組織工学のための血管新生単位としてマウスの脂肪組織由来の微小血管フラグメントの単離

サマリー

我々は、有望な血管新生単位を表し、脂肪組織由来の微小血管断片を単離するためのプロトコルを提示します。それらはインビトロ処理に必要とせず、従って、組織工学の異なる分野でワンステップprevascularizationために使用することができる、迅速に分離することができます。

要約

機能的微小血管ネットワークは、改変された組織構築物の生存および統合のための極めて重要重要です。この目的のために、いくつかの血管新生およびprevascularization戦略が確立されています。しかし、ほとんどの細胞ベースのアプローチは、微小血管ネットワークの形成のために時間のかかるインビトロの工程を含みます。したがって、それらは手術ワンステップ手順には適していません。脂肪組織由来の微小血管フラグメント（AD-MVF）が有望な血管新生単位を表します。彼らは簡単に脂肪組織から単離され、機能的な微小血管の形態を示すことができます。また、彼らは急速にin vivoでの移植後の新しい微小血管のネットワークに組み立て直します。また、広告-MVFは、リンパ管新生を誘導することが示されています。最後に、彼らはさらに高い血管新生の可能性に寄与し得る間葉系幹細胞の豊富な源です。以前の研究では、我々は顕著vascularizatiを示しました設計骨や皮膚代替で広告-MVFの容量に。本研究では、我々は、マウスの脂肪組織からの広告-MVFの酵素を単離するための標準化されたプロトコルについて報告します。

概要

組織工学は、 インビボの対応^1,2 に動作不能の機能を回復または増強、維持、組織および器官代替の製造に焦点を当てています。設計組織構築物の運命は決定的に十分な血管新生³に依存します。これらの構成要素内の微小血管ネットワークが階層的に受信者の血管系⁴にinosculation後の効率的な血液灌流を可能にするために動脈、毛細血管、および細静脈で整理する必要があります。このようなネットワークの生成は、組織工学における主要な課題の一つです。この目的のために、実験的な血管新生戦略の幅広いスペクトルは、最後の二十年^5、6の上に導入されました。

血管新生のアプローチは、設計TISSに受信者の微小血管の成長を刺激しますそのような成長因子⁷の取り込みなどの構造的または物理化学的骨格修飾によりUEの、。しかし、大規模な3次元構造の血管新生のために、血管新生依存戦略が著しく微小血管^8の開発の遅い成長速度によって制限されています。

組織内の機能微小血管ネットワークの世代が前に彼らの移植の⁹に構築するためにこれとは対照的に、prevascularizationの概念が目指しています。従来prevascularizationは、足場内の内皮細胞、壁画細胞または幹細胞¹⁰などの血管形成細胞の共培養を含みます。微小血管ネットワークを形成した後、prevascularized構築物はその後、組織欠損に移植することができます。それは複雑で時間のかかるインビトロに基づいているため、注目すべきは、このprevascularizationアプローチは、臨床現場で適用することは困難です</ em>の主要な規制のハードル⁹によって制限されている手順、。したがって、広範な臨床応用のために、より適している小説prevascularization戦略の開発の必要性が依然として存在しています。

そのようなprevascularization戦略は、脂肪組織由来の微小血管フラグメント（AD-MVF）のアプリケーションであってもよいです。 AD-MVFラット^11、12及びマウス¹³の脂肪組織から大量に収穫することができる強力な血管新生単位を表します。彼らは細動脈、毛細管、及びルーメンと生理的な微小血管形態を示す細静脈血管セグメント、および安定血管周囲細胞^14、15から成ります。このユニークな機能は、前培養することなく、組織欠損に広告-MVF-シードの足場の即時注入することができます。そこでは、広告-MVFは急速で組み立て直します機能的な微小血管ネットワークへ。また、AD-MVFは、さらにその打撃再生能力に寄与し得る間葉系幹細胞¹⁶の豊富な供給源を表します。したがって、AD-MVFはますます組織工学^{14、15、17、18、19、20、21}の異なる分野で使用されています。

広告-MVFの単離は、もともとラット^11、12に設立されました。ここで、我々は精巣上体脂肪パッドからマウス広告-MVFの標準化された単離を可能にするプロトコルを記述します。これは、トランスジェニックマウスモデルを使用して広告MVF機能の根底にある分子メカニズムさらなる洞察を提供することができます。

プロトコル

すべての手順は、実験動物の使用のための健康ガイドラインの国立研究所に従って実行し、施設のガイドライン（LandesamtエリーゼSoziales、GesundheitウントVerbraucherschutz、アプト。Lebensmittel-ウントVeterinärwesen、Zentralstelle、ザールブリュッケン、ドイツ）を追跡しました。

手術器具の調製

1. 10％ウシ胎児血清（FCS）、100U / mLのペニシリン、0.1mg / mlのストレプトマイシン、準備解剖ハサミ、外科用鉗子、小さな調製はさみ、微細鉗子及び15mLのダルベッコ改変イーグル培地（DMEM滅菌ペトリ皿を保ちます）精巣上体脂肪パッドを収穫するため。
2. 5分間消毒液に手術器具を公開します。あるいは、（; 121℃、20分間蒸気滅菌）それらを滅菌。

2.動物および麻酔

1. 慎重に研究のために示されているように、マウスの系統を選択し、調査中の対象。
   注：本研究では、精巣上体脂肪の収穫のためのドナーとしてのオスの野生型C57BL / 6マウスを使用しました。興味深いのは、AD-MVFは、トランスジェニック緑色蛍光タンパク質（GFP）陽性ドナー動物（C57BL / 6-TG（CAG-EGFP）1Osb / ^J）22から単離することができます。これは、断片は、GFP陰性野生型マウス¹⁴への移植後のGFPの免疫組織化学染色によって容易に検出されている主な利点を負いません。
2. キシラジン（15ミリグラム/ kg）およびケタミン（/ kgを75 mg）を腹腔内注射で動物を麻酔。動物が深く無応答とつま先のピンチを実行することにより、麻酔をかけていることを確認してください。ドナー動物の脂肪、収穫後に屠殺されているとして、目の潤滑剤が示されていません。
   注：鎮痛および外科無菌性は、実験が計画されている国や機関のそれぞれのガイドラインと一致していることを確認してください。

精巣上体脂肪パッドのル "> 3。収穫

1. 操作テーブルに動物を転送します。手術用実体顕微鏡下仰臥位で動物を置き、つま先のピンチを使用して深い麻酔を確認。
2. 手術用ドレープにそれらをテーピングで足を固定化し、解決策を消毒し、腹部を消毒します。
3. 解剖ハサミで下の筋肉層のない腹部の皮膚を分離します。
4. 解剖ハサミで正中開腹術を実行し、横方向に腹壁のフラップを展開。
5. 両側精巣、精巣上体および微細鉗子（ 図1）を用いて、精巣上体脂肪パッドを識別する。 脂肪パッドの糞便汚染を防止するために、腸の構造に害を与えないでください。
6. 実体顕微鏡下の小さな準備ハサミと細かい鉗子で精巣上体脂肪パッドを収穫。 副睾丸脂肪の間に数mmの安全マージンを保ちます偶然の精巣上体収穫のリスクを減らします。
   注：この手順は、実体顕微鏡なく行うことができます。しかし、これはさらに精巣上体および精索の不慮の損傷のリスクを高める可能性があります。
7. 細胞実験室への輸送のために、37℃で予備加熱DMEMの15 mLを含むペトリ皿に精巣上体脂肪パッドを転送します。
8. 腹部大動脈または頸椎脱臼を切開することによって動物を生け贄に捧げます。

広告-MVFの4分離

1. リン酸緩衝生理食塩水（PBS）15mLの滅菌14-mLのポリプロピレン（PP）チューブ、滅菌50mLの三角フラスコ、滅菌した1.5 mLのコニカルマイクロ遠心チューブ、滅菌微細なハサミで三枚の滅菌ペトリ皿を準備します。
2. 層流フードの下でPBS 15mLでペトリ皿に三回脂肪パッドを洗浄します。
3. 14-mLのポリプロピレンチューブに脂肪を移します。 Tによって（ML）に採取脂肪組織の量を決定します彼チューブスケール。均質な組織懸濁液が得られるまで微細はさみで機械的に脂肪組織をミンチ。
4. ピペットを測定する10ミリリットルを用いて50 mLの三角フラスコにコラゲナーゼNB4G（0.5 U / mLのPBS）2つの容量と細分化した組織を移します。総量は、ステップ4.3で測定された脂肪組織の容積の3倍になります。 37℃、5％CO ₂を含む加湿大気条件：自動攪拌機（25ミリメートル磁気攪拌棒のサイズ）によって激しく攪拌しながら10分間インキュベーター内組織消化を行います。
5. 消化を停止させることができるかどうかを判断するために顕微鏡下で消化された組織の小部分（10μL）を観察します。消化物は、主に酵素消化工程（ 図2）を停止するための適切なポイントを示し、次の単一細胞への「遊離」AD-MVFが含まれていることを確かめます。
   注：この手順は、手順と経験を必要とし、品質のために重要です広告-MVFを単離しました。広告-MVFせずに、単一細胞懸濁液中の脂肪の消化結果を延長しました。
6. PBS / 20％FCS 2つの容量を有する酵素を中和します。総体積は、ステップ4.4において、細胞容器懸濁液の体積の3倍となります。新しいPPチューブにバック細胞血管懸濁液を移します。
7. 重力によって脂肪残りからAD-MVFを分離するために37°Cで5分間懸濁液をインキュベートします。次いで、注意深く1-mLの精密ピペットで主脂肪上清を除去します。サスペンションは、無脂肪のように表示されるまで、100-μLの精密ピペットでこのサイクルを数回繰り返します。
8. 50 mLのコニカル遠心管の上部に500μmのフィルターを置きます。残りの脂肪塊を除去するために濾過膜上に14-mLのPP管からの10-mLのメスピペットを用いて細胞血管懸濁液を移します。個々のAD-MVF計画実験のため分離の数に応じて新たな14-mLのポリプロピレンチューブに濾過した懸濁液を移します。
   注：のためにvitrで微小血管ネットワークの形成に焦点を当てOアッセイは、さらに顕微鏡分析の間に結像品質を改善するために、細胞容器懸濁液を精製することが有益であり得ます。この目的のために、懸濁液をさらにフィルター上に集めAD-MVFから単一細胞を除去するために20μmのフィルターで一度ろ過してもよいです。
9. 遠心分離機AD-MVFを含むペレットを得るために、細胞容器懸濁液（600×gで、5分間、室温）。
10. 1mLのが残されるまで遠心分離後、上清を除去します。この1mLのAD-MVFでペレットを再懸濁し、1.5 mLのコニカル遠心チューブに懸濁液を移します。
11. 遠心分離ペレットを得るためにマイクロチューブのAD-MVF懸濁液（600×gで、5分間）。
12. PBS / 20％FCSの必要な最終体積でペレットを再懸濁し、上清を取り除きます。
    注：分離株あたりの広告-MVFの数は、顕微鏡の計数によって評価することができます。この目的のために、最終細胞-vesseの1/10L懸濁液をPBSで1:10に希釈し、この希釈液の100μLを96ウェルプレートのウェルに移します。容器状の形態を呈するAD-MVFの全体数を計数し、全単離するために外挿されます。必要なAD-MVF濃度および精製は、個々に、インビトロまたはAD-MVF のin vivoアプリケーションでそれぞれに適合させることができます。これは、微小血管ネットワーク形成または組織欠損にインビボで移植するための足場上のAD-MVFの播種のインビトロ分析のためのコラーゲンゲルにおけるAD-MVFの埋め込みを含むことができます。

結果

本研究では、7〜12ヶ月齢のオスの野生型C57BL / 6マウス（35±1グラムの体重の平均）から、脂肪組織で6 AD-MVF単離手順を行いました。 図1は、後続の機械的および酵素AD-MVF分離有するマウス精巣上体脂肪パッドの採取を示す図です。脂肪の収穫に必要な時間は30分であり、AD-MVFの単離のために120分でした。合計では、手順が150分を要しました。

我々は、ドナー動物あたりの脂肪組織の1.2±0.1ミリリットルを回収しました。脂肪のこの量は、mL当たり42,000±2,000の広告-MVFの分離を可能にしました。単離されたAD-MVFの平均長さは42±1μmで（ 図2A）でした。 図2Bに示すように、酵素消化の持続時間は、顕微鏡制御により決定しました。広告-MVFは、階層的なVESとの典型的な微小血管の形態を示しましたSELセグメント（ ...

ディスカッション

本研究では、AD-MVFの単離のための十分に確立プロトコルを提示します。マウスの脂肪組織からの広告-MVFを取得することは、いくつかの重要なステップで簡単な手続きです。マウスは異なる皮下および腹腔内脂肪沈着を示します。以前にラットに関して記載したように、AD-MVFの単離のために最も適した脂肪源は^、より大きな血管¹¹との均質構造と最小限の汚染^、12彼らのサイズに起因精巣上体脂肪パッドです。対照的に、マウスにおける皮下脂肪沈着ははるかに小さく、周囲の組織に対してより接着性です。しかし、精巣上体脂肪パッドの切除は、精子と採取した組織の汚染が生じ、精巣上体および精索の不慮の損傷のリスクを負います。したがって、精巣上体、精巣と精索の識別は、この手順では非常に重要です。また、脂肪パッドはrapidlする必要がありますyはex vivoで組織の損傷を最小限に抑えるために収穫した後に処理します。最後に、マウスの精巣上体脂肪パッド²³の血管新生の主要な年齢依存性のばらつき...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
1.5 mL円錐形微量遠心チューブ	VWR、ケルスターバッハ、ドイツ	700-5239
100-µL精密ピペット	Eppendorf, Hamburg, Germany	4920000059
10-mL measuring pipette	Costar, Corning Inc., New York, USA	4488
14-mL PP tubes	Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany	187261
1-mL精密ピペット	Eppendorf, Hamburg, Germany	4920000083
500-µmフィルター(pluriStrainer 500 µm)	HISS Diagnostics, Freiburg, Germany	43-50500-03
50-mL 円錐形遠心分離管	Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany	227261
50-mL Erlenmeyer flask	VWR, Kelsterbach, Germany	214-0211
96-well plate	Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany	65518
cell detachment solution (Accutase)	eBioscience,San Diego, CA USA	00-4555-56
C57BL/6 mice	Charles River, Cologne, Germany	027
C57BL/6-Tg(CAG-EGFP)1Osb/J mice	The Jackson Laboratory, Bar Harbor, USA	003291
CD117-FITC	BD Biosciences, Heidelberg, Germany	553373
CD31-PE	BD Biosciences, Heidelberg, Germany	553354
コラゲナーゼ NB4G	Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Germany	17465.02	酵素活性についてメーカーによってロット試験
解剖ハサミ	Braun Aesculap AG &CoKG、メルズンゲン、ドイツ	BC 601
DNA結合色素(ビスベンズイミドH33342)	Sigma-Aldrich、タウフキルヒェン、ドイツ	B2261
ダルベッコの修飾イーグル培地(DMEM)	PAN Biotech、リッケンバッハ、ドイツ	P04-03600
子牛胎児血清 (FCS)	Biochrom GmbH、ベルリン、ドイツ	S0615
ファイン鉗子	S&T AG, Neuhausen, Switzerland	FRS-15 RM-8
Fine scissors	World Precision Instrumets, Sarasota, FL, USA	503261
Dermal skin Substitute (Integra)	Integra Life Sciences, Sain Priest, France	62021
Ketamine	Serumwerk Bernburg AG, Bernburg, Germany	7005294
M-IgG2akAL488	eBioscience, San Diego, CA USA	53-4724-80
Octeniderm (消毒液)	Schülke &Mayer, Norderstedt, Germany	118211
Penicillin/Streptomycin	Biochrom, Berlin, Germany	A2213
Petri dish	Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany	664160
Phosphate-buffered saline (PBS)	Lonza Group, Basel, Switzerland	17-516F
pluriStrainer 20-µm(20 µm filter)	HISS Diagnostics, Freiburg, Germany	43-50020-03
Rat-IgG2akFITC	BD Biosciences, Heidelberg, Germany	553988
Rat-IgG2akPE	BD Biosciences, Heidelberg, Germany	553930
小型調製ハサミ	S&T AG、ノイハウゼン、スイス	SDC-15 R-8S
外科用鉗子	Braun Aesculap AG &CoKG、メルズンゲン、ドイツ	BD510R
テープ (Heftpflaster Seide) 1.25 cm	フィンク &Walter GmbH, Mechweiler, Germany	1671801
キシラジン	Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Germany	1320422
α-SMA-AL488	eBioscience, San Diego, CA USA	53-9760-82	細胞内標識にはさらにCytofix/Cytopermが必要です (BD Biosciences, Heidelberg, Germany; #554722)