脳の細胞外空間の体積分率とねじれを定量するためのテトラメチルアンモニウムによるリアルタイムイオントフォレシス

サマリー

このプロトコールは、生体内の脳の細胞外空間（ECS）の物理的パラメータを測定する方法であるリアルタイムイオントフォレシスを説明しています。 ECSに放出された不活性分子の拡散を用いて、ECSの体積分率および蛇行度を計算する。これは、脳のECSへの急性の可逆変化を研究するのに理想的です。

要約

このレビューでは、生きた脳の細胞外空間（ECS）を探索および定量するための金標準である、リアルタイムイオントフォレーゼ（RTI）法を実行するための基本概念およびプロトコルについて説明しています。 ECSはすべての脳細胞を囲み、間質液と細胞外マトリックスの両方を含む。神経伝達物質、ホルモンおよび栄養素を含む脳活動に必要な多くの物質の輸送は、ECSを通る拡散によって起こる。この空間の容積および形状の変化は、睡眠のような正常な脳プロセスおよび虚血のような病理学的状態の間に生じる。しかしながら、特に罹患した状態での脳ECSの構造および調節は、未だに未解明のままである。 RTI法は、生きた脳の2つの物理的パラメーター、すなわち体積分率および蛇行を測定する。体積分率は、ECSが占める組織体積の割合である。屈曲は、脳に拡散して物質が遭遇する相対的障害の尺度である妨害のない媒体と比較して、 RTIでは、不活性分子が供給源の微小電極から脳ECSにパルスされる。分子がこの供給源から拡散するにつれて、イオンの変化する濃度は、約100μm離れて配置されたイオン選択性微小電極を用いて経時的に測定される。得られた拡散曲線から、体積分率と曲がり率の両方を計算することができる。この技術は、複数の種（ヒトを含む）およびインビボの脳切片において、ECSに対する急性および慢性の変化を研究するために使用されている。 RTIは、他の方法とは異なり、リアルタイムで脳ECSの可逆的および不可逆的変化の両方を調べるために使用することができる。

概要

細胞外空間（ECS）は、すべての脳細胞の外部にある相互接続されたチャネルのネットワークであり、間質液および細胞外マトリックスの両方を含む（ 図1aおよび図1b ）。栄養素、ホルモン、神経伝達物質を含む脳細胞機能に必要な多くの物質の分布は、ECSを通じた拡散によって起こります。体積、形状、および細胞外マトリックスを含む、この空間の物理的パラメータの変化は、急激ECSおよび脳細胞機能^1、2に重大な影響を与える脳細胞を浸す局所イオン濃度、を通して拡散に影響を与えることができます。

^、体積分率及びねじれ^3、4：リアルタイムイオントフォレーシス（RTI）は、脳の領域の2つの構造的特徴を決定するために使用されます"xref"> 5。体積分率（ α ）は、代表的な基本体積における全組織体積（ V _組織 ）に対するECS（ V _ECS ）が占める組織体積の割合である。

プロトコル

組織サンプルを得るために使用されたすべての動物手順は、SUNY Downstate Medical Centerの動物倫理委員会の承認を受けていました。

1.溶液および装置の準備

1. ISMの基準バレル用の150mM NaClバックフィル溶液を調製する。 0.22μmフィルター（細菌または粒子を除去するため）に取り付けられた10mLシリンジに保管してください。
2. マイクロ電極用の150mM TMAクロライド（TMA-Cl）バックフィル溶液を調製する。 0.22μmフィルターに添付された10 mLシリンジに保存してください。正確な濃度を確保するために、5Mメーカーのストック溶液からTMA-Cl溶液（このプロトコールで）を調製します。
3. ワイヤを漂白剤（次亜塩素酸ナトリウム）に少なくとも2時間浸漬することによって、微小電極の製造のために少なくとも4本の銀線を塩化する。過剰の漂白剤をエタノールで除去し、ワイヤーを乾燥させる。
4. ビーカー中の150mM NaClおよび0.5mM TMA-Cl中の0.3％アガロースの50mLを調製するカバーしてください。良好な拡散測定を確実にするために粉末状で合理的に新鮮なアガロースを使用する。
5. アガロース溶液を加熱し、撹拌棒で混合して溶解させる。溶液を室温に冷却する。これを4℃で最大1週間保管してください。
6. 1M KCl中の4％アガロースで作られた....

結果

RTI技術の有用性は、 αの変化および低浸透圧チャレンジ中の変化を測定するために設計された実験で実証されている（ 図8および図9 ）。以前に低張ACSFで洗浄することにより、ECSの浸透圧を低下させることはαの減少及び^λ13の増加を生じさせることが示されています。

この実験において、RTIは、制御条件下および低張性ACSFのウォッシュ・オンの両方の条件下で、ラットの脳スライスで実施した。 ISMを製作し、その較正パラメータを、58.21mVの勾配（ M ）を計算したNicolsky方程式に適合させるためにWandaに入力した。 ISMおよびイオントフォレシス微小電極を寒天中に置き、輸送ニューロンを測定するために互い.......

ディスカッション

図10：一般的な技術的問題を示す理想的でないデータ （ a ）イオントフォレーシス微小電極による一般的な技術的問題の図：機能的イオントフォレーシス微小電極からのTMAの正常放出と、技術的問題を示す3つの供給源との比較。 [高倍率、a1]理想的なイオン導入源の電流は、TMA放出および塩化物の取り込みによって等しく運ばれる。 [高倍率、a2]低いn _tを有するイオントフォレシス微小電極は、TMAが少なく放出し、通常より多くの塩化物を取り込む。 [高倍率、a3]電気浸透を示すイオントフォレシス微小電極は、TMA、塩化物および溶媒を放出する。 [高倍率、a4]経時的な放出増大（ すなわち、 「ウォーミングアップ」）を示すイオントフォレシス微小電極。 （ b ）非理想データのグラフo寒天で得られる：データはウォルターによっ.......

材料

例えば

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
A/DおよびD/Aコンバータ	ナショナルインスツルメンツコーポレーション	NI USB-6221 DAQ	NI USB-6221は、NIから「レガシー」デバイスとして販売されています。新規インストールにはNI USB-6341 XシリーズDAQの使用を推奨していますが、新しいユニットではテストしていません。NI USB-6221とMATLABおよびWindows 7(32ビット)の使用方法について説明します。代替案:はるかに古いPCI-MIO-16E-4 A / Dコンバーター(Windows XPまたは古いOSでのみ使用)とBNC-2090 BNCコネクタパネルとSH68-68-EPケーブル。Wanda Manualに記載されているように、Axon Binary Filesを使用するための実験的なMATLABプログラムが利用可能です。
アガロー	ロンザ	NuSieve GTG アガロース #50081	RTI測定用希薄アガロースゲルを調製
ISM	Dagan	Model IX2-700 デュアル細胞内プリアンプ	イオンおよび参照電圧増幅器 N=0.1 (参照バレル用) および N=0.001 (イオンバレル用) ヘッドステージ
生物学的化合物 ミスクロスコープ (4倍および10倍対物レンズ付き)			微小電極の先端を削り、微小電極を検査するため。さまざまなサプライヤー、例 AmScope
ホウケイ酸シータ毛細管ガラス管	ハーバード装置	ワーナー・インスツルメンツ モデル TG200-4; 注文 #64-0811	イオン選択性微小電極およびイオン導入微小電極用ダブルバレルガラス管; 外径 2.0 mm、内径 1.4 mm、セプタム 0.2 mm、長さ 10 cm
ブラシ	Winsor &ニュートン	大学シリーズ233、サイズ0	ラウンドショフトハンドルブラシ、アマゾンブ
ンゼンバーナー	ッシャー
ピペットオ	リンパス	OLY-150	はモニターが必要、サブステージイルミネーターのIRフィルターはオプションの
チャートレコーダー			ですテトラメチルアンモニウム標準試料の較正中およびRTI実験中にイオン選択性微小電極の電圧を連続的に記録する。例: Kipp &ゾーネンタイプBD112デュアルカネルチャートが記録され、利用可能な再生
ロトリメチルシラン、純度、>99%	Sigma-Aldrich	カタログ#92360	のシラン化用。注意:可燃性、急性毒性(経口、皮膚、吸入)、皮膚の腐食、目の損傷、水と激しく反応する、完全な説明については、Sigma-Aldrichの安全情報を参照してください
商用ソフトウェア	MathWorks	MATLAB、	WandaおよびWalterプログラムを使用したデータ収集と分析のためのデータ収集ツールボックス。アカデミックライセンスが利用可能です。
目の保護メガネ	フィッシャー
固定ステージ複合顕微鏡	オリンパス	BX51WI	は、固定ステージ鉗子を備えた他の複合顕微鏡を使用することができます
	ファインサイエンスツール	#11251-10	キャピラリーをチップ化するために;Dumond #5は、好ましくは使用し、
イオン交換器が付いているイオン選択バレルの先端を充填し、silanizationのための良い仕事の発煙フード
ガラス顕微鏡スライド	Fisher	#12-550A	チップmicroelectroelectrodのヒント
のヒーター/スター	ラーFisher	ニングPC-420D	希薄なアガロースゲルを調製し、イオン
トフォレティックユニット	Dagan	ION-100およびPS-100	ION-100は、シングルチャネルイオントフォレーシスユニット+/-130Vコンプライアンスです。PS-100は外部電源です。代替案:Axon Instruments社製Axon Instruments社製例えば/emAxoprobe-1Aは、テトラメチルアンモニウムの再生ユニット(eBayおよびその他のサイト)の入手可能性を確認します
トラメチルアンモニウム用液体イオン交換体(LIX)	精密機器	IE190カリウムイオン交換体	注:これは、テトラフェンリホウ酸塩に基づく元のコーニングカリウム交換体477317に相当します-中性キャリアカリウム交換体と混同しないでくださいテトラメチルアンモニウムを感知しないチューリッヒのサイモン博士の研究室に由来し、フルカによって販売されています。また、テトラメチルアンモニウム用の液体イオン交換体を自分で作ることもできます:重量の3%テトラキスカリウム=(p-クロロフェニル)ホウ酸塩を2,3-ジメチルニトロベンゼンに溶解。Fluka(現在はSigmaの一部)から化学薬品を購入します。See Oehme and Simon (1976) Anal. Chim.使徒行伝86:21-25;注意:この液体イオン交換体の毒物学的特性は完全には決定されていません。人体への摂取や接触は有害な場合があります。運動には十分注意してください!液体イオン交換体は、直射日光の当たらない涼しい場所に保管する必要があります。
微小電極	ホルダーWPI	M3301EH	シラン化のためにイオン選択性マイクロエレトロードをプレハブで保持し、イオン選択バレルの先端を液体イオン交換体で充填します。WPIは、このホルダーの2つのバージョン、クリアM3301EHとブラックM3301EHを販売しています。私たちの経験では、透明なM3301EHは黒いM3301EHよりも頑丈に見えます。
マイクロマニピュレーター	成重	MM-3	は、シラン化中にイオン選択性微小電極をプレハブに配置し、イオン選択性バレルの先端を液体イオン交換体で充填します。良好な作業状態の任意の3軸マイクロマニピュレーターに置き換えることができます
ピペットプーラーSutter	Instruments	Model P-97	ダブルバレルガラス管を引っ張る。他のプーラーは、大口径のダブルバレルガラス管マイクロプローブ温度計を収容できる限り、この
	Physiotemp	モデルBAT-12R	ファインプローブは、記録部位の
針	BD	シリンジと針#305122(25ゲージ)	シラン化のために使用することができます。BD PrecisionGlideの針 25 G x 5/8 in (0.5 mm x 16 mm)
対物レンズ 5X ドライ	オリンパス	MPlan N
対物レンズ 10X 水浸	オリンパス	UMPlan FL N	10X 対物レンズは水浸、開口数は 0.3、作動距離は 3.3 mm
プラスチック容器 (蓋付き)	Fisher	#14-375-148	テトラメチルアンモニウム標準溶液と微小電極
を保管します固定ステージ顕微鏡用プラットフォームとx-y平行移動ステージ	EXFO	ジブラルタル バーレー	プラットフォームは、スライスチャンバー、マイクロマニピュレータ、アクセサリーを保持し、x-y並進ステージは、記録の安定性を損なうことなく顕微鏡を移動
希薄なアガロースゲルでのRTI測定用	孔質ミニカップ
の再利用可能な接着剤	Bostik	Blu-Tack	微小電極を保持容器に固定するため、その他の用途に使用します。
アマゾンのロボットマイクロマニピュレーターから入手可能な様々なサプライヤー、正確なx、y、z位置決め	Sutter Instruments	MP-285	2つのミルコマニピュレーターは、イオン選択性微小電極とイオントフォレティック微小電極を別々に保持するために必要です。マイクロピペットを間隔を空けて並べて接着することも可能です(テキストを参照)。
ローパスフィルター付きシグナルコンディショニングユニット	Axon Instruments	CyberAmp 320または380	、メーカーから入手できなくなりましたが、E-Bayから入手できる場合があります。代替品:e.g. FLA-01 Filter/Amplifier from Cygnus Technology.これは、マルチポールベッセルフィルターを使用して10 Hzで最小カットオフを持つシングルチャンネル機器ですが、必要に応じて、会社はそれをより低いカットオフ周波数(2 Hz)に変更する用意があります。
銀線	AMシステム	#7830	直径0.015インチ、裸(コーティングなし)
スライスチャンバー	ハーバード装置	ワーナーモデルRC-27L	これは水中スライスチャンバーです。
シラン化やイオン選択バレルの先端に液体イオン交換器を充填するための	実体顕微鏡
注射器、10mL	BD	シリンジとニードル#309604	は、微小電極を埋め戻し、シラン化するためのものです。BD Luer-Lokチップ
シリンジフィルター0.22 µm 細孔	Whatman	#6780-1302	埋め戻し溶液をろ過します; フィッシャー
シリンジ ニードル、28 ゲージ、97mm	ワールド プレシジョン インスツル	MicroFil MF28G-5	から利用可能 マイクロ電極
テフロン (=PTFE) チューブ	コンポーネント サプライ	STT-28 PTFE チューブ ライト ウォール (28 ゲージ)	イオン選択性バレルのシリナイズ用。BD PrecisionGlideニードル25 G x 5/8インチに適合します。注:テフロンは必須であり、PVCチューブはホットワックスによって溶けます。
温度制御システム	ハーバード	ワーナーモデルTC-344BとSH-27A	TC-344Bはデュアル自動温度コントローラであり、SH-27Aはインラインヒーターです。コントローラとヒーターはワーナースライスチャンバー
テトラメチアンモニウム(TMA)塩化	シグマアルドリッチ	T-3411	5 Mソリューションで動作します。注意:急性毒性(経口、経皮、吸入)、発がん性、水生環境に有害、シグマ-アルドリッチ安全情報を参照してください 完全な説明については
振動ブレードミクロトーム	ライカ	VT1000S	脳スライスを切断しますキシ
レン	フィ	ッシャーX5-1	ラン化のために;注意:可燃性、急性毒性(経口、皮膚、吸入)、皮膚腐食、眼の損傷、発がん性、完全な説明についてはフィッシャー安全情報を参照してください

ス フィカメラから入手可能マイクロクロ ガラス液体のためにもはや必要としない;さまざまなsupliers、Erlabによって販売されるapproriateフィルターが付いているCaptairをコーテ世界、マイクロ温度計のの近くに配置され、多; 自家製はインターフェーススライスチャンバーを使用しないでください。水平に取り付けられています。さまざまなサプライヤーのメンツ 装置物、を シ