培養昆虫細胞における一過性発現および組換えタンパク質の細胞内局在

Summary

Nonlytic昆虫細胞発現系は、生産、細胞輸送/ローカリゼーション、および組換えタンパク質機能解析のために十分に活用されています。ここでは、市販の鱗翅目の細胞株で発現ベクターおよびそれに続く一過性のタンパク質発現を生成する方法について説明します。細胞内蛍光マーカータンパク質とタバココナジラミのアクアポリンの共局在も提示されています。

Abstract

異種タンパク質発現系は、組換えタンパク質の産生のために使用され、細胞輸送/局在の解釈、および副生物レベルでタンパク質の生化学的機能の決意。バキュロウイルス発現系は、ますます多数の生物工学、製薬、および産業用アプリケーションでのタンパク質生産のために使用されているが、ウイルス感染を伴わないnonlyticシステムは、明確な利点を持っていますが、見落とされがちと十分に活用されています。ここでは、nonlytic発現ベクターおよび過渡組換えタンパク質発現を生成する方法について説明します。このプロトコルは、組換えタンパク質の効率的な細胞内局在を可能にし、急速に細胞内タンパク質輸送を識別するために使用することができます。我々としても、虫タバココナジラミから2つのアクアポリンタンパク質を含む市販の昆虫細胞株の4つの組換えタンパク質の発現を示します細胞原形質膜のための特定の細胞内マーカータンパク質として細胞内リソソームのため。全ての組換えタンパク質は、組換えタンパク質の直接検出を可能にするそれらのカルボキシル末端にて蛍光タンパク質マーカーとのキメラとして製造しました。関心公知の細胞内マーカーの遺伝子についての構築物を保有するプラスミドを用いた細胞の二重トランスフェクションは、生細胞イメージングと細胞タンパク質局在化の改善された検証を可能にします。

Introduction

昆虫細胞発現系を用いた組換えタンパク質の生産は、真核生物のタンパク質の研究のための多くの利点を提供しています。すなわち、昆虫細胞は、適切に折り畳まれたタンパク質^1、2、3を製造するために有利であり、同様の翻訳後修飾、プロセシング、および哺乳動物細胞中に存在するもののようなメカニズムをソートを有します。昆虫細胞系もまた、典型的には、哺乳動物細胞株^4、5よりもメンテナンスのために、より少ないリソースとより少ない時間と労力を必要とします。バキュロウイルス発現系はタンパク質の特徴付けおよび治療のための組換えタンパク質の産生、ワクチン製造のための外来ペプチドおよびウイルスタンパク質の免疫原プレゼンテーション、マルチの合成を含む現在広く多くの分野で使用されているそのような昆虫細胞ベースのシステムであります - タンパク質複合体、グリコシル化タンパク質などの生産。 ^{1、2、4、6。}しかしながら、状況とは、バキュロウイルス発現は^3,7適用できないかもしれない、そしてnonlytic及び一過性昆虫発現系の使用がより適切であり得ます。具体的には、過渡的な昆虫細胞発現は、組換えタンパク質の迅速な合成のための可能性を提供し、ウイルスに課せられた細胞溶解を伴わない以下の開発とメンテナンスを必要とし、より良いタンパク質合成^7、8、9時の細胞輸送を研究するための手段を提供し^{、 10。}

このプロトコルは、2段階オーバーラップ伸長PCR（OE-PCR）を用いて、発現ベクターの迅速な生成を記載しています 11と大腸菌におけるプラスミドDNAの標準的なクローニング。プラスミドは、二重トランスフェクト市販の昆虫培養細胞に使用され、代表的なタンパク質を産生します。プロトコルは、2つの異なる蛍光標識細胞内マーカータンパク質の生産と使用を説明し、虫タバココナジラミから2つのアクアポリンタンパク質と共局在を示しています。以下のプロトコルは、OE-PCR、標的タンパク質の細胞局在のための昆虫細胞の維持およびトランスフェクション、および蛍光顕微鏡検査のための基本的な方法論を提供します。

Protocol

発現プラスミドの構築のための1 OE-PCR

注：OE-PCRで使用されるすべてのプライマーについては表1を参照されたいです。高忠実度DNAポリメラーゼの使用は、すべての増幅のために推奨されます。しかし、これらの酵素は、頻繁に残していないので、3' 、Taq DNAポリメラーゼを用いて簡単に、非増幅インキュベーションを行う必要があるに 『Aテール』 PCR製品TA昆虫細胞発現にそれらをクローニングする前ベクター。このプロトコルは、昆虫発現プラスミドが細胞内マーカータンパク質（二タバココナジラミアクアポリンタンパク質に、この場合）以上に目的の遺伝子のカルボキシル末端にインフレームで融合した蛍光タンパク質と、キメラタンパク質を保有生成する方法を示す（ 図1）。

1. 増幅の二つの独立したラウンドで構成さOE-PCRを使用して、生成する：（1）関心対象の遺伝子をコードする配列を（ タバココナジラミアクアポリン1：BtDrip1。 タバココナジラミのアクアポリン2：BtDrip2_v1）EGFPと呼ばれる緑色蛍光タンパク質変異体または（2）細胞内マーカー（ キイロショウジョウバエのセックスペプチド受容体とインフレームで融合：DmSPR; ホモサピエンスホスホリパーゼA2：HsPLA2）mCherryをコードする配列を有します。直接PIB / V5-Hisの-TAプラスミドに最終OE-PCR産物を連結。
   1. （ADおよび図1のA'-D」で示す）OE-PCRの最初のラウンドのために、対応する（ 表1においてイタリック体）（ 表1に太字で示す）遺伝子特異的センスプライマーおよびキメラアンチセンスプライマーを使用関心/細胞内マーカーの遺伝子の（終止コドンなし）最終15塩基対および3' オーバーハングを有する生成物を生成することが望ましい蛍光タンパク質（EGFPまたはmCherryを）の5 '末端の塩基対15です。
      注意：PCR条件については表2を参照してください。
   2. 別個のチューブにおいて、遺伝子specifを使用所望の蛍光の5 '末端からの関心/細胞内マーカーの遺伝子の3'末端から15塩基対と15塩基対を含み、キメラセンスプライマー（ 表1中の下線で示す）IC蛍光タンパク質アンチセンスプライマー5' オーバーハングを有する生成物を生成するタンパク質。
      注意：PCR条件については表2を参照してください。 PCRのテンプレートのいずれか、より好ましくは、所望の配列を保有するプラスミドDNA配列検証PCR産物であるか、またはすることができます。ここに記載される研究は、配列検証されたプラスミドを使用しています。
   3. （標準的な分子グレードアガロースを使用して）1％アガロースゲル電気泳動でPCR産物を分離します。
   4. 予想サイズ（ 表2を参照）、市販のDNAゲル抽出キットを使用して（このプロトコルで使用される特定のキットのための材料の表を参照）の生成物を切除し、精製します。
   5. 最終的なオーバーラップeを生成するステップ1.1.4からゲル精製したPCR産物を使用し（ - 図1の'D '' A'で示す）のXTension製品。関心/細胞内マーカーの遺伝子及び所望のキメラ配列を生成するための蛍光タンパク質に対応する遺伝子特異的アンチセンスプライマーのための遺伝子特異的センスプライマーを使用します。
      注意：PCR条件については表2を参照してください。経験的に、最終的な、完全長キメラPCR産物を得るために反応混合物に追加する最初のラウンドオーバーラップ伸長産物の最適量を決定する必要があるかもしれません。
   6. 1％アガロースゲル電気泳動により第二ラウンドのOE-PCR産物を分離します。市販のDNAゲル抽出キットを使用して製品を切除し、精製します。
   7. TAクローニングに必要な3'アデニル化（ すなわち、Aテイル）製品を生成するために、72℃で10分間のTaq DNAポリメラーゼマスターミックスの1個の単位でゲル精製し2回目のOE-PCR産物をインキュベートします。
   8. 結果としてアデニル化製品を結紮PIB発現ベクターへと化学的にコンピテントな（熱ショック）またはエレクトロ（エレクトロポレーション） 大腸菌細胞を形質転換するために、標準的な分子クローニング技術を使用します。適切な選択マーカー（ すなわち、アンピシリンまたはカルベニシリン）を含む培地上で一晩プレート。
   9. 5'-3'配向でのインサートを保有する発現プラスミドで形質転換されたインサート陽性コロニーを同定するためのベクター特異的プライマーとインサート特異的プライマーを用いたコロニーPCR ^12を実行します。予想サイズのPCR産物を生成するコロニーの一晩培養を準備します。
   10. （このプロトコルで使用される特定のキットのための材料の 表を参照） を製造業者の説明書に従って市販のDNA精製キットを用いてプラスミドDNAを単離します。直接DNA配列決定により、各挿入物の配列の完全性を検証します。

2。昆虫細胞培養メンテナンス

注：無菌状態を維持するために、層流フード内で組織培養フラスコの開口部を必要とするすべてのセルの操作を行います。少なくとも1時間に、層流フードUV殺菌ランプを点灯前に細胞操作します。ニトリル手袋を着用し、その使用前に70％エタノールでベンチ、ピペット、器具、チューブ、及びフラスコの表面を除染。基本的な細胞培養技術に精通して^13をお勧めします。

1. 無血清培地に適応し、T25組織培養フラスコ中で28℃で無血清昆虫培地中で接着単層培養としてそれらを維持しているTniの細胞（Trichoplusianiの卵巣組織に由来する確立された細胞培養線）を使用します。
2. 同様に、Sf9細胞（ スポドプテラ・フルギペルダの卵巣組織由来の確立された細胞培養線）を維持するが、TNM-FH昆虫培地サプリメントを使用して10％ウシ胎児血清（FBS）で編。
3. -80°Cから株式バイアルを削除し、それらを37℃の水浴中で解凍できるようにすることで、凍結させたSf9またはTniの細胞からの最初の培養をシード。解凍後、70％エタノールでバイアルを除染し、氷の上に置きます。
4. 新しいT25フラスコと転送解凍昆虫細胞懸濁液1mlに昆虫細胞培地4mlを加えます。 28℃、無加湿インキュベーター中、フラスコを置き、細胞を30~45分間付着することを可能にします。
5. 適切な培地5mlで播種培地を交換し、28°C無加湿インキュベーターにフラスコを転送します。毎日の細胞コンフルエンスを監視します。継代細胞彼らは90％コンフルエントに達します。
   注：T25フラスコの完全な被覆は約5×10 ⁶個の細胞に相当します。
6. 昆虫細胞通路。
   1. セル通路に、第滅菌5mLの血清学的ピペットを使用して、コンフルエント細胞を含むフラスコから排気媒体を除去します。媒体が離れ細胞単層から、一つのコーナーに流れるようにフラスコを傾け。慎重に細胞を乱すことなく、ピペットを用いて培地を除去します。
   2. 穏やかに新しい滅菌、5mLの血清学的ピペットを用いて無血清昆虫培地4mlでコンフルエントな単層を含有するT25フラスコをすすぐことによってTniの細胞を取り除きます。フラスコを横切ってピペットチップを移動し、徐々に緩くフラスコの底に付着した細胞を除去する灌漑。
      1. 、すべてのメディアを取り出すかけてフラスコを回し、そしてフラスコの底が明確であることを観察することによって、細胞の十分な剥離を確認してください。
   3. より密着したSf9細胞のために、新鮮なTNM-FH培地を4mLを追加し、付着細胞を取り除くために、セルスクレーパーを使用します。穏やかに混合し、細胞凝集を減らすために5 mLの血清学的ピペットを使用してください。
   4. 媒体の体積あたりの生昆虫細胞の数を推定するために、自動細胞カウンターを使用してください。 1.5 mLの細胞/培地混合物の0.1mLのを転送しますマイクロチューブ。別個0.5mLのマイクロチューブ中で、トリパンブルーの10μLに細胞/培地混合物の10μLを加えます。
   5. パッケージからセルカウンタチャンバースライドを削除し、計数スライドの各側に、細胞/培地/トリパンブルー混合物10μLを加えます。セルカウンタにスライドを挿入し、細胞密度及び生存率を決定します。
   6. 細胞密度を使用して、新しい滅菌T25フラスコに（5 mlまで）昆虫細胞培地の適切な量を計算し、追加します。
   7. 新鮮な培地でT25フラスコに約1〜1.5×10 ⁶個の細胞を移します。細胞株、日付、使用する培地、添加した細胞の数、および継代数（P _N P _Nが細胞の前世代の通路番号+ 1世代）でフラスコを標識します。そして最大72時間、28℃のインキュベーターにフラスコを置きます。
      注：昆虫細胞は、連続的に増殖させることができる、細胞をトランスフェクションおよび/または異種にそれほど受け入れてもよいが30回の継代後のタンパク質発現。処分する前に、10％の漂白剤溶液とオートクレーブ使い捨てのプラスチック製の陶器で全て破棄されたセル/メディアを扱います。

3.昆虫細胞トランスフェクション

1. 適切な昆虫細胞培地（TniのおよびSf9細胞のためのTNM-FHのための無血清昆虫培地）中に1×10 ⁶ Tniの又はのSf9細胞をT25フラスコに播種し、28℃で72時間コンフルエントに成長します。
2. 削除し、古い培地を廃棄し、新鮮な無血清昆虫培地の4 mLで細胞を取り除く（ステップ上記の2.6.2と2.6.3を参照）。
3. （上記ステップ2.6.4を参照）自動細胞カウンターを用いて細胞密度を推定します。
4. 個々の35mmガラスボトムディッシュに約7×10 ⁵個の細胞を加え、細胞を28℃で20-25分間付着することを可能にします。
5. 各トランスフェクションのために、プラスミドDNA2μgのを追加する（いずれかを実行するための2つのプラスミドのそれぞれからの単一のトランスフェクションのために1つのプラスミドまたは2μgのから滅菌した1.5 mLのマイクロチューブでのSf9およびTniのトランスフェクション）の両方のためのFBSなしの無血清昆虫培地（0.1mLのにUBLEトランスフェクション）。
6. 別個のチューブにおいて、無血清昆虫培地の0.1mLのトランスフェクション試薬の8μLを混合し、次いで、目的のプラスミドDNAを含むチューブに、その溶液を移します。軽くボルテックスし、20 RTでインキュベート - 30分。
7. 総容量を1mlに等しくなるように無血清昆虫培地0.8 mlのステップ3.5および3.6からのプラスミドのトランスフェクション混合物を希釈します。
8. 慎重に付着した細胞を含有するガラス皿からメディアを取り出します。希釈したプラスミドをトランスフェクション培地で付着した細胞をオーバーレイ。
9. 5時間28℃で細胞をインキュベートします。
   注：トランスフェクションのための条件は、最大のトランスフェクション効率（のための経験的な最適化を必要とし、例えば、一晩トランスフェクションよりもむしろ5時間、使用されるプラスミドDNAの量は、トランスフェクション試薬の化学的性質など 、使用していました。）。
10. 削除し、トランスフェクション培地を廃棄し、細胞を穏やかに落とさないように注意しながら、無血清昆虫培地1mLで細胞を洗浄。
11. 新鮮な昆虫細胞培地（Sf9細胞用TniのとTNM-FHのための無血清昆虫培地）を2mLを添加し、48〜72時間28℃でインキュベートします。
    注意：ここでも、条件が最大の異種タンパク質の発現のための経験的な最適化が必要。

4.共焦点蛍光顕微鏡

1. 48〜72時間のトランスフェクション後に、IPL-41昆虫培地1mLで細胞を1回洗浄し、次いで2mLのIPL-41イメージングのためで覆います。
   注意：この洗浄工程は、通常の細胞の維持に使用される昆虫細胞中で観察されたバックグラウンドの自己蛍光を減少させます。
2. 媒体（このプロトコルで使用される特定の核染色のための材料の表を参照）ヘキスト生細胞染色試薬の4滴を添加し、20~25分間28℃でインキュベートします。
   注：追加のNUC染料は、EGFPとmCherryをから固有の蛍光プロファイルを有するべきであるリア汚れは、置換されていてもよいです。
3. 自己囲まれたレーザー走査型共焦点顕微鏡に35mmディッシュ（このプロトコルで使用される特定の機器のための材料の表を参照）を置​​きます。
4. ヘキスト、EGFP、およびmCherryを観察条件用顕微鏡調整：ヘキスト励起/放出 - 461分の359 NMと、 EGFP励起/放出 - 510分の489 NM。 mCherryを励起/発光 - 610分の580 nmの。
5. 蛍光発現を確認した後、60X位相差水浸対物レンズを使用してスキャンモードに切り替える10X対物レンズを用いて最初のスキャンを実行します。
6. 画像コントラスト及び解像度を最適化するためのレーザパワー（5~7％）、検出器感度（47から49パーセント）、走査速度、Z軸の深さ、およびデジタルズームを調整します。画像1.5倍デジタルズームにおける細胞は90X増幅の合計を得ました。
   注：顕微鏡パラメータは最適のための経験的な調整が必要画像の収集および使用中の機器に対して特異的であってもよいです。
7. TIFF画像ファイルとして生データをエクスポートし、フィギュアの世代のために（作物とオーバーレイ）を変更します。

Results

OE-PCR

OE-PCRは、一旦関心と蛍光マーカータンパク質のいずれかの試験遺伝子に対応する組換えキメラタンパク質の産生を可能にする、発現ベクターに挿入し、キメラDNA産物の合成を可能にします。 図1は、蛍光タンパク質マーカーEGFPとインフレームでコード配列（BtDrip1とBtDrip2_v1）のアクアポリンタバココナジラミを含むPIB発現ベクターを製造するための一般的なスキームを表します。このシナリオでは、それらのカルボキシル末端にEGFPを含む二BtDripキメラタンパク質を作製しました。このプロトコルはまた、それらのカルボキシル末端にmCherryを有するキメラとして生成された2つの昆虫細胞内マーカータンパク質、DmSPR及びPLA2G15（ 図1）を 、開発するための方法を実証しました。それらの発光スペクトルが十分に発散されているので、EGFPとmCher...

Discussion

異種タンパク質発現系は、多くの下流の用途⁴で使用される組換えタンパク質の生産のための重要なツールです。利用できる多様な発現系から選択することが目的のタンパク質のための最終的な目標に依存します。いくつかの昆虫細胞発現系は、原核生物と真核細胞発現系^5、6への柔軟な選択肢を提供しているご利用いただけます。タンパク質の発現を駆動するためのバキュロウイルス感染を必要とするの昆虫系は、研究と治療への応用^1、2、3で使用される多くのそのようなタンパク質と、これまでで最も人気があり、広く使われている昆虫系です。バキュロウイルス発現は、しかし、ことを含む、制限があるん：1）は、ウイルスのライフサイクルは、宿主細胞の溶解を伴います。 2）溶解された宿主細胞は、典型的には、高AMOを放出します分解酵素のunts...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
KOD DNAポリメラーゼ	EMD Millipore	71085-3	オーバーラップ拡張PCR産物のPCR増幅に使用されるハイフィデリティDNAポリメラーゼ
ExTaq DNAポリメラーゼ	TaKaRa-Clontech	RR001B	PCR産物のA-tailingに使用されるDNAポリメラーゼ
EconoTaq PLUS GREEN 2x DNAポリメラーゼマスターミックス	Lucigen	30033-1	細菌コロニーPCR
に使用されるDNAポリメラーゼBiometra TProfessional Gradient Thermocycler	Biometra/LABRepCo	070-851
Agarose LE	Benchmark Scientific	A1705
SYBR Safe DNA Gel Stain	ThermoFisher	S33102
Montage DNA Gel Extraction Kit	EMD Millipore	LSKGEL050
pIB/V5-His TOPO TA Expression Kit	ThermoFisher	K89020	直鎖状およびトポイソメラーゼI活性化pIB/V5-His-TOPOベクター、One Shot TOP10ケミカルコンピテント大腸菌、食塩溶液など、オーバーラップ延長PCR産物のクローニングに必要な成分が含まれています。
QIAprep スピン MiniPrep キット	Qiagen	27104
QIAcube ロボットワークステーション	Qiagen	9001292
清浄機 垂直 クリーンベンチ	Labconco	3970401
Tni 培養昆虫細胞 遺伝子	対立遺伝子 バイオテクノロジー	ABP-CEL-10005
Sf9 培養昆虫細胞 遺伝子	対立遺伝子 バイオテクノロジー	ABP-CEL-10002
無血清昆虫培養培地	対立遺伝子バイオテクノロジー	ABP-MED-10002
TNM-FH 昆虫培養培地	対立遺伝子バイオテクノロジー	ABP-MED-10001
IPL-41 昆虫培地	サーモフィッシャー	11405081
セルフェクチンIIトランスフェクション試薬	サーモフィッシャー	10362100
16cm使い捨てセルスクレーパー	サーシュテット	83.1832	セル2ポジションブレード付きスクレーパー
25 cm2 (T25) ベントフィルターキャップ付き組織培養フラスコ	ライフサイエンス製品	CT-229331
トランスファーピペット	フィッシャー	1371120
滅菌済み、50 mL バイオリアクションチューブ	ライフサイエンス製品	CT-229475
ピペットボーイ	VWR	14222-180
5 mL セロロジーピペット	Sarstedt	86.1253.001
0.5 mL フラットキャップ PCR チューブ	フィッシャー	14230200
ポリプロピレン バイオハザード オートクレーブ バッグ	フィッシャー	01828C
35 mm #1.5 ガラス底皿	松波ガラス	D35-14-1.5-U	皿径 35 mm 皿径 14 mm ガラス 直径 1.5 mm ガラス厚 コーティングなし
インキュベーター モデル 1510E	VWR	35823-961
Countess II FL Cell Counter	ThermoFisher	AMQAF1000
Countess Cell Counting Chamber Slides with 0.4% Trypan Blue Reagent	ThermoFisher	C10228
Fluoview FV10i-LIV レーザー走査型共焦点顕微鏡	Olympus	FV10i-LIV
HsPLA2/pCS6 plasmid DNA	transOMIC Technologies	TCH1303
pmCherry Vector	Clontech	632522
NucBlue Live ReadyProbes 試薬 (Hoechst 33342)	ThermoFisher	R37605