このプロトコールは、生体内の脳の細胞外空間(ECS)の物理的パラメータを測定する方法であるリアルタイムイオントフォレシスを説明しています。 ECSに放出された不活性分子の拡散を用いて、ECSの体積分率および蛇行度を計算する。これは、脳のECSへの急性の可逆変化を研究するのに理想的です。
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方法論記事
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このプロトコールは、生体内の脳の細胞外空間(ECS)の物理的パラメータを測定する方法であるリアルタイムイオントフォレシスを説明しています。 ECSに放出された不活性分子の拡散を用いて、ECSの体積分率および蛇行度を計算する。これは、脳のECSへの急性の可逆変化を研究するのに理想的です。
このレビューでは、生きた脳の細胞外空間(ECS)を探索および定量するための金標準である、リアルタイムイオントフォレーゼ(RTI)法を実行するための基本概念およびプロトコルについて説明しています。 ECSはすべての脳細胞を囲み、間質液と細胞外マトリックスの両方を含む。神経伝達物質、ホルモンおよび栄養素を含む脳活動に必要な多くの物質の輸送は、ECSを通る拡散によって起こる。この空間の容積および形状の変化は、睡眠のような正常な脳プロセスおよび虚血のような病理学的状態の間に生じる。しかしながら、特に罹患した状態での脳ECSの構造および調節は、未だに未解明のままである。 RTI法は、生きた脳の2つの物理的パラメーター、すなわち体積分率および蛇行を測定する。体積分率は、ECSが占める組織体積の割合である。屈曲は、脳に拡散して物質が遭遇する相対的障害の尺度である妨害のない媒体と比較して、 RTIでは、不活性分子が供給源の微小電極から脳ECSにパルスされる。分子がこの供給源から拡散するにつれて、イオンの変化する濃度は、約100μm離れて配置されたイオン選択性微小電極を用いて経時的に測定される。得られた拡散曲線から、体積分率と曲がり率の両方を計算することができる。この技術は、複数の種(ヒトを含む)およびインビボの脳切片において、ECSに対する急性および慢性の変化を研究するために使用されている。 RTIは、他の方法とは異なり、リアルタイムで脳ECSの可逆的および不可逆的変化の両方を調べるために使用することができる。
細胞外空間(ECS)は、すべての脳細胞の外部にある相互接続されたチャネルのネットワークであり、間質液および細胞外マトリックスの両方を含む( 図1aおよび図1b )。栄養素、ホルモン、神経伝達物質を含む脳細胞機能に必要な多くの物質の分布は、ECSを通じた拡散によって起こります。体積、形状、および細胞外マトリックスを含む、この空間の物理的パラメータの変化は、急激ECSおよび脳細胞機能1、2に重大な影響を与える脳細胞を浸す局所イオン濃度、を通して拡散に影響を与えることができます。
、体積分率及びねじれ3、4:リアルタイムイオントフォレーシス(RTI)は、脳の領域の2つの構造的特徴を決定するために使用されます"xref"> 5。体積分率( α )は、代表的な基本体積における全組織体積( V 組織 )に対するECS( V ECS )が占める組織体積の割合である。

屈曲( λ )は、物質が障害のない媒体と比較して脳領域を通って拡散するときに遭遇する相対的障害である。

ここで、 D * (cm 2 s -1 )は脳内の物質の有効拡散係数であり、 D (cm 2 s -1 )は希薄アガロースゲルなどの遊離媒質中の物質の自由拡散係数である。
現在、Rに最も一般的に使用されるプローブ物質TI法は、小さなカチオンのテトラメチルアンモニウム(TMA)である。 TMAは74g / molの分子量を有し、溶液中で完全に解離し、1つの正電荷を有する。このイオンによるRTIの研究は、 α
0.2とλ
1.6 1、2。これは、ECSが総脳容積のおよそ20%であり、小さな不活性分子の拡散が、障害物のない媒体と比較してECSにおいて約2.5倍遅くなることを意味する3 。しかし、 αとλの両方は、脳の年齢、地域、状態、および病的状態によって変化する1 。これらのパラメータの変更は、脳の発達、老化、睡眠、てんかん、および脳の多くの他の基本的なプロセスおよび疾患に関連している1、 6 。他の技術はαおよびλを測定するが、RTIはリアルタイムで生体組織の局所化された領域で両方を測定することができる。このため、RTIは、急性および可逆性挑戦中のαおよびλの変化を調査するために不可欠なツールとなっている。
RTIを支持する理論は、もともとニコルソンとフィリップスによって検証し、及び技術は、その時4,7ため広く使用されてきました。 RTIを用いた実験は、希薄アガロースゲル中へのイオン導入法によって、源微小電極からTMAのパルスを放出することから始まる。いったん放出されると、イオンは、潜在的に無数のランダムな経路から選択して、点源から自由に拡散する( 図1d )。イオンの変化する濃度は、大まかに位置付けられたイオン選択性微小電極(ISM)を用いて経時的に測定される100μm離れている( 図1c )。 TMA濃度の変化をグラフ化し、イオントフォレーシス微小電極(プロトコルで議論されたパラメータ)のDおよび輸送数の両方の計算を可能にする曲線に適合させる。これらの値を用いて、脳の関心領域で手順を繰り返してD *を求め、 αとλの両方を計算する。イオントフォレーシス微小電極の制御、データ収集、TMA濃度曲線のグラフ化およびフィッティング、および実験パラメータの計算はすべて、典型的にはこの目的のために特別に設計されたプログラムWandaおよびWalterによって行われる(ソフトウェアおよびそのマニュアルは要求に応じて著者から自由に入手可能)。
このレビューの議定書のセクションでは、げっ歯類の脳スライスをRTIで設計および実施するために必要な基本的な手順について説明しています。この技術はまた、非ロッドヒト脳切片を含むとインビボ脳調製物1、4、6、8、9 で ENTモデル、。代表結果セクションでは、データ解釈のニュアンスを強調する理想的な結果と理想的でない結果の両方を提供します。最後に、ディスカッション・セクションでは、トラブルシューティング手法、RTIの制限事項、ECSの研究に使用される代替技術、およびRTIの今後のアプリケーションについて簡単に説明します。

図1:ECSによる拡散の図。 ( a )ECSの図:典型的な脳切片におけるECSの大きさと位置を示す。黄色は、灰色の脳細胞プロセス間のECSをマークする。 ECSの体積は、全組織体積の約20%である( すなわち、体積率= 0)。2)。 ( b )ECSの拡大図:脳細胞の形状(灰色)および細胞外マトリックス(多糖グリコサミノグリカンおよびプロテオグリカンのメッシュとして図示)を含む、蛇行に寄与する物理的パラメータを強調する。 ( c )点源からの拡散の3D図:イオントフォレシス源からISMへの不活性分子の正味の移動を示す。拡散障壁および細胞摂取を除いて、分子はあらゆる方向に外側に拡散し、球状の濃度の前面を生成する。 ISMは、イオントフォレシス源から放出された不活性分子の局所濃度を定量化する。 ( d )脳のECSにおける拡散のコンピュータシミュレーション:[Far left]モンテカルロシミュレーションのセットアップ;緑色の球体は脳細胞プロセスを表し、赤色の十字形は点源を表す。このセットアップは、 図1aに示す脳組織をモデリングします 。 [中間画像] 3と6分子は、2次元で示される脳の細胞外空間を通って拡散する際にランダムな動きをする。 [原爆]点源から放出された多くの分子のランダムな散歩。 図1cに示すように、点源からのすべての分子の正味の移動は外向きである。累積ランダムウォークは、細胞間の空間を概説する( すなわち、 ECS;さらなる説明については、参考文献5を参照)。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
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組織サンプルを得るために使用されたすべての動物手順は、SUNY Downstate Medical Centerの動物倫理委員会の承認を受けていました。
1.溶液および装置の準備
2.電子セットアップ

図2:多孔質の実験用カップおよび電子装置のセットアップ。 ( a )多孔性の実験用カップ:多孔質メッシュを用いて、アガロース(内側)と実験用の入浴用流体(外側)との電気的連続性を可能にする実験用カップを作製する。金属リングがカップの底部に取り付けられて、カップが浴槽内に浮遊することを防止する。 ( b )RTIセットアップのブロック図(ステップ2.1および2.2):ISMはアンプ(アンプ)に接続されています。 ISMには2つのバレルがあります。 1つは、先端に液体イオン交換体(LIX)を含み、先端のTMA濃度の対数に比例した電圧を局部的な周囲電圧とともに生成する。 the信号経路は赤線で表されます。 ISMのもう一方のバレルは基準バレルと呼ばれ、ISMの先端の周囲電圧を測定します。それは青信号経路によって接続される。アンプには、ISMに接続する2つのいわゆるヘッドステージがあります。これらのユニットは1(x1)のゲインを持ち、マイクロ電極の高インピーダンスと残りのアンプ回路の低インピーダンスを一致させます。イオン選択性バレルに接続されたヘッドステージは、約1,000MΩの入力抵抗に一致しなければならないが、基準バレルの抵抗は、典型的には約10MΩである。ヘッドステージを離れると、基準バレルからの電圧が反転され、加算増幅器(Σ)を用いてイオン選択バレルの電圧から減算され、純粋なイオン信号電圧が得られる。増幅器の出力は、追加の増幅と多極低域通過フィルタ(≦10Hz、典型的にはベッセル・フィーチャノイズを除去し、アナログ - デジタルコンバータ(A / D)で信号エイリアシングを防止します。フィルターの出力はストリップチャートレコーダーにも表示されます。 A / Dコンバータは、信号をデジタル化してパーソナルコンピュータ(PC)に送信します。 PCはまた、デジタル - アナログ変換器(D / A)によってアナログ電圧パルスに変換されたデジタル信号を生成し、このアナログ電圧パルスは、イオントフォレシスユニットに供給され、電圧を一定振幅の電流パルスに変換し、イオントフォレーシス微小電極に送達する。イオントフォレシス信号経路は、緑色の線で表される。データ取得およびイオントフォレーシス信号は、Wandaプログラムの制御下にあり、Wandaプログラムは、実験を定義するすべてのパラメータとともに、電圧対時間記録の形で各拡散記録の出力ファイルを生成する。第2のプログラムWalterは、出力ファイルを読み取り、ISM較正データを使用してデジタル化された電圧を濃度に変換する。濃度veその後、rsusの時間曲線はWalterに拡散方程式の適切な解に当てはめられます。媒質がアガロースであればDとn tが抽出され、媒質が脳であればλとαが抽出される。アナログ信号は実線です。デジタル信号は点線である。また、スライスを含む浴中に無関心の接地電極(図示せず)がある。赤線=イオン信号、青線=基準信号、緑線=イオントフォレーシスコマンド、実線=アナログ、点線=デジタル。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
3.イオン選択性マイクロ電極の作製と較正

図3:イオン選択性微小電極の調製。 ( a )毛細管の端部をチッピングして引っ張った後のISM(ステップ3.2~3.6):両端の単一バレルファーガラスキャピラリーが欠けている。 ISMは、細いチップを有する2つのマイクロピペットを生成するために、1つの二重バレルガラスキャピラリーを引っ張ることによって生成される。 ( b )両方のバレルをバックフィルした後のISM(ステップ3.7~3.9):単一のISMの先端を2~5μmの直径に切り刻む。イオン選択性バレルにはTMA-Clが充填され、基準バレルにはNaClが充填されています。 ( c )クロロトリメチルシランで被覆する前のISM(ステップ3.11-3.13):塩化バナジウム銀線を基準バレルに挿入する。ポリテトラフルオロエチレン(PTFE)配管を25G針に接続し、イオン選択性バレルに挿入する。歯科用ワックスを使用して、両方のバレルの上に気密シールを作成します。 ( d )クロロトリメチルシランでマイクロピペットをコーティングする(ステップ3.15-3.26):[低倍率]水平に取り付けられた実体顕微鏡に沿ってクロロトリメチルシラン中に懸濁したISM。 [高倍率]水平に取り付けられたステレオクロロトリメチルシラン溶液中のISMチップの溶液。顕微鏡でチップを可視化した後、少量のTMA-Cl溶液をイオン選択バレルから追い出す(TMA-Cl溶液の小さなバブルを生成するのに十分)。 ISMホルダーをタップしてTMA-Cl溶液のバブルを放出させ、次いでクロロトリメチルシランを先端に引き上げる。このサイクルは数回繰り返される。すべてのクロロトリメチルシランがISMから排出された後、ISMをTMA用の液体イオン交換体(LIX)に入れ、LIXをイオン選択性バレルの先端に引き込む。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
イオントフォレーシス微小電極の作製
注:イオン導入術の微小電極は、実験の当日に製作する必要があります。

図4:イオントフォレーシス微小電極の調製。 ( a )両方のバレルをバックフィルした後のイオントフォレーシス微小電極(ステップ4.1-4.3):毛細血管からイオントフォレーゼ微小電極を引っ張る。微小電極の先端は、2〜5μmの直径に削られている。イオントフォレーシス微小電極の両方のバレルにTMA-Cl溶液を充填する。 ( b )完了したイオン導入微小電極(段階4.5~4.6):2つの塩素化された銀線がバレルに挿入されたイオントフォレシス微小電極。微小電極のバレルはワックスで封止され、銀ワイヤは微小電極の後部で一緒にねじられる。/files/ftp_upload/55755/55755fig4large.jpg "target =" _ blank ">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
人工髄液および齧歯動物の脳組織切片の調製
6.アガロース中でのリアルタイムイオントフォレシス


図5:寒天培地における実験のセットアップ。 ( a )希釈寒天中の実験のためのセットアップ(ステップ6.1-6.5):希釈寒天を充填した小さな多孔質容器を、実行中の灌流チャンバーに配置する。イオントフォレーシス微小電極(左側)とISM(右側)を微小電極ホルダーで保持し、微小電極ホルダーは、ロボットマイクロマニピュレーターのアームにはめ込まれる。温度プローブを寒天ゲルに入れ、無関係の接地電極をpl浸漬チャンバ内に設置される。 ( b )寒天中の微小電極の拡大図:イオントフォレシス微小電極(左側)およびISM(右側)を10倍水浸対物レンズ(ここでは150mM NaClに浸したもの)を用いて寒天中で視覚化する。微小電極は、マイクロマニピュレーターを用いて1000μmの深さに配置される。微小電極間の間隔は120μmである。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

図6:Wandaコンピュータのソフトウェアインターフェイス ( a )WandaナビゲーションGUI(Graphical User Interface):Wandaソフトウェアを開いた後に表示される画面。ボックス(1)では、適切な培地、イオントフォレシス分子および技法が選択される。 (2)「キャリブレート」をクリックして開くワンダ較正ボックス。 ISM( 図6bおよび補遺B参照)を較正した後、プロトコルのステップ6および8に記載されているように、ISMを寒天または脳内に配置する。ボックス(6)には、実行されている実験のためのすべての適切な値が入力される。 (7) "Acquire"をクリックして録音します。 Wanda GUIの右上部分に電圧対時間のグラフが表示されます。 ( b ) ワンダのISMのキャリブレーション :ワンダGUIの(2)「キャリブレーション」をクリックすると開くウィンドウ。ステップ3.29からの値がボックス(3)に入力され、(4)「フィットデータ」が選択される。検量線は線形であることが確認されます。 (5)Wanda GUIに戻るには、 "Accept"をクリックします。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
アガロースのデータ解析

8.脳スライスにおけるリアルタイムイオントフォレシス
9.脳データ解析
10.トランスポート番号とISMキャリブレーションの確認
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RTI技術の有用性は、 αの変化および低浸透圧チャレンジ中の変化を測定するために設計された実験で実証されている( 図8および図9 )。以前に低張ACSFで洗浄することにより、ECSの浸透圧を低下させることはαの減少及びλ13の増加を生じさせることが示されています。
この実験において、RTIは、制御条件下および低張性ACSFのウォッシュ・オンの両方の条件下で、ラットの脳スライスで実施した。 ISMを製作し、その較正パラメータを、58.21mVの勾配( M )を計算したNicolsky方程式に適合させるためにWandaに入力した。 ISMおよびイオントフォレシス微小電極を寒天中に置き、輸送ニューロンを測定するために互い...
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図10:一般的な技術的問題を示す理想的でないデータ ( a )イオントフォレーシス微小電極による一般的な技術的問題の図:機能的イオントフォレーシス微小電極からのTMAの正常放出と、技術的問題を示す3つの供給源との比較。 [高倍率、a1]理想的なイオン導入源の電流は、TMA放出および塩化物の取り込みによって等しく運ばれる。 [高倍率、a2]低いn tを有するイオントフォレシス微小電極は、TMAが少なく放出し、通常より多くの塩化物を取り込む。 [高倍率、a3]電気浸透を示すイオントフォレシス微小電極は、TMA、塩化物および溶媒を放出する。 [高倍率、a4]経時的な放出増大( すなわち、 「ウォーミングアップ」)を示すイオントフォレシス微小電極。 ( b )非理想データのグラフo寒天で得られる:データはウォルターによっ...
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著者らは、競合する金銭的利益がないと宣言している。
この研究は、NIH NINDS助成金R01 NS047557によって支持された。
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| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
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| アガロー | ロンザ | NuSieve GTG アガロース #50081 | RTI測定用希薄アガロースゲルを調製 |
| ISM | Dagan | Model IX2-700 デュアル細胞内プリアンプ | イオンおよび参照電圧増幅器 N=0.1 (参照バレル用) および N=0.001 (イオンバレル用) ヘッドステージ |
| 生物学的化合物 ミスクロスコープ (4倍および10倍対物レンズ付き) | 微小電極の先端を削り、微小電極を検査するため。さまざまなサプライヤー、例 AmScope | ||
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| シラン化やイオン選択バレルの先端に液体イオン交換器を充填するための | 実体顕微鏡 | ||
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| シリンジフィルター0.22 µm 細孔 | Whatman | #6780-1302 | 埋め戻し溶液をろ過します; フィッシャー |
| シリンジ ニードル、28 ゲージ、97mm | ワールド プレシジョン インスツル | MicroFil MF28G-5 | から利用可能 マイクロ電極 |
| テフロン (=PTFE) チューブ | コンポーネント サプライ | STT-28 PTFE チューブ ライト ウォール (28 ゲージ) | イオン選択性バレルのシリナイズ用。BD PrecisionGlideニードル25 G x 5/8インチに適合します。注:テフロンは必須であり、PVCチューブはホットワックスによって溶けます。 |
| 温度制御システム | ハーバード | ワーナーモデルTC-344BとSH-27A | TC-344Bはデュアル自動温度コントローラであり、SH-27Aはインラインヒーターです。コントローラとヒーターはワーナースライスチャンバー |
| テトラメチアンモニウム(TMA)塩化 | シグマアルドリッチ | T-3411 | 5 Mソリューションで動作します。注意:急性毒性(経口、経皮、吸入)、発がん性、水生環境に有害、シグマ-アルドリッチ安全情報を参照してください 完全な説明については |
| 振動ブレードミクロトーム | ライカ | VT1000S | 脳スライスを切断しますキシ |
| レン | フィ | ッシャーX5-1 | ラン化のために;注意:可燃性、急性毒性(経口、皮膚、吸入)、皮膚腐食、眼の損傷、発がん性、完全な説明についてはフィッシャー安全情報を参照してください |
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