方法論記事

アレルギー性鼻炎および/または喘息を有する中国南部の草花花粉アレルゲンに関する研究のための成分分析による診断アプローチ

DOI：

10.3791/55723

⸱

2017年6月4日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Respiratory Disease, 2National Clinical Research Center of Respiratory Disease, 3Guangzhou Institute of Respiratory Diseases, 4Department of Allergy and Clinical Immunology, First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University, 5Department of Respiratory Medicine, Sixth Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この研究は、アレルギー性鼻炎および/または喘息を有する中国南部の患者のコホートにおいて、花粉アレルゲンに対する感作性を研究するための成分分析アプローチを使用するプロトコルを記載している。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

草花花粉に対する感作は、アレルギー性気道疾患の世界的なリスクを引き起こす。予防は花粉アレルゲンの現地調査に依拠していますが、このトピックに関するデータは中国南部では限られています。利用可能なデータは、自己報告アンケート、皮膚プリックテスト、および粗抽出物を用いた全または特異IgE試験によって得られた。多くの理由から、これらの方法は信頼性が低い。アレルギー性鼻炎および/または喘息を有する広州広州（中国南部最大の都市およびその郊外）の患者の集団におけるバミューダグラス、ティモシーグラス、およびハンマースクランデルアレルゲンに対する血清sIgE反応性を、完全自動化イムノアッセイ分析器を成分として用いて調べた（CRD）ツール。

初めて、アレルギー性鼻炎および/または喘息を有する中国の南部で、バミューダグラスのsIgE陽性率のかなりの有病率が実証された。これらの患者では、感作の微妙な有病率後者の2つはこの地域では一般的ではないため、交差反応性から生じる可能性のあるティモシー草とヒューマリススキャーンズにも注目された。これはまた、アレルゲン成分の検出によっても支持された。

全自動イムノアッセイ分析装置は、地域、研究所、施設間、および時間の経過とともに満足できる一貫性を提供することができる。装置の自動性は、CRDの出現前に容易に明らかにされなかった標準化された検出を可能にすることができる。

これは、中国南部の花粉アレルゲンに対する感作性を調べるためにCRDアプローチを用いた研究である。それは文献の現在の証拠に追加されます。これらの知見を検証するためには、今後の研究が必要である。しかし、CRDは有用なツールですが、全自動イムノアッセイアナライザーで行った調査結果は、他の検査室の調査、臨床評価、医師の専門知識を代用するべきではありません。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

草花花粉は、免疫グロブリンE（IgE）に関連するアレルギーの約50％を占め、空気の性質上、アレルギー性気道疾患、特に喘息およびアレルギー性鼻炎1,2,3,4の世界的なリスクを課している。ある地域における花粉アレルギーの予防は、花粉アレルゲンの局所分布に関する情報に依存している。残念なことに、感作性アレルゲンのスペクトルは場所によって異なり、一般に地域特異性として知られている。

広大な東アジア域である中国では、過去数十年の間にこの国の南部から入手可能な限られたデータにより、草花粉感作の地域特異性はさらに複雑になっている。このようなデータの欠如は、芝生全体の花粉感受性を示すことを困難にしているこの大国での情報化6 。さらに、中国南部の非常に限られたデータは、主に自己申告のアンケート、皮膚の枝肉検査（実験的血清検査ではなく）、総IgE測定（アレルゲン特異的IgE（sIgE）ではなく）、およびsIgE検出アレルゲン成分分子ではなく）。

特定のアレルゲンが関係している場合、アレルギー症状の自己報告は信頼できない場合があります。皮膚穿刺検査は、広くアクセス可能ではあるが、標準化されていない粗製アレルゲン抽出物の使用を伴い、それ自体が結果の解釈を混乱させる他の感作成分を含有する可能性がある。皮膚穿刺試験の信頼性は、アレルギー師または専門看護師による最新のヒスタミン使用、最近のヒスタミン使用、および患者コンプライアンス（幼児にとっては時には非常に困難）にも非常に依存します。全IgEはアレルギーのスクリーニングには有用であるが、患者のアレルゲンを引き起こす。さらに、ほとんどすべてのアレルゲンは、多数のアレルゲン成分分子を含む。主要な成分（ すなわち、ハウスダストダニからのDer p 1およびDer p 2）に対する感作は、「本物の」アレルギー（他のアレルゲンとの交差反応に起因する偽陽性ではなく、特定のアレルゲンに対するアレルギー）を示唆し得るが、感作（ すなわち、交差反応性のDer p 10、トロポミオシン）は、そうではない可能性がある。

CRD（component-resolved diagnostics）が導入される前に、これらの失望した挫折が中国のアレルゲン研究を妨げていました。 CRDは、組換えまたは精製されたアレルゲン分子を使用することによってアレルゲンの成分を正確に検出し、それによって測定を容易に定量化および特徴付けすることができる8 。過去数十年間に、アレルギー研究は、必然的に多くの無関係な成分を含むアレルゲンの粗抽出物を頻繁に使用した。これらの多くの共同成分は不活性であるが、時には交絡する陽性反応を引き起こすものもある。 CRDにおける組換えまたは精製されたアレルゲン分子の使用はこれを回避することができ、したがってより良好な試験精度を提供することができる。マイクロアレイで処理する場合、CRDアプローチは、個々の被験体における何百ものアレルゲン分子に対する感作を迅速にスクリーニングまたは同定する。中国南部での草花粉感作に関するうまく設計されたCRD研究は、現在のところ欠けている。理想的には、このような研究には、地理的にかなりの地域の人口が含まれ、中国で一般的に報告されている芝生の花粉を考慮し、上述の技術的側面に取り組むべきである。臨床的関連性の実用レベルに到達し、血清サンプルの動員を容易にするために、吸入アレルゲンとしての草花粉に対する感作の早期調査は、一般集団ではなくアレルギー性呼吸障害患者に焦点を当てることもできる。

この作品は、CRDアプローチを用いてアレルギー性鼻炎および/または喘息を有する広東広域（中国南部最大の都市およびその周辺）の患者のバミューダグラス、ティモシーグラス、およびヒュームラススキャンンに対する血清sIgE反応性を試験するために使用される。これらの亜熱帯および温帯草花粉に対する感作に関するこれらの知見は、現在の文献に重要な証拠を追加している。

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プロトコル

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研究プロトコール（ヒト血清サンプルの使用を含む）は、広州医科大学第一附属病院倫理委員会によって承認された。すべての参加者は、独立して、または両親（子供の場合） を介して書面によるインフォームド・コンセントを提供した。このプロトコルはオンラインで登録されている（中国臨床試験登録番号、ChiCTR-DCC-13004003、http://www.chictr.org/cn/を参照）。

1.研究集団の同定

注：AIRは、中国南部でのアレルゲン検査のための患者の最もよく文書化された大規模なデータベースであるため、呼吸器疾患の主要な検査室（AIR-SKLRD）のアレルギー情報リポジトリが患者募集の主要な源である9,10。 AIRは、患者の血清サンプルを約10年間保存しています。簡単に説明すると、これらの貯蔵試料は、予め5mLのO静脈血を3,000 xgで10分間採取し、上清を回収した。血清サンプルを長期保存のために-80℃の冷蔵庫に入れた。患者の含有基準に合致したサンプルは、本研究でのすべての試験に使用する準備ができていた。

  1. AIRデータベースから、アレルギー性鼻炎および/または喘息を有する患者について、2013年1月から2015年6月までの間、草アレルゲンの血清検査を受けたデータを検索する。
  2. アレルギー性鼻炎および喘息に対するその影響（ARIA） 11および喘息に関するグローバルイニシアチブ（GINA） 12ガイドラインに従って、軽度から中等度のアレルギー性鼻炎および/または喘息を有する患者を選択する。それらを「スタディグループ」として割り当てます。
  3. 不完全な医療記録、フォローアップのために失われた患者、科学的目的のための血清サンプルの使用に関するインフォームドコンセントを拒否した患者、Iを同定した患者現在免疫療法または免疫調節剤にあるもの、または寄生虫感染を有することが判明しているものが含まれる。
  4. 同じ除外基準に従って非呼吸性アレルギー（ すなわち、湿疹、アレルギー性皮膚炎、および食物アレルギー）患者の現代コホートを選択し、それらを「対照群」とする。
  5. 検査所見に交絡作用を最小限に抑えるために、処方または治療を行う前に血清サンプルを採取したことを確認してください。この要件を満たさない血清サンプルは除外する。
  6. すべての科目が広州広域のすべての地域の永住者であることを確認してください（10年以上生まれています）。

2.研究フローとインタレストの測定

  1. 適格患者の血清サンプルをバイオバンクから回収する。アレルゲン/アレルゲン成分を試験するには、140μLの血清（100μLを含むデッドスペースを広げる）。
    注：この研究で各患者に必要とされる最大総血清容量は、3つの特異的なアレルゲンおよび8つのアレルゲン成分であり、sIgE =140μL* 11 =1,540μLである。
  2. この機器を使用する場合は、主にバミューダグラス、ティモシーグラス、およびヒューマリススキャンンの全アレルゲンに対するsIgEの血清サンプルを試験する。セクション3の指示に従ってください。
    注：これらの花粉は、バミューダの草13,14,15およびHumulus scandens 16が中国で広く報告されており、Timothy grass 17,18,19は熱帯から温帯の環境に住む典型的な植物種であるため、世界中で最も研究されています。
  3. 第二に、ステップ2.3で同定された血清サンプルを試験してバクーダ[Cyn d 1（g216）]、ティモシー[Phlp 1（g205）、Phl p 4（g208）、Phl p 5（g215）、Phl p 6（g209）]のアレルゲン成分に対するsIgEの存在についてのアレルゲン全体に対するsIgE ）、Phl p 7（g210）、Phl p 11（g211）およびPhl p 12（g212）]および交差反応性炭水化物決定基[CCD（o214）]。セクション3の指示に従ってください。

3.イムノアッセイ分析システムを用いた全自動試験手順

注：完全自動化され、7、8、9、10のいずれかに記載されているアレルゲン検査の全手順は、製造元のプロトコールに従います。

  1. 完全自動化イムノアッセイアナライザー（ 例えば、 ImmunoCAP1000）を開始し、それを用いて研究を通してイムノアッセイを行う。ビルトインの情報データ管理（IDM）コンピュータをオンにします。
    注：イムノアッセイの肛門yzerは日常的にスタンバイモードです。
  2. "Primary Power"をオンにして、 "System Power"をオンにして、内蔵ソフトウェアが起動するまで3分間待ちます。 「洗浄液をロードする」および「洗浄液をロードする」をクリックします。
  3. 各アレルゲン/アレルゲン成分試験のために、140μLの血清をバイアルに加える。血清140μLを含む各バイアルに、各患者に固有の識別番号を付けます。
  4. IDMインタフェースから、メニューをクリックして次の手順を実行します。
    1. IDMの "Request List"ウィンドウで "sIgE"が選択されたテスト方法であることを確認してください。
    2. サンプルチューブをサンプルラックに、品質管理チューブを品質管理ラックにバーコードでロードします。
      注：各患者について、最初に3つの特異的アレルゲンおよび8つのアレルゲン成分、または346 * 11（3,806）の試料チューブに対する試験が計画された。各サンプルチューブについて、3つの品質管理チューブ低レベル、中レベル、高レベルのsIgEコントロール（詳細は表の表を参照）が一致していました。最終的に、一次試験（ステップ2.3）において陽性と試験された58人の患者のみが、二次試験（ステップ2.3）においてさらに検査された。チューブの装填は、コンピュータコンソール上で自動的に設定することができます。
    3. "Assay Processing"画面の "Load Reagents"を選択します。 「ロードリスト」に従って、サンプルおよび品質管理ラック、開発ソリューション、コンジュゲート、キャリブレーター、キャリア、ピペットチップ、停止溶液、および洗浄液のロードを完了します（詳細については表を参照）。
    4. 「ロード＆スタート」で「OK」を押します。
      注記：測定の最後に、結果がIDMに表示されます。
    5. IDMインタフェースから、エクスポートするデータを選択します。 「メニュー」、「承認」、「名前を付けて保存」をクリックし、sIgE測定結果をスプレッドシートファイルとしてエクスポートします。
    6. スプレッドシートファイルを統計ソフトウェア（ 例えば、 SPSS） 10にインポートする。 SPSSメニューのスピアマン係数に特定のモジュールを使用して、これらの草花粉（陽性sIgE対全アレルゲン）と花粉成分（陽性sIgE対アレルゲン分子）の間の感作における相関を分析する。

4. sIgE反応性の定義

注：希釈していない血清検体の場合、特異的IgE測定の範囲は0.35〜100 kU / Lです。

  1. sIgE値> 100 kU / L 1：5でサンプルを希釈し、再アッセイします。値が100 kU / Lを超えている場合は、1,000 kU / Lまでの終点レベルに達するまで、さらに希釈してください。
  2. 0.35 kU / Lの閾値に基づいて、0.35 kU / Lを超えるsIgEレベルが正の5,7,10であると考える。反応を評価するsIgE試験のクラス1（≧0.35および<0.70 kU / L）、クラス2（≧0.70および<3.50 kU / L）、クラス3（≧3.50および<17.50 kU / L）、クラス4（≧ 17.50および<50.00 kU / L）、クラス5（≧50.00および<100.00 kU / L）およびクラス6（≧100.00 kU / L）である。

5.統計分析

  1. 統計ソフトウェア（ 例えば、 SPSS）でデータを分析する10 。定量的データを平均および標準偏差、中央値および四分位範囲（IQR）としての定性的データ、および肯定的結果の割合としてのカテゴリーデータとして報告する。
  2. 比率のグループ間比較、定量データのための不対t検定、定性データのランクサム検定のためのカイ二乗検定を使用する。
  3. Pearsonの相関検定を使用してパラメトリックデータ間の相関分析を行い、相関係数を「r」、スピアマンのノンパラメトリック検定の検定をt「 r s 」として表される相関係数。 P値が0.05未満の場合に統計的有意性を考慮する。

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結果

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この研究で使用される全自動イムノアッセイアナライザーは、患者からの血清検体中の目的の分子（sIgE）と反応するアレルゲンまたはアレルゲン成分を共有結合的にカップリングする固相構造を有する。自動プログラムでは、アナライザは150μLのすすぎ溶液ですべての非特異的IgEを洗い流し、これを5回繰り返します。次に酵素標識抗IgE抗体（50μL）を加えて複合体を生成させます。酵素標識抗IgE抗体（コンジュゲート）は、特異的IgEに結合する二次抗体である。結合していない抗IgE抗体は、150μLの洗浄液で洗浄することにより除去する（3回繰り返した）。結合した複合体を37℃で9分間、現像主薬（50μL）で処理する。現像主薬は、すべての結合した抗IgE抗体を切断する酵素消化剤である。後者はアルカリ性条件下で蛍光を発する。反応は、アルカリ性停止溶液の添加。その後、装置は固相構造を圧縮して溶出液を絞り出し、得られた溶出液の蛍光を波長470nmで測定する。蛍光は、溶出液中の目的の検体分子の絶対レベルと直線的に相関する。より高い蛍光値は、血清試料中のより多くのsIgEを意味する。試験結果を解釈す...

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ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

全自動イムノアッセイ分析装置は、地域、研究所、施設間、および時間の経過とともに満足できる一貫性を提供することができる。このような自動手順は、ベンチ研究および臨床研究を実質的に支持し、多くのアレルゲンおよび/またはアレルゲン成分の標準化された検出を可能にし、CRDの出現前に容易に明らかにならない可能性のあるアレルゲン交差反応性を同定する。さらに、大規模な地理的領域の調査に必要とされるように、高スループットの方法を可能にする厳密な品質管理によって試験手順全体を完了することができます。テスト手順はほとんどがコンピュータコンソールで実行されますが、いくつかの重要な問題に注意を向ける必要があります。この機器は、ユーザマニュアルに厳密に準拠して使用することが必須です。いかなる収差であっても、不必要な試験誤差、機械的損傷、またはレーザービームまたは高電圧による人身傷害をもたらす可能性がある。常にen適切で正確な検量線がシステムに保存されていることを確認してください。これは、検量の精度に関係しています。さもなければ、指定されたキャリブレーターのsIgE濃度は、血清検体試験の前に測定されるべきである。その後、システムは自動的に次の使用のために較正曲線を計...

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開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者は何も開示することはない。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

フィギュアを準備するのに彼の援助に感謝します。この研究は広東省科学技術財団（プロジェクト番号：2014A020212352）、広州教育局（1201630044、1201630393）、中国国立自然科学財団（NSFC 81572063、NSFC 81601394）の資金提供を受けました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
ImmunoCAP 1000 InstrumentThermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden)12-3800-01
Phadia Information Data Manager Software PackageThermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden)12-3801-11
Software Package, ImmunoCAP 1000Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden)12-3801-12
g2
(バミューダグラス)		Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden)14-4131-01
g6
(Timothy grass)		Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden)14-4100-01
w22
(Japanese Hop)		Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden)14-4452-01
g216
(nCyn d 1)		Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB,ウプサラ・スウェーデン)14-4972-01
g205
(rPhl p 1)		Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, ウプサラ・スウェーデン)14-5234-01
g208
(nPhl p 4)		Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, ウプサラ・スウェーデン)14-5288-01
g215
(rPhl p 5b)		Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, ウプサラ・スウェーデン)14-5338-01
g209
(rPhl p 6)		Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden)14-5289-01
g210
(rPhl p 7)		Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden)14-5290-01
g211
(rPhl p 11)		Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden)14-5291-01
g212
(rPhl p 12)		Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, ウプサラ スウェーデン)14-5292-01
o214
交差反応糖鎖決定要因(CCD)		サーモフィッシャーサイエンティフィック社(Phadia AB, ウプサラ スウェーデン)14-5339-01
Specific IgE Conjugate 400Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden)10-9310-08
Specific IgE Calibrator StripThermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, ウプサラ スウェーデン)10-9459-08
Specific IgE Curve Control StripThermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden)10-9312-08
Specific IgE Anti-IgE ImmunoCAP ThermoFisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden)14-4417-01
ImmunoCAP Specific IgE Negative ControlThermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden)10-9445-01
ImmunoCAP Specific IgE Control LThermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden)10-9528-01
ImmunoCAP Specific IgE Control MThermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden)10-9529-01
ImmunoCAP Specific IgE Control HThermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden)10-9530-01
開発ソリューションThermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden)10-9439-08
Stop SolutionThermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden)34-2271-58
Washing SolutionThermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden)10-9202-08
FluoroCThermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden)10-9264-01
メンテナンスソリューションキットThermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Sweden)10-9476-01

参考文献

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