Method Article

哺乳類のストレス顆粒としての細胞質叢を分類する方法

DOI:

10.3791/55656

⸱

May 12th, 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Rheumatology, Immunology, and Allergy, Brigham and Women's Hospital, 2Department of Medicine, Harvard Medical School, 3Department of Histology and Embryology, Poznan University of Medical Sciences, 4The Broad Institute of Harvard and M.I.T.

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ストレス顆粒（SG）は、様々なストレスにさらされた細胞内で形成される非膜性の細胞質構造である。 SGは、mRNA、RNA結合タンパク質、小リボソームサブユニット、翻訳関連因子、および様々な細胞シグナル伝達タンパク質を含む。このプロトコルは、 真の SGを検出し、特徴づけ、定量化するためのいくつかの実験的アプローチを使用するワークフローを記述しています。

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

細胞はしばしば突然の環境変化によって挑戦される。ストレス条件に曝露された細胞内で形成される細胞質リボ核タンパク質複合体であるストレス顆粒（SG）は、細胞代謝および生存の様々な局面に関与している。 SGは、細胞シグナル伝達経路、転写後遺伝子発現およびストレス応答プログラムを調節する。これらのmRNA含有顆粒の形成は細胞翻訳に直接関連する。 SGアセンブリは阻害された翻訳開始によって誘発され、SG分解は翻訳活性化または阻害された翻訳伸長によって促進される。この関係は、SGの構成によってさらに強調される。コアSG成分は、失われた翻訳開始前複合体、mRNA、および選択されたRNA結合タンパク質（RBP）である。 SGアセンブリーの目的は、ストレス応答タンパク質の翻訳の促進を可能にし、翻訳停止したハウスキーピングmRNAを隔離することによって細胞エネルギーを保存することである。アドイティ失われた翻訳予備開始複合体のような核構成要素には、SGは他のタンパク質およびシグナル伝達分子の過剰を含む。 SG形成における欠陥は、ストレスに対する細胞の適応を損ない、細胞死を促進する可能性がある。 SGおよび類似のRNA含有顆粒は、神経変性障害および癌を含む多くのヒト疾患に関連しており、最近RNA顆粒亜型の分類および定義に関心が高まっている。このプロトコールは、哺乳動物SGを特徴づけ、定量するためのアッセイを記載する。

Introduction

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細胞はストレスに応答するために多くのメカニズムを使用します。いくつかの応答は、転写後レベルで起こり、mRNA翻訳および/または安定性を調節することを含む1,2 。ストレス調節されたmRNAの翻訳停止および分解は、特異的な非膜性細胞巣の形成に関連しており、最もよく特徴づけられているのはストレス顆粒（SGs​​） 3である。 SGは、ストレス（ 例えば、酸化、熱ショック、栄養飢餓、ウイルス感染）に応答して、翻訳拘束細胞に非翻訳mRNPを集中させる細胞質病巣である4 。非翻訳mRNAに加えて、SGは翻訳開始因子、RNA結合タンパク質、および様々なシグナル伝達タンパク質を含む5 。 SGは阻害されたタンパク質翻訳および改変されたRNA代謝のバイオマーカーであり、細胞生存およびアポトーシス、シグナル伝達経路に関連しているs、核プロセス5 。

SGは動的エンティティであり、それらの形成は細胞翻訳6の状態に密接に関連している。一見しっかりした外見にもかかわらず、ほとんどのSGタンパク質成分は、滞留時間が秒で急速に出入りする。 SGは数分から数時間持続しますが、その構成要素のほとんどは急速....

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1.細胞の準備

  1. 図1Aに示すように、オートクレーブしたカバーガラスを24ウェルプレートの12ウェルに加える。これは、各カバースリップを拾うために真空に取り付けられた滅菌パスツールピペットを用いて行うことができる。穏やかに井戸の側面にあるカバースリップをタップして吸引を解放し、カバースリップが井戸に落ちるのを許します。
  2. プレート1×10 5 U-2 OS（U2OS）骨肉腫細胞を、最終容量500μLの培地で1ウェルあたり1個ずつ接種した。プレートの側面を上下左右に数回動かして、細胞が均等に分布するようにします。
  3. 優しくP1000チップでカバースリップを押し下げて、カバースリップがウェルの底にあり、カバースリップの下に泡がないことを確認します。

2.ストレス細胞

  1. 翌日、細胞が均等に分散し、カバースリップ全体に均等に集まることを確認するためにプレートを目視検査し、saメープルは、結果の再現性に悪影響を与える可能性があります。倒立組織培養顕微鏡で10倍の対物レンズを使用する。
  2. 培地を37℃に予熱する。冷たい衝撃や熱衝撃の原因となるので、冷たいまたは熱い培地を細胞に塗布しないでください。
  3. 予熱した培地で薬物を希釈する。異なる薬物濃度ごとに、500μLの培地を含む2つのウェルを調製する。ピペッ....

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ストレス誘発病巣は必ずしもSGではない。 SGは、mRNA、翻訳開始因子、およびRNA結合タンパク質を含み、活性翻訳と平衡状態にある細胞質病巣として分類される。上記のプロトコルは、与えられたストレスが真正 SGを誘導するかどうかを特徴付けるためのテンプレートとして用いることができる。

SGは、タンパク質およびmRNAの両方を含む他の既知のSGマーカーと共存する。 SAおよびVRBは、G3BP1、eIF4GおよびeIF3bを含む細胞質病巣を誘導する（ 図2A ）。これらのマーカーの共局在化は、ラインスキャン分析および増大した倍率を有する単一チャネル画像を用いて確認される（ 図2A ）。さらに、これらの病巣は、ポリA FISHによって示されるようにMrnaを含み、オリゴ（dT）シグナルはG3BP1免疫蛍光シグナルと共局在する（ 図2B .......

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Discussion

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複数の疾患における免疫組織学的研究によって証明されるように、慢性ストレスは、異なる細胞内病巣の形成をもたらす。例えば、ほとんどの神経変性疾患は、不溶性タンパク質の細胞内凝集物を特徴とする。このような凝集体中のSG結合タンパク質の存在は、しばしば、そのような病巣がSGであると結論付けるための基礎である。新しいストレス刺激で処理した細胞でSGマーカー陽性細胞質病巣が観察された場合も同様の結論が導かれる。このプロトコルは、 真の SGを識別するための簡単なワークフローを提供します。

組成とダイナミクスの両方の特徴付けを含む、推定SGsがそのように確認されるためのいくつかの基準が満たされなければならない。第1に、SGは翻訳停止したmRNPを含む細胞質の病巣である。したがって、第1のアプローチは、2つの顕微鏡ベースの技術、すなわちポリA-FISHおよびIFを使用してそれらの組成を特徴付けることである。 FISHは視覚的に信頼できる方法ですSGと共局在するmRNAを生成する。オリゴ（dT） 40プローブを用いて、ストレス条件下でSGにパックするポリアデニ.......

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者は何も開示することはない。

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

私はイワノフとアンダーソンのラボのメンバーに、この原稿に関する有益な議論とフィードバックを感謝します。この研究は、ポーランド国立科学センター（UMO-2012/06 / M / NZ3 / 00054からWSへの付与）の国立衛生研究所[PA、NS094918からPIへのGM111700およびCA168872]によって支持された。 WSはまた、ポーランドの科学と高等教育省（モビリティプラスプログラム）とポーランド・アメリカのフルブライト委員会が米国での彼の研究の財政的支援を認めていることも認めています。

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
U-2 OS ATCCATCC®HTB-96&トレード;一般的には「U2OS」と書かれています
文化は37°Cです。10% FBS/DMEM 中の 5% CO2
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)Corning10-013-CV4.5 g/L グルコース、ピルビン酸、フェノール red
10% FBS、10 mM HEPES、ペニシリン/ステプトマイシン
プレウォーム先行薬希釈液
Fetal Bovine Serum (FBS)SigmaF2442-500ml
HEPES (1 M)のサプリメントに使用サーモフィッシャーサイエンティフィック15630-080培地の補充に使用
ペニシリン連鎖球菌シグマP0781-100ml培地の補充に使用
24ウェルプレートCostar3524
ラボティッシュ(キムワイプ)ムテックサイエンス34120
成長用カバーガラス カバーグラスフィッシャーサイエンティフィック12-545-82使用前にオートクレーブ滅菌済み
組織培養フード内で無菌状態に保ちます
亜ヒ酸ナトリウム(メタ)亜ヒ素≥90%(SA)シグマS7400-100Gに1M濃度まで溶解し、次に100&マイクロに希釈します。M を作業原料として
ビノレルビン (VRB)TSZ CHEMRS055に溶解して 10 mM
ピューロマイシンSigmaP9620翻訳レベル(リボプロマイシル化)の評価に使用
-活性翻訳とのSG接続の評価に使用
水で10mg/mLに希釈
エメチン二塩酸塩水和物SigmaE2375一般的な翻訳レベルを評価するためにピューロマイシンと組み合わせて使用
活性翻訳
とのSG接続を評価するために使用されます -水で10 mg/mLに希釈
クロヘキシミド(CHX)シグマC4859活性翻訳
水で10 mg/mLに希釈します
リン酸緩衝生理食塩水(PBS)ロンザ / VWR95042-486免疫蛍光
用洗浄緩衝液パラホルムアルデヒド試薬グレード、結晶性(PFA)シグマP6148-500Gヒュームフード内の高温PBSに4%溶液を作り、溶解するまで攪拌します
アリコートは-20°Cで保存できます。C 数ヶ月間
危険、換気を使用
特殊廃棄物に捨て
メタノール、ACSBDH/VWRBDH1135-4LP-20°Cに予冷;C 使用前
特殊廃棄物に捨て
通常の馬血清 (NHS)サーモフィッシャーサイエンティフィック31874PBS
で5%に希釈 アジ化ナトリウムを4°Cで保存します。C
免疫蛍光用ブロッキング溶液
エタノール、ピュア、200プルーフ (100%)、USP、KOPTECDecon Labs / VWR89125-188水で70%に希釈
Fisherbrand Superfrost Plus 顕微鏡スライドFisherbrand12-550-15
マウス抗 G3BP1 抗体 (TT-Y)Santa Cruzsc-819404 >C
1/100 dilution
rabbit anti eIF4G antibody (H-300)Santa Cruzsc-113734 °C
1/250希釈
ヤギ抗eIF3η(N-20) 抗体Santa Cruzsc-16377eIF3η は eIF3b
Store at 4 °C
1/250 希釈
マウス抗ピューロマイシン 12D10 抗体ミリポアMABE3434 >C
1/1,000 希釈
Cy2 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)Jackson Immunoresearch715-225-150Reconfigure in water per manufacturer'命令は 4 °C で格納されます。C
1/250 希釈
Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)Jackson Immunoresearch711-165-152メーカーごとに水に再構成命令は4°Cで保存されます。C
1/2,500 希釈
Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Goat IgG (H+L)Jackson Immunoresearch705-175-147メーカーごとに水で再構成します。命令は4°Cで保存されます。C
1/250 希釈
Hoechst 33258 溶液Sigma94403-1ML二次抗体
ストック溶液 0.5 mg/mL を dH20 でインキュベートし、光から保護します
-4 °C で保存します。C
Cy3 ストレプトアビジンジャクソン免疫研究016-160-084メーカーごとに水で再構成sの説明書を作成し、4°Cで保存します。C
1/250 希釈オリ
ゴ-(dT)40xプローブ ビオチン化統合 DNA テクノロジーズ (IDT)/水で 100 ng/mL に再構成し、分注して -20 °C で保存します。C
ハイブリデーションバッファーで希釈 使用前に1/50
カスタムオーダー
ハイブリデーションボックス//底に加湿紙を追加して、任意の保管スライドボックスを備えたモイスチャーチャンバーを作ります
- 使用前にボックスを温める
20x SSCバッファーサーモフィッシャー アンビオンAM9763RNase フリーウォーターを使用して2x SSCに希釈します フリーウォーター(DEPC処理)
RT
FISH
用ウォッシュバッファーで保存してください。PerfectHybPlusハイブリダイゼーションバッファーSigmaH7033-50ml用ブロックおよびプローブインキュベーションバッファー
/5 gの「冷水溶性」PBS
の20mLにポリ(ビニルアルコール) 超音波処理により混合し、続いてRT
でO / Nを攪拌します5 mLのグリセロールと0.2 mLの20%アジ化ナトリウムを加え、RT
で16時間攪拌します 20,000gで20分間遠心分離し、大きなペレット
アリコート粘性液体を捨てます。 -20°Cでの長期保管。C、4°Cで1週間。C
パラフィルム "M"シグマP7793-1EA
ポリ(ビニルアルコール)シグマP-8136-250Gビノールを作る試薬
グリセロールSigmaG5516-100MLビノール
アジドナトリウムフィッシャーサイエンティフィックS2002-5Gブロッキング溶液とビノール
水で20%希釈します
培地 キ水 水 シる る FISHスライド封入剤自家製を作る試薬

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Holcik, M., Sonenberg, N. Translational control in stress and apoptosis. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (4), 318-327 (2005).
  2. Yamasaki, S., Anderson, P. Reprogramming mRNA translation during stress. Curr Opin Cell Biol. 20 (2), 222-226 (2008).
  3. Buchan, J. R.

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Tags

Stress GranulesCytoplasmic FociRNA GranulesImmunofluorescence AssayFluorescence MicroscopyPoly A FISHG3BP1 MarkerTranslation InhibitionMammalian Cell StressRNA Binding Proteins

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