パーソナライズされた齧歯動物の脳でのマイクロインジェクション針

サマリー

ここで水晶針を使用して齧歯動物の脳でのマイクロインジェクションのプロトコルについて述べる。これらの針は検出可能な組織の損傷を生成しないし、深部にも信頼性の高い配信を確保します。さらに、彼らはお好みのデザインで研究のニーズに合わせることができるし、再利用することができます。

要約

薬剤は、薬や特定の脳領域内毒素の配達のための長い時間のために使用されているし、最近では、彼らは遺伝子や細胞療法製品を提供に使用されています。残念ながら、現在のマイクロインジェクション技術使用、複数の理由で最適ではない鋼またはガラスの針: 特に、鋼の針は、組織損傷を引き起こす可能性があり、ターゲット領域が不足している脳に深く下げたときガラス針を曲げるかもしれません。この記事の準備の便利な機能の数を組み合わせる水晶針を使用するプロトコルについて述べる。これらの針は、検出可能な組織の損傷を作り出さないし、深い座標を使用する場合でも、必要な脳の領域の信頼性の高い配信を確保する非常に厳格であること。また、希望の直径の複数の穴をあけ、針のデザインをカスタマイズすることが可能です。複数の穴は、大きい穴セルの注入を容易にするのに対し大量の大きな領域内の溶液の注入を促進します。さらに、これらの水晶針を掃除し、プロシージャの費用対効果となるよう、再使用できます。

概要

薬剤は、特定の脳領域のニューロンの活動を調節する薬理活性化合物の配信のため長い間使用されています。さらに、彼らは神経変性イベント特定の病気、たとえば 6-ヒドロキシドーパミン パーキンソン病を模倣する黒質線条体ドーパミン系の特性を模倣するように、特定の神経集団近く毒素を注入するために使用されています。^1,2または巣コリン作動性システム³immunotoxin 192 IgG saporin。最近では、遺伝子や細胞治療の実験的脳障害^4,5ウイルスのベクトルまたは細胞移植を提供するマイクロインジェクション プロシージャが使用されています。

これらの研究で用いられる針の古典的なタイプはステンレス スチール製します。問題⁶数が簡単で使用する実用的な鋼の針である: 比較的大きい、血液脳関門の漏出とアストロ サイトの活性化組織の損傷を引き起こす可能性がありますまた、障害物を作成するか、目的のソリューションの流れを完全に回避する針に脳組織のコアリングを出す可能性があります。最近では、準備されたアドホック毛細血管から導入されているガラス針は

プロトコル

すべて実験的プロトコルは、フェラーラ大学動物実験倫理委員会およびイタリアの保健省によって承認されました。到着 (動物資源研究領域: 生体実験の報告¹¹) ガイドラインに続いています。

1. 水晶探針の作製

1. きれいにし、蒸留水で 5 分、エタノール 99% で 5 分、ジエチル エーテル 5 分を置くことによって (材料表参照) 石英毛細血管を滅菌します。
2. 完全に乾燥させる、少なくとも 1 時間のためのフードの下の毛細血管を残します。
3. 個々 のニーズに応じて、十分に長く、十分に細い針の生産を許可するパラメーターによるとレーザーの引き手を使用して針を準備します。
   注: 我々 はレーザーの引き手を使用して (材料の表を参照してください)。引っ張るための 2 行のプログラムを使用します。最初の行は、高出力、(フィラメントの値に対応する) 最大スキャンの長さと引っ張る力を使用します。このパラメーターの組み合わせはスピードが低い拡張機能、内部/外部の大きさで長い針の形成を可能にする毛管の最大の部分の溶融につながり、シャンクを削減します。この方法では、針は、高機械的な抵抗と目詰まりせず幹細胞またはウイルス粒子の通過を可能にする広い内径を保持します。速度とこのプログラム ラインの遅延は、先端が小さすぎると、長い、....

結果

ラット背側海馬、線条体の 2 つの古典的な 26 G 鈍い端 30 G ベベル エッジと比較して水晶針 (60 μ M 外径先端; 1 つ 20 μ M 径側の穴が図 1C 型) を使用して直接マイクロインジェクションによる損傷を比較しました。ステンレス スチール製の針。この目的我々 は右にアプライドの 2 μ L 注入し、左背側海馬線条体投与後、それぞれに石英の鉄の針と、48 h を使用して、我々 はヘマトキシリン ・ エオジン (HE) 染色による組織損傷を評価します。良い注入感謝さまざまな針による急性の機械的損傷後早期の時点を選びました (時間、組織修復メカニズムが無名の初期損傷)⁷。

上記で説明したプロトコルに従い水晶針生成されませんでした任意の検出可能な損傷とかろうじて検出可能針トラック 26 G 鋼の鈍い端針を通して注入される脳領域展.......

ディスカッション

この資料で説明する手法は、様々 な目的の¹²に対して実行される薬剤を最適化するための導入に記載されているニーズを満たします。ここで説明した針は、最小、本質的に検出可能レベルに損傷を軽減します。(曲げる傾向がある) ガラス針で分散、水晶針が剛性、深い座標でも必要な脳の領域の信頼性の高いヒットを確保します。さらに、側の穴は、先端穴を取得します脳組織の挿入時に遮蔽された場合でも、ソリューションの提供を保証します。

制限と代替。高融点のため従来の引き手、すなわちに石英毛細血管が引き出せない、彼らは高価な機器へのアクセスを必要とします。ガラス管が損傷組織が以下の深部構造の注射のため信頼性が高くより壊れやすい (すなわちデザインの面でより柔軟な) の回避の面で均等に良いです。ただし、目標は、大脳皮質や背側の海馬などの表面的な構造の注射針破壊のリスクを増加させる複数の穴のための要件はありませんが、もしガラス針は確かに有効な安価な代替を表します。<.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
石英キャピラリー	Sutter Instruments, Novato, CA USA	Q100-50-10	Without filament
Puller	Sutter	P2000
Micropipette storage jar	World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA	E210
Laser microdissector	Leica Microsystems, Wetzlar, Germany	LMD6500
Hamilton syringe	ハミルトンILSイノベーティブレイバーシステムGmbH、StŸツァーバッハ、ドイツ	19138-U
マイクロインフュージョンポンプ	ユニベントール、ゼイトゥーン、マルタ	モデル 864
手動マイクロインジェクションポンプキット	WPI	アイテム#: MMP-KIT	マイクロピペットを定位フレームにしっかりと取り付けることを可能にするキット
精密ドリル	Proxxon	28510 MicroMot 50/E	ボールベアリングドライブシャフト、可変速
Artficial Cerebral脊髄液	Tocris	3525
針 26 G 鈍器と 30 G ベベル	ハミルトン	26 G 鈍器: 19138-U 30 G ベベル: 20757
ミクロトーム	ライカ、ドイツ	ライカ RM212RT