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方法論記事

マウス腸管で胆汁の回腸誘起蓄積

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DOI:

10.3791/55728

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2017年8月21日

 ,  ,  , 
1Department of Medicine, Case Cardiovascular Research Institute, Case Western Reserve University, 2Harrington Heart and Vascular Institute, University Hospitals Cleveland Medical Center, 3Institute for Transformative Molecular Medicine, Case Western Reserve University School of Medicine, University Hospitals Cleveland Medical Center

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

小腸依存した胆汁酸再吸収と肝の胆汁酸合成のフィードバック阻害全身の恒常性と健康のために重要です。本研究では回腸誘起胆汁吸収不良、蓄積、およびマウス腸管における毒性評価する回腸切除マウス モデルをについて説明します。

要約

腸管切除は肥満などの疾患、炎症性腸疾患、クローン病、頻繁に下痢を含む胆汁酸, 重度の短腸症候群のような副作用で起因した大腸癌の一般的な治療法脱水、電解質異常、栄養素の吸収不良。回腸、組織コミュニケーションと全身の恒常性の維持を評価するためと呼ばれるマウス回腸切除モデルをご紹介します。回腸切除後循環血液は完全に回腸の内分泌ホルモンの線維芽細胞成長因子 15 (FGF15) その内分泌、肝臓での胆汁酸合成阻害を解放する欠けています。高められた生産と胆汁酸の回腸を削除した後の再廃止と組み合わせて、手術を受けたマウスは腸と関連する下痢、罹患率、死亡率で胆汁酸塩蓄積によって苦しみます。本研究で導入された手術モデルの新しい使用法は生理学および病気の全身の代謝調節の回腸のコントロールに機械論的で機能的な洞察力を提供するかもしれません。

概要

現代の生物医学研究における遺伝子操作動物モデルは人間の病気についての洞察を収集に幅広く活用できます。特に、分子として誘導の生物学的効果を研究する組織や遺伝子の細胞固有の利得と損失関数を使用されています。ターゲット遺伝子体内操作の進歩にもかかわらず残留制限があります。最初、多くのセルまたはティッシュ特定の削除は複数の臓器に影響を与えます。たとえば、上皮の遺伝子欠失は複数組織の上皮細胞における発現を排除します。さらに、削除が特定の組織に制限されている場合でも空間制御はほとんど可能です。たとえば、腸のような組織で異なるセグメントを体内の精密操作ことはできません非常に特定の機能を運ぶ。これらの場合、遺伝子を含む組織の切除は、組織コミュニケーションの機構と機能的意義を決定するより効率的な勉強方法と見なされます。

回腸はクローンのほとんどで使用される患者、回腸遠位部1,2,3を含む炎症性疾患。回腸は通常生成いくつかのエネルギー貯蔵ホルモン様線維芽細胞成長因子 15/19 (19/FGF15)、ペプチド YY (PYY)、グルカゴン様ペプチド 1/2 (GLP1/2);これらのホルモンは、多くの生物学的機能4,5,6重要なローカルおよび内分泌の役割を果たします。これらのホルモンの中で、FGF15 は、堅牢な内分泌、肝臓での胆汁酸合成阻害剤として識別されています。回腸上皮細胞に再吸収、一度、胆汁酸は、核内受容体ファルネソイド X 受容体 (FXR) Fgf15式を刺激するためにその後肝胆汁酸合成7のフィードバック阻害につながるをアクティブにします。回腸クルッペル様因子 15 (KLF15) を研究するために最近の研究紹介マウス回腸モデル -Fgf15肝8で体内の胆汁酸の生産を調整する軸をシグナリングします。最も重要なことは、胆汁酸の生物学、新規ファミリー、クルッペルのような要因、特に KLF15 を導入しました。回腸手術を含む機能的な研究に基づいて、我々 はその KLF15 upregulates 胆汁酸合成間接非肝機構を決定しました。最後に、回腸 KLF15 はFgf15の最初の内因性否定的な調整装置としても識別されます。

遠位領域に近位から降順腸管、養分の吸収を担います。回腸は、胆汁酸とビタミン B12 (VB12) 吸収9の責任の主要なセグメントです。早い調査は短腸症候群を研究する近位腸切除マウス モデルを採用さまざまな切除の長さ、ダイエット、縫合糸の種類を最適な手術後生存率10を維持するために提案しました。さらより最近の検討では、回腸切除は通常残り管11の減少した適応能力のため他胃腸の (GI) セグメント切除よりもより深刻な病気の結果を示します。このトピックは、回復と有効な治療法の理解がまだ限られているに対し、基礎および臨床研究グループの集中的な興味を得ています。

胆汁酸下痢は腸肝循環12,13胆汁酸恒常性の不均衡に起因します。それは、回腸切除、消化器疾患や特発性胆汁酸吸収不良の結果の結果をすることができます。患者の 80% 以上は、回腸切除14を経て下痢を呈するに発見されています。回腸胆汁酸下痢の調査のための重要な手術モデルとなる可能性があります。本研究では、回腸切除シリーズは、FGF15 欠乏と同様、腸内の胆汁塩吸収不良、蓄積、および有毒な損害のグラデーションの評価を提供します。

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プロトコル

動物のプロトコルに見直された制度動物のケアと使用ケース ウェスタン リザーブ大学医学委員会によって承認し、国立衛生研究所 (NIH) 要項に則って行われたもの、実験動物の管理と使用 (第 8 版、2011)。マウスは、アメリカ獣医医学連合 (AVMA) ガイドラインに準拠した方法で動物の安楽死のため安楽死された (2013 年版)。C57bl/6 j、男性、8-16 週齢マウスは、このプロトコルで使用されました。マウスに 12 h ダーク/ライト サイクル環境で収容された

。

1。 術前準備

  1. 24 h 手順の前にきれいなケージに移動マウス。動物の水への無料アクセスを許可します。ソフト食 (ゲル栄養補助食品) の食事食品に置き換える手術のため小腸の内容を減らすために手術前に 4-6 h
    2. 。
  2. はすべて手術器具を滅菌し、単回使用の滅菌手術材料を準備します。手術エリアと 70% のエタノールで麻酔の鼻の円錐形をきれいします
    3. 。
  3. は、解剖顕微鏡、イソフルラン麻酔気化器、楽器、温度制御小動物外科テーブル温度維持を設定します。手術中に無料のアクセスのための場所に注射器、縫合糸、楽器を整理します
    4. 。
  4. 外科領域に十分なライトを提供する光源を設定します
    5. 。
  5. 腸管と腹壁のクリーニング用 5 mL 注射器で生理食塩水 0.9% を準備します
    6. 。

2。回腸と吻合

  1. 小動物培養室におけるイソフルラン (2-3%) と麻酔マウス。動物はイソフルランのつま先のピンチ技術を使用して十分な anesthetization を確認します
    2. 。
  2. は髪の除去の製品を適用することによって腹部の毛を取り除くし、離れて手術用スポンジを使用して麻酔を維持しながら髪を拭いてください。フェイス マスクを通してイソフルラン (1-2%) と 37 ° c. の維持麻酔に温度制御小さなテーブルの上動物手術 ( 図 1 A) 体温を維持するためにマウスを配置します。眼軟膏のマウスの目を治療します
    3. 。
  3. ポビドン ヨード、70% アルコールを使用して肌をきれいにし、滅菌手術用ガーゼ ( 図 1 B) 腹部の外科領域をカバーします
    4. 。
  4. は、正中線の腹部の切開手術のメスを使用して麻酔が有効を確認します。マウス腸およびプル腹部筋肉リトラクターを完全に開き、腹腔内 ( 図 1 C) を公開するを保護するために綿の先端アプリケータを使用します
    5. 。
  5. は、盲腸を探します。慎重に腹腔内 ( 図 1 D) から接続されている回腸と空腸の一部を移動盲腸から始まっています
    。 注: 盲腸簡単に識別できるサイズが大きいため断食後でさえも
    6. 。
  6. は、輸血の摘出は、回腸を閉塞し 7-0 シルク縫合糸で上腸間膜動脈の上方の分枝を結紮します。回腸の色はピンクから濃い紫色に結紮後変わります。( 図 1 E ~ F).
  7. 、はさみを使用して実験の目的に応じて切除し、回腸の 90% または 50% を削除します
    。 注: 偽手術のため上腸間膜動脈結紮術を行わないため、回腸を削除しないでください
    8. 。
  8. フラッシュ 0.9% 生理食塩水で、回腸の両端の内腔
    。 注: 残りの無傷の回腸はまだ正常な血液供給を受け取って、上腸間膜動脈から少量の血がフラッシュされますプロセス中に。これはまた回腸末端への血液供給は正常であり、により吻合術 ( 図 1 G) 中に、虚血はありませんを示します
    9. 。
  9. は、回腸両端側に mesenteries を探します。Mesenteries を合わせ、8-0 縫合糸 ( 図 1 G ・ H) を使用して一緒に回腸の両端を縫合します
    10. 。
  10. 回腸と回腸を保つ側吻合 ( 図 1 私) 自然な方法で縫合します
    11. 。
  11. 徹底的に結合 2 つ回腸端に一緒に ( 図 1 J) 2 つ元縫合間上下を縫合します
    12. 。
  12. は、3 ステップの縫合の手順を終えた後吻合からの漏れがないことを確認 ( 図 1 G-私)。盲腸、小腸を腹腔内に元の解剖学的位置に戻ります。鈍針を使って温かい 0.9% 生理食塩水で外科領域を洗ってください。( 図 1 K).
  13. は、6-0 縫合糸で腹部の筋層切開を閉じる。鉗子を使用して腹部の皮膚切開に合わせ、最適な創傷治癒 ( 図 1 L) を容易にする腹部の皮膚を縫合します
    14. 。

3。術後ケア

  1. 転送手術後の回復のための集中治療室にマウス。一晩後の手術の回復を続行する温度制御加熱パッドのペーパー ベッド ケージに収容します。規則的な食糧と水に加えて、柔らかい食べ物を持つマウスを指定します
    2. 。
  2. 管理ブプレノルフィン (0.05 - 0.1 mg/kg) 皮下注射と鎮痛のすべて 8-12 h
    。 注: 場合は深刻な病気に、CO 2 でマウスを安楽死させる
    3. 。
  3. 、エンドポイントで必要に応じて過剰イソフルランと収穫のサンプルを用いたマウス (セクション 4) を犠牲にします
    4. 。

4。回腸誘起胆汁蓄積の評価

  1. の重量を量るし、解剖マウス回腸の 90% や 50% 0% (シャム) 切除後の 1 日
    2. 。
  2. は、消化管を取り外して、それの重量を量る。体重比胆汁塩吸収不良および蓄積の重症度を評価するために GI の体重を計算します
    3. 。
  3. は、15 mL の円錐管に消化管を転送し、はさみを使用して短いセグメントにそれらをカットします。切断した後、3,000 x g で 10 分間遠心はクリーン チューブに上清 (消化液胆汁酸塩を含む) を転送します
    4. 。
  4. 容量 GI 流体の重さを測定し、さらに消化管に胆汁の蓄積を評価するために消化管重量比に流体の重量を計算します
    5. 。
  5. 参照 8 に示す胆汁酸アッセイによって清総胆汁量を決定します
    6. 。

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結果

回腸の手順は図 1のとおりです。最初のステップでは、マウスの腹部の皮膚を準備して、腹部の切開・ リトラクターを使用して (図 1A ~ C) 腸を完全に公開するも含まれています。次に、マウスの盲腸に位置していた (図 1D)。考えるとそのサイズと形状は、わかりやすいランドマークです。盲腸、回腸遠位空腸の一部が露出、腹部キャビティ (図 1D) から削除します。回腸切除範囲が決定され、セグメントに血液を供給上腸間膜動脈を結紮し、回腸のセグメントの色が急速に腸の残り中濃い紫色 (図 1E ~ F) に変更通常ピンク色を維持します。全体の虚血性回腸は...

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ディスカッション

成功した回腸を実行するために、切除範囲のセグメントへの血液供給をブロックする前もっての上腸間膜動脈を結紮する必要があります。虚血性回腸結紮後濃い紫色になります。回腸のセグメントを完全に切除しする必要があります。正常な血液供給は、保持の目的のために確保されなければなりません。これは、簡単に縫合後虚血性壊死のための原因手術失敗できる出血と不適切な除去を避けるために不可欠です。吻合中の自然な解剖学的位置で回腸末端を一緒に参加することが重要です。腸間膜は、ツイスト終了の潜在的な発生を回避する最初の縫合に最も信頼性の高いランドマークと見なされます。回腸端の側の 2 番目の縫合後 2 つの端は彼らの自然な解剖学的構造に従って配置されます。腸吻合術後後吻合部の領域の色をチェックする必要があります。地域は通常、通常ピンク色を示します。手術後紫エリアなら、縫合帯に虚血が苦しんで可能性があります。これは虚血性セグメントの不完全な切除または縫合しながら 2 つの端のねじれが原因かもしれません。これらの条件の下で手術をしてすぐに解決します。

回腸手術の合併症は胆汁酸吸収不良による毒性、術後イレウスや縫合で...

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開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

この研究はトム ・ ピーターソン財団によってサポートされ、NIH R01 HL119780 (ジャイナ教、MK) を付与します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
解剖顕微鏡オリンパスSZ61手術用 
動物温度調節器Physitemp Instruments, Inc.TCAT-2LV体温調節用
イソフルラン麻酔気化器VetEquip 911104麻酔用
解剖鉗子 ファインサイエンスツールズ株式会社11274-20手術用 
ハサミ ファインサイエンスツールズ株式会社14084-08手術用 
ニードルホルダー ロボズ手術器具株式会社RS-7882手術用 
マイクロナイフ-針刃フィッシャーサイエンティフィック10318-14手術用 
6-0 モノフィラメント縫合糸Ethicon1698G腹部の皮膚閉鎖用
7-0 シルク縫合Ethicon766G結紮用
8-0 モノフィラメント縫合Ethicon1714G吻合用
サージカルスポンジDynarex Corp.3333手術用 
小さな綿の先端のアプリケーター フィッシャーサイエンティフィック23-400-118手術用 
イソフルランPiramal Healthcare Limited66794-013-25麻酔薬
ブプレノルフィン塩酸塩Reckitt-Benckiser Pharmaceuticals12496-0757-1鎮痛剤
用 0.9% 塩化ナトリウム 注射B. Braun Medical Inc.0264-7800-10洗浄・注射用
ポビドンヨウ素調製液ダイナレックス(株)1413皮膚の準備
Puralube獣医軟膏Dechra獣医製品17033-211-38目のふりのために
脱毛ローション教会&ドワイト株式会社皮膚の準備
用 集中治療室ThermoCareFW-1術後の回復用
DietGel recoveryClearH2O72-06-5022手術後の回復用
Aurum total RNA fatty and fibrous tissue kitBio-Rad7326830For RNA isolation
iScript reverse transcription supermix for RT-qPCRBio-Rad1708841For逆転写アッセイ
TaqMan fast advanced master mixApplied Biosystems/Life Technologies4444965QPCR解析用
総胆汁酸アッセイキットジェンザイム診断DZ042A-K01胆汁酸アッセイ用
C57BL/6J ジャクソン研究所
糸

参考文献

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