroquine」サンプルをロードします。
    注：この実験サンプルは、AF488、PE、およびAF647（DAPIシグナルは「Starved + Chloroquine」サンプルを含むすべての実験サンプルでほぼ同じシグナル強度を持つ必要があります）のすべてのサンプルの最高のシグナルを持つ必要があります。
  5. 「Starved + Chloroquine」サンプルを使用して、488 nm、405 nm、642 nm、およびSSCレーザーの適切なレーザー出力が設定されていることを確認します。デフォルトテンプレートの生の最大ピクセルドットプロットを使用して、信号が強く、生の最大ピクセル値が4,096にならないようにレーザー出力を調整します。これにより、CCDカメラが飽和します。すべての実験サンプルにこのレーザー設定を使用してください。
  6. Create Dot Plotsアイコンをクリックして新しいドットプロットを作成します。 「Area_M」を選択01 "を" X "に、" Aspect Ratio_M01 "をY軸に" All "ポピュレーションの場合は、 Create Polygon Regionアイコンをクリックします。
    注記：ユーザーは、追加のプロットと領域を追加して、収集するセルを絞り込むことができます。追加する一般的な追加のプロットは、フォーカスされている細胞を識別するためのGradient RMSです。
  7. 取得パラメータを設定します。ファイル名と保存先フォルダを指定し、イベント数を「5,000」に変更し、「Cell」コレクションの人口を選択します。 Acquireボタンをクリックしてファイルを取得します。ファイルを収集した後、 Returnボタンをクリックしてサンプルを返します。サンプルチューブを機器から取り外します。
  8. 次の3つのサンプル（ "Starved"、 "Control"、 "Control + Chloroquine"）については、サンプルをロードし、サンプル名を入力し、サンプルを取得し、上記の「飢えた+クロロキン」のサンプルについては、
  9. サンプルが取得された後、単色のコントロールサンプルを実行し、補償マトリクスが作成できるようにデータを取得します。 SSCボタンをクリックしてSSCレーザーをオフにします。 BrightfieldボタンをクリックしてOFFを選択して、明視野チャンネルをオフにします。
    注：サンプル収集のために画像ギャラリーからチャンネルを削除した場合は、すべてのチャンネルを再度有効にしてください。または、[ 補正 ]タブをクリックし、[ マトリックスの作成 ]を選択することで、単色のコントロールを取得することもできます 。これにより、ファイルを収集して補償マトリクスを作成するステップを実行する、補償ウィザードが開きます。
  10. DAPI単色コントロールをロードするには、Loadボタンをクリックし、1.5 mLチューブを機器にロードします。サンプル名（DAPIのみ）を入力し、収集集団を「すべて」に設定し、イベント数を変更しますsから "500"
    1. Acquireボタンをクリックして単色コントロールファイルを取得します。
    2. ファイルの収集が完了したら、 Returnボタンをクリックしてサンプルを返します。サンプルチューブを機器から取り外します。
    3. DAPIサンプルの後、 ロードボタンをクリックし、100mLの10％漂白剤を1.5mLチューブに充填することによって、サンプルと同じように10％漂白剤をロードする。サンプルを〜15秒間動かします。これにより、チューブから残留DAPIが除去されます。
    4. 残りの10％漂白剤を除去するために、8.10.3で行ったように1x PBS100μLを流す。これで、AF488、PE、およびAF647単色コントロールを実行する準備が整いました。
    5. 単色コントロールのそれぞれの繰り返しステップ8.10-8.10.2（ すなわち、AF488、PE、及びAF647）。
      注：DAPI単色コントロールの後でのみ、これらのサンプル間に10％漂白剤またはPBSを流す必要はありません。

9. MIFCにおけるデータ解析alysisソフトウェア

  1. MIFC分析ソフトウェアを起動します（ 表の表を参照）。
  2. 分析開始をクリックしてファイルを開くウィザードを開始します 。 "Starved + Chloroquine"生画像ファイル（.rif）を参照して開くデータファイルを選択します。ファイルを選択し、[ 開く ]ボタンをクリックします。 次へをクリックします。
    1. 補償を適用する。以前に作成した補正行列を選択し、[ 次へ ]をクリックします。または、[ New Matrix ]ボタンをクリックして新しい補正マトリクスを作成します。
      注記：ステップ9.2.1.1-9.2.1.2は、新しいマトリックスを作成するステップです。
      1. [ ファイルの追加 ]をクリックしてファイルを選択し、[ 開く ]ボタンをクリックすると、単色の制御ファイル（ つまり、 DAPIのみ、AF488のみ、PEのみ、AF647のみ）が制御ファイルリストに追加されます。 次へをクリックします。
      2. この実験では、 補償行列の作成ウィンドウが表示されます。エンシュールCh02、Ch03、Ch07、およびCh11が選択されていることを確認し、[ 次へ ]をクリックします。補償マトリクスが作成されます。 [ Finish]をクリックして補正行列を保存します。補正ファイルをファイルを開くウィザードに追加し、[ 次へ ]をクリックします。
    2. 分析テンプレートを適用します。この段階では、適用する分析テンプレートがないので、 「次へ」をクリックします。
      注：他の実験ファイルについては、この "Starved + Chloroquine.daf"ファイルをテンプレートとして使用できます。
    3. ファイルに名前を付け（ "rif"名に対応するファイル名が自動的に生成されます）、[ 次へ ]をクリックします。 "02"、 "03"、 "07"、 "11"のチャンネルを選択して画像表示のプロパティを設定します。チャネル01,06、および09があらかじめ選択されています。 次へをクリックします。
  3. Open File Wizardの最後に、 Apoptosis Wizardを選択します。 アポトーシスウィザードのアイコンをクリックし、次にアポトーシスウィザードを開くには、 [ウィザードの選択 ]ボタンをクリックします。
    1. 核イメージチャネル（Ch07）を選択し、 次へをクリックします。ベストフォーカスのセルをゲートします。 「 線領域を作成」アイコンをクリックし、グラデーションRMS_M01_Ch01の領域を60-90から描画します。この領域の名前を "Focus"に設定し、[ OK ]をクリックして、[ 次へ ]をクリックします。
    2. 単一の細胞をゲートする。 Create Polygon Regionアイコンをクリックします。単一のセルの周りに領域を描画し、領域に "Single"という名前を付け、[ OK ]をクリックして、[ 次へ ]をクリックします。 「サブ集団を分析しますか？」の場合は「 いいえ 」をクリックします。
    3. 有核細胞をゲートする。 線領域を作成アイコンをクリックし、すべての有核細胞を含む領域を描画します。領域に「Nucleated」と名前を付けます。 OKとNextをクリックします。
    4. アポトーシス細胞をゲートする。 Create Polygon Regionアイコンをクリックします。アポトーシス細胞の周りの領域を描く。これらは細胞です低い核面積_T50％および高い明視野コントラストを有する。 Finishをクリックします。 Create Polygon Regionアイコンをクリックして、アポトーシス以外の細胞の周りに領域を描画して、2番目の領域を追加します 。この領域を「セル」と呼んでください。
  4. LAMP1、p62、およびLC3陽性の細胞を選択します。 Building Blocksアイコンをクリックし、 Fluorescence Positives - One Colorを選択し、「細胞」集団およびIntensity_MC_Ch03を選択します。 X軸の「Intensity LAMP1」にラベルを付けます。 線の作成アイコンをクリックして領域を描画することにより、10,000を超える強度を持つセルを含む領域を描画します。この領域に「LAMP1 +」とラベルを付けます。 9.4と同じ手順に従って、p62およびLC3陽性の細胞を選択します。
    1. p62 +の場合、 "LAMP1 +"母集団とIntensity_MC_Ch02を選択します。 X軸「強度p62」とp62 +細胞「LAMP1 + / p62 +」の領域にラベルを付けます。; LC3 +については、 "LAMP1 + / p62 +"集団とIntensity_MC_Ch11を選択してください。 X軸「Intensity LC3」とLC3 +細胞の領域「LAMP1 + / p62 + / LC3 +」にラベルを付けます。残りの分析には、この "LAMP1 + / p62 + / LC3 +"集団を使用してください。
  5. LC3スポットをカウントするスポットカウント機能を作成します。
    注：これは "Starved + Chloroquine"サンプルを使用して作成する必要があります。
    1. [ 分析 ]タブをクリックし、[ マスク ]を選択します。 Newボタンをクリックし、 Functionボタンをクリックします。 [ 機能]の [ ピーク ]を選択します。 Maskを選択し、 M11を選択します。 チャンネル 、 Ch11を選択します。 スポットをセルの背景比率に4に設定します。 Maskリストに追加するマスク関数を定義ウィンドウと[OK]を閉じるには、[OK]をクリックします。 [ 閉じる]をクリックしてマスクマネージャを終了します 。
    2. [ 分析 ]タブをクリックし、 特徴。 新規ボタンをクリックします。 フィーチャタイプで 、 スポット数とマスクの下でピークを選択 （M11、Ch11、Bright、4）。 Nameに "Spot Count LC3"と入力し、 OKをクリックして閉じるをクリックしてFeature Managerを終了します。
      注： スポットウィザードは、スポットカウント機能の作成にも使用できます。この実験で使用したスポットカウント機能は、他の実験および/または細胞株には適していない可能性があります。特定のデータセットのマスク/フィーチャを決定する際には、いくつかのスポットカウントマスク/フィーチャをテストする必要があります。 Pugsley 2017は、MIFC分析ソフトウェア26を用いたスポットカウントに関するさらなる詳細を有する。
    3. 新しいヒストグラムアイコンをクリックします。 「LAMP1 + / p62 + / LC3 +」集団を選択する。 Spot Count LC3機能を選択し、 OKをクリックします。
  6. BDC3機能を作成します。
    1. C[ 分析 ]タブをクリックし、[ 機能 ]を選択します 。 新規ボタンをクリックします。 [ フィーチャタイプ]で 、[ Bright Detail Colocalization 3 ]を選択します。 マスクを選択し、 MCを選択します。 画像1 、 Ch02 （p62）を選択します。 画像2 、 Ch03 （LAMP1）を選択します。 私は 3 、 Ch11 （LC3）を選択します。 名前に 「BDC3 p62 / LAMP1 / LC3」と入力し、「 OK」と「閉じる 」をクリックして終了します。 フィーチャマネージャ 。
    2. 新しいヒストグラムアイコンをクリックします。 「LAMP1 + / p62 + / LC3 +」集団を選択する。 BDC3のp62 / LAMP1 / LC3機能を選択し、[ OK ]をクリックします。
  7. New Scatterplotアイコンをクリックします。 「LAMP1 + / p62 + / LC3 +」集団を選択する。 X軸にはBDC3 p62 / LAMP1 / LC3を選択します。 Y軸のスポットカウントLC3機能を選択します。 [ OK]をクリックします。
  8. thを保存e "Starved + Chloroquine"ファイル。 [ ファイル]をクリックし、[ データ解析ファイルの保存（.daf）]を選択します 。以前のバージョンのファイルを置き換えるには、[ 保存]と[ はい]をクリックします 。このファイルをテンプレートとして使用できるようになりました。
  9. "コントロール"ファイルを開きます。 [ ファイル]をクリックし、次に[開く]をクリックします 。 "Control.rif"ファイルを選択し、 Openをクリックします。ステップ9.2.1の補償マトリックスと "Starved + Chloroquine.daf"ファイルをテンプレートとして選択します。 [ OK]をクリックします。
  10. オートファゴソームの蓄積と自己リゾソームの蓄積のための領域を作成し、 "Control"サンプルを使用して領域を設定します。
    1. 「 長方形領域の作成」アイコンをクリックします。 -0.1から3のX座標と1.5から-0.3のY座標から領域を描きます。この領域の名前を「Low Spots」にします。クリックしてください 矩形領域アイコンを作成します。 X座標から-0.1からY座標までの領域を描画する17.5~1.5のates。この領域に「High Spot / Low BDC3」と名前を付けます。
    2. 「長方形領域の作成」アイコンをクリックします。 1から3のX座標と17.5から1.5のY座標から領域を描きます。この地域に「High Spots / High BDC3」と名前を付けてください。
  11. "Control"ファイルを保存します。 [ ファイル]をクリックし、[ データ解析ファイルの保存（.daf ）]を選択します 。以前のバージョンのファイルを置き換えるには、[ 保存]と[ はい]をクリックします 。このファイルをテンプレートとして使用できるようになりました。
  12. 「 File + Open」をクリックして「Control + Chloroquine」ファイルを開きます。 "Control + Chloroquine.rif"ファイルを選択し、 Openをクリックします。ステップ9.2.1の補正行列と "Control.daf"ファイルをテンプレートとして選択します。 [ OK]をクリックします。 "飢えた"と "飢えた+ Chloroquine"ファイルに対してこれを繰り返します。
    注：分析ソフトウェアのバッチ機能を使用して、または他のファイルにテンプレートを追加することができます。最終的なゲーティング戦略を図2に示します 。

結果

この分析方法は、複数の特徴を用いて自食流束を測定する。最終二変量プロットを完全に理解するためには、まず個々の分析特徴を調査しなければならない。オートファゴソームの計数は、オートファジーを測定する論理的な方法です。しかし、LC3涙のサイズ/形状/輝度は、細胞間で大幅に変化し得る。変異により、自動染色体を手動で数えることが困難になるか、分析ソフトウェアでスポットカウント機能を使用することが困難になります。したがって、オートファゴソームのこの大きな変動のためにスポットカウント機能は完璧ではない。しかし、良いスポットカウント機能は、ほとんどの細胞26上で動作します。 図3は、異なるスポットマスクを用いたJurkat細胞におけるLC3穿刺のスポットマスキングの例を示す。このデータセットで選択されたスポットカウント機能は、Spot Count_Peak（M11、Ch11-LC3-AF647、Bright、4）_4です。スポットカウント機能は、スポット対セル背景比率4（Bright、4）でチャンネル11（Ch11-LC3-AF647）のデフォルトチャンネル11マスク（M11）内で識別されたakマスクを生成する。 図4は、抗LC3-AF647で標識した対照、対照+クロロキン、飢餓および飢餓+クロロキンJurkat細胞についてのスポットカウントヒストグラムおよび平均スポットカウントの代表的な画像を示す。コントロールスポットと飢えた平均スポット数は大きく異なるわけではありません。クロロキンの添加により、飢餓+クロロキンと比較して、対照+クロロキンの平均に大きな差がある。

調査する次の機能はBDC3です。 BDC3は、3つのマーカー/プローブ（この場合、LC3、p62、およびLAMP1）の共局在化の測定値である。 図 5A〜5Dは、抗p62-AF488で標識された対照、対照+クロロキン、飢餓および飢餓+クロロキンJurkat細胞についてのBDC3ヒストグラムを示す、抗LAMP1-PE、および抗LC3-AF647が挙げられる。 Control + MeaningとControl + ChloroquineはStarved + Chloroquineの平均値に差があります。しかし、 図5Eにおける平均BDC3スコアからの細胞の画像を見- 5H、信じるために1つをもたらし得るヒストグラムよりもサンプル間の大きな違いがあります。これは、BDC3は、同じBDC3スコアについて、自己貪食細胞の数の大きな程度の変動をもたらす、共局在する自己貪食細胞小器官の数を考慮しないためである。ほとんどの場合、基底レベルでさえ、p62、LAMP1、およびLC3はある程度、細胞内の同様の領域に共局在または存在すべきであるため、3つのプローブの間に重複が存在する。対照的に、共局在すべきではない3つのプローブの例は、 図6に示すStarved + Chloroquineサンプルの抗p62-AF488、抗LC3-AF647、およびDAPI核色素である。/ p>

スポットカウント機能とBDC3機能を組み合わせると、様々なサンプル/条件を区別する能力を向上させる異なるサブポピュレーションの存在が明らかです。 図7は、対照、対照+クロロキン、飢餓、および飢餓+クロロキンの4つのサンプルについて、LC3対BDC3p62 / LAMP1 / LC3のスポットカウントの二変量プロットを示す。 Controlサンプルを使用して、低点、高点/低BDC3、高点/高BDC3の3つの集団のゲーティング戦略を設定しました。対照試料は、細胞の98％より多くが1つ以下のスポットを有することを実証した。 High Spots / Low BDC3とHigh Spots / High BDC3の境界は、対照サンプルの91％以上が1未満のBDC3スコアを有するため、BDC3スコアが1に設定された。二変量プロットの結果の要約表1に示す。

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図1：MIFC計測器の設定この実験で使用されたMIFC計測器設定のスクリーンショット（プロトコルのステップ8で概説）。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

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図2：分析ソフトウェアゲーティング戦略。プロトコルのステップ9で概説された分析ソフトウェアゲーティングスキームのスクリーンショット。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

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図3：LC3スポットマスキングスポットカウント機能を作成するために使用されるJurkatセル画像とマスク。 BrightField（BF）、LC3-AF647、ピーク（M11、Ch11-LC3-AF647、ブライト、2）、ピーク（M11、Ch11-LC3-AF647、ブライト、4）、ピーク（M11、Ch11-LC3-AF647 、Bright（5）、Spot（M11、Ch11-LC3-AF647、Bright、5,3,1）、およびSpot（M11、Ch11-LC3-AF647、Bright、6,2,1）である。表示されたすべてのセルで最も効果的なマスクはPeak（M11、Ch11-LC3-AF647、Bright、4）でした。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

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図4：LC3スポットカウントヒストグラム対照（ A 、薄青色）のスポットカウント機能Spot Count_Peak（M11、Ch11-LC3-AF647、Bright、4）_4およびLC3-AF647スポットカウントヒストグラムを使用して、Control + Chloroquine（ B 、青）、飢えている（ C 、ピンク）、飢えた+クロロキン（ D 、赤）。 Control、Control + Chloroquine、Starved、およびStarved + Chloroquineの平均スポット数は、それぞれ0.07,1.33,0.10および2.77である。コントロールスポット（ Eスポット、0スポット）、コントロール+クロロキン（ Bスポット）、 Bスポット、LC3-AF647（赤色）、DAPI核染料（青色）、および平均スポットカウントの代表的な細胞のLC3-AF647およびDAPI画像F 、1スポット）、飢餓状態（ G 、0スポット）、および飢餓+クロロキン（ H 、3スポット）。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

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図5：p62 / LAMP1 / LC3のBDC3ヒストグラム。 BDC3 p62 / LAMP1 / LC3のヒストグラムRコントロール（A、ライトブルー）、コントロール+クロロキン（B、青）、スターブド（ピンクC）、及び飢餓+クロロキン（D、赤）。 Control、Control + Chloroquine、Starved、およびStarved + Chloroquineの平均BDC3スコアは、それぞれ0.57,0.82,0.74および0.98である。 BF; p62-AF488（緑色）。 LAMP1-PE（黄色）。 LC3-AF647（赤色）; Control（ E ）、Control + Chloroquine（ F ）、Starved（ G ）、およびStarved + Chloroquineについての代表的な細胞のp62-AF488、LAMP1-PE、およびLC3-AF647画像の複合体が示されているH ）。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

figure-results-5
図6：p62 / LのBDC3ヒストグラム餓死+クロロキンサンプルのC3 / DAPI。 （ A ）Starved + ChloroquineサンプルのBDC3 p62 / LC3 / DAPIヒストグラムが示されている。平均BDC3スコアは0.07である。 （ B ）BF; p62-AF488（緑色）。 LC3-AF647（赤色）; DAPI（青色）; Starved + Chloroquineサンプルについては、平均BDC3についての代表的な細胞のp62-AF488、LC3-AF647、およびDAPI画像の複合体が示されている。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

figure-results-6
図7：BDC3 p62 / LAMP1 / LC3に対するLC3スポット数の二変量プロット。 （ A ）Control、Control + Chloroquine、Starved、およびStarved + Chloroquine Jurkat細胞に対するLC3スポット数対BDC3 p62 / LAMP1 / LC3の二変量プロット。 （ B ）BF; p62-AF488（緑）; LAMP1-PE（黄色）。 LC3-AF647（赤色）; Starved + Chloroquineサンプルについては、3つの領域（ すなわち、低スポット、高スポット/低BDC3、高スポット/高BDC3）からのp62-AF488、LAMP1-PEおよびLC3-AF647画像の複合体が示されている。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

細胞数明るい詳細Colocalization 3平均スポットカウントLC3 Mean 低スポット％ ハイスポット/ローBDC3％ ハイスポット/ハイBDC3％
コントロール 439 0.57 0.07 98.2 1.8 0.0
対照+クロロキン 1432年 0.82 1.13 68.9 19.5 11.7
飢えた 1204 0.74 0.10 98.4 0.6 1.0
飢えた+クロロキン 1811 0.98 2.77 32.1 36.9 31.0

表1：Jurkat LC3スポット数対 BDC3 p62 / LAMP1 / LC3二変量プロットのまとめ

ディスカッション

この分析を行う際には、考慮すべき点がいくつかあります。適切な対照試料を有することが重要である。この実験のために、2つの異なる対照、すなわち対照および対照+クロロキンを使用した。対照試料を用いて領域の閾値を設定した。それはリソソーム分解を止めることなくオートファジーの基礎レベルを表し、飢餓状態のサンプルのコントロールです。しかし、対照サンプルは、クロロキン自体がコントロールサンプルに影響を及ぼすため、Starved + Chloroquineサンプルの結果と比較するのに適切なコントロールではありません。したがって、Control + Chloroquineサンプルが必要でした。

オートファジーの分析を行う前に、複数のセルが存在する場合、結果が影響を受ける可能性があるため、フォーカスされている単一セル（ つまり、 60以上の勾配RMS）のみを分析/ゲートすることが重要です。焦点が外れている。自食作用が重要であるesおよびリソソームは、適切なスポット計数およびBDC3分析のために焦点を合わせている。アポトーシス細胞は、オートファジー分析に先立って除去されなければならない。なぜなら、それらは結果を歪曲し、含まれてはならないからである。すべての3つのマーカー（ すなわち、LC3、P62、およびLAMP-1）のための適切な染色があるはずです。例えば、3つのマーカーはすべて細胞内であり、点状のシグナルを有するべきである。シグナルが点状でない場合、または細胞の表面上にある場合、染色は適切ではなく、実験/染色は再度行わなければならない。さらに、BDC3が正確であるためには、関心のある3つの蛍光マーカーすべてについて明るい細胞をゲートすることが不可欠である。非特異的結合、画像化アーチファクト、および/またはノイズに対するBDC3の測定を防止するためには、陽性事象に対するゲーティングが必要である。これは、BDC3が真の信号ではないアーチファクトを増幅する可能性があるため、非常に重要です。 BDC3は明るい陽性事象に対してのみ実施することができるので、多くの細胞は最終分析に含まれないことがある。これは特にLC3、p62、および/またはLAMP1の蓄積を全く有さない対照細胞については真実である。したがって、このアッセイの限界は、BDC3が、すべてのオートファジー実験に適切ではない可能性がある3つのマーカー全てに対して陽性である細胞のみを調べることである。

先に単独でBDC3が大きく、その結果、アカウントに共局在オートファジー細胞小器官の数を取らない15、16、17、20、21、22、23、24、25、26、報告されているBDS、等オートファゴソームの数の変動の可能性がある。したがって、Rajan らによって提示された二変量のアプローチは、を採用した。二変量プロットを見ると、細胞はLC3、p62およびLAMP1に対して陽性でなければならない。どうしてそんなにたくさんの細胞があり、0のスポットがあるのですか？これは、LC3信号が共局在化に十分明るい可能性があるため、ピークマスク（ピーク（M11、Ch11-LC3-AF647、Bright、4））によって設定されたしきい値を満たさない可能性があるスポット。

ここに提示されたプロトコールは、LC3涙点数をカウントするためにMIFCを用い、自食流束を測定するために3つのオートファジーマーカーの共局在化を用いた。基底状態（対照試料）では、自己好塩基球の数は少なく、「ハイスポット」ではほとんど検出されなかった。オートファゴソーム/リソソーム融合を阻害するクロロキンの添加により、LC3スポットの数が増加した。リソソームは、オートファゴソームおよびオートファゴソームに存在するp62を分解することができないので、LC3、p62およびLAMP1自己リゾソーム蓄積の共局在が増加する。この効果は、栄養のあるスターバットイオン、これはオートファジーを誘発する。しかし、クロロキンの添加がなければ、自己食作用の回転数の増加による可能性が最も高い、自己食作用の数の有意な増加はなかった。細胞がクロロキンの存在下で飢餓状態になると、共局在化および自己貪食細胞数が増加し、飢餓が自食性流動を増加させるという結論を支持する。 EBSSは強力なオートファジーの誘導物質として知られています。したがって、その増加は大きくなると予想される。薬物誘導のような別の方法を用いてオートファジーを誘導する場合、コントロールサンプルと処理サンプルとの差異は微妙である可能性がある。

この特定のプロトコールは、ヒト細胞株におけるオートファジーを測定するために設計されたが、アッセイは、その特定の種の抗体に切り替えることによって、他の種に適合させることができる。さらに、分析方法は、共局在化を必要とする任意の細胞内適用3つのプローブ/マーカーからなる。

開示事項

私はこの研究で使用されたAmnisブランドImageStreamの製造元であるMilliporeSigmaに雇われています。

謝辞

私はMilliporeSigma、Philip J. Morrissey、Sherree L. Friendの同僚に長年の支持と指導をしてくれたことに感謝したいと思います。私はまた、IDEASソフトウェアのBDC3機能、 Ryan P. Jessup、この原稿の編集を手伝ってくれたVidya VenkatachalamとBryan R Davidsonに感謝します。撮影当日のRaymond Kongと特別感謝します。メイクアップアーティストCynthia Xamonthiene。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
15 mL遠心分離管Falcon352096
50 mL遠心分離管Falcon352070
AF647 Donkey anti-Mouse - IgG InvitrogenA-31571ロバ抗マウスIgG(H+L)二次抗体、Alexa Fluor 647。コンクntレーション2 mg / mL。https://www.thermofisher.com/antibody/product/Donkey-anti-Mouse-IgG-H-L-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-31571
抗ヒト CD107a-PE (LAMP1)BioLegend328607クローン H4A3.濃度400&マイクロ;g/mLです。http://www.biolegend.com/pe-anti-human-cd107a-lamp-1-antibody-4967.html
反ヒトCD45 - AF488BioLegend304017クローンHI30. http://www.biolegend.com/alexa-fluor-488-anti-human-cd45-antibody-2738.html
抗ヒトCD45 - PE BioLegend304008クローン HI30. 
http://www.biolegend.com/pe-anti-human-cd45-antibody-708.html 対ヒトCD45-AF647 BioLegend304018クローン HI30. 
http://www.biolegend.com/alexa-fluor-647-anti-human-cd45-antibody-2739.html Anti-LC3 (Human) mAb clone 4E12MBL International CorporationM152-3Clone 4E+12. 濃度 2 mg/mL. https://www.mblintl.com/products/m152-3
抗SQSTM1 / p62抗体 [EPR4844] - オートファゴソームマーカー (Alexa Fluor 488)abcamab185015クローン EPR4844. 濃度0.5 mg / mL。http://www.abcam.com/sqstm1-p62-antibody-epr4844-autophagosome-marker-alexa-fluor-488-ab185015.html
クロロキン二リン酸塩Sigma-AldrichC6628-25G
クレンザー - コールター クレンツ ベックマン・コールター8546931容器に200 mLのクレンザーを充填します。  https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/page/itemDetails?itemNumber=8546931#2/10//0/25/1/0/asc/2/8546931///0/1//0/
DAPI Stain 5 mg/mLMilliporeSigma508741http://www.emdmillipore.com/US/en/product/DAPI-Stain---CAS-28718-90-3---Calbiochem,EMD_BIO-508741
Debubbler - 70% IsopropanolMilliporeSigma1.3704容器に200 mLのデバブラーを充填します。  http://www.emdmillipore.com/US/en/product/2-Propanol-70%25-%28V%2FV%29-0.1-%C2%B5m-filtred,MDA_CHEM-137040?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F
ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水 10xミリポアシグマBSS-2010-B Ca++Mg++ フリー 
ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水1xミリポアシグマBSS-1006-BPBS Ca++Mg ++フリー 
Earle's Balanced Salt Solution 1xGibco14155
Fetal Bovine SerumHyCloneSH30071.03
ホルムアルデヒド、10%、メタノールフリー、Ultra PurePolysciences, Inc.04018これが4%と1%のホルマリンに使用されているものです。注意:ホルマリン/ホルムアルデヒドは、吸入および飲み込むと有毒です。 目、呼吸器系、皮膚に刺激を与えます。 吸入や皮膚接触により感作性を引き起こす可能性があります。目に重大な損傷を与える恐れがあります。 潜在的ながんの危険性があります。 http://www.polysciences.com/default/catalog-products/life-sciences/histology-microscopy/fixatives/formaldehydes/formaldehyde-10-methanol-free-pure/
ハンクス平衡塩溶液 1xGibco14175
Jurkat, Clone E6-1 (ATCC TIB-152)ATCCTIB-152https://www.atcc.org/products/all/TIB-152.aspx
MEM Non-Essential Amino Acids 100xHyCloneSH30238.01
MIFC - ImageStreamX Mark IIMilliporeSigma100220405nm、488nm、642nmのレーザーを搭載した2台のカメラImageStreamX Mark IIを使用しました。 http://www.emdmillipore.com/US/en/life-science-research/cell-analysis/amnis-imaging-flow-cytometers/imagestreamx-Mark-ii-imaging-flow-cytometer/VaSb.qB.QokAAAFLzRop.zHe,nav?cid=BI-XX-BDS-P-GOOG-FLOW-B325-0006
MIFC解析ソフトウェア - IDEAS 6.2MilliporeSigma100220MIFC のコンパニオン ソフトウェア (ImageStreamX MKII)。 IDEASバージョン6.2
MIFCソフトウェア - INSPIREMilliporeSigma100220これは、MIFC(ImageStreamX MKII)を実行するソフトウェアです。INSPIREバージョン200.1.388.0
PE抗ヒトCD107a(LAMP-1)抗体クローンH4A3BioLegend328608 http://www.biolegend.com/pe-anti-human-cd107a-lamp-1-antibody-4967.html
ペニクリン/ストレプトマイシン/グルタミン溶液100xHyCloneSV30082.1
リンス-超純水または脱イオン水NANA超純水、脱イオン水なら何でも使えます。容器に900mLのリンスを入れます。
RPMI-1640 Medium 1xHyCloneSH30027.01
シース - PBSMilliporeSigmaBSS-1006-Bこれはダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水 1X Ca++MG++フリー. 容器に900mLのシースを入れます。
シリコーン化ポリプロピレン微量遠心チューブフィッシャーブランド02-681-320フィッシャーブラン シリコーン化低保持マイクロ遠心チューブ 1.5 mL https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-siliconized-low-retention-microcentrifuge-tubes-8/p-193936
ピルビン酸ナトリウム溶液 (100 mM)HyCloneSH30239.01
滅菌器 - 0.4 - 0.7% 次亜塩素酸VWRJT9416-1これは、クロロックス漂白剤を水で溶出させることで作ることができる10%のクロロックス系漂白剤です。容器に200mLの滅菌器を入れます。
システムキャリブレーション試薬 - SpeedBeadMilliporeSigma400041各チューブは~10 mLを保持します。  https://www.emdmillipore.com/US/en/life-science-research/cell-analysis/amnis-imaging-flow-cytometers/support-training/XDqb.qB.wQMAAAFLBDUp.zHu,nav 
T75 フラスコ ファルコン353136
TRITON X-100、タンパク質グレード洗剤、10% 溶液、滅菌ろ過ミルピポールシグマ648463-50MLhttp://www.emdmillipore.com/US/en/product/TRITON-X-100,-PROTEIN-GRADE-Detergent,-10%25-Solution,-Sterile-Filtered---CAS-9002-93-1---Calbiochem,EMD_BIO-648463
水、細胞培養グレード ハイクローンSH30529.03

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