方法論記事

ラットの断面アキレス腱の治癒過程に及ぼす同種多血小板血漿 (PRP): 方法論的説明

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DOI：

10.3791/55759

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2018年3月19日

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1Experimental Surgery, GIGA-R & Credec, University of Liège, 2Laboratory of Connective Tissues Biology, GIGA-R, University of Liège, 3Department Argenco, University of Liège, 4Department of Clinical Biology, University Hospital of Liège, University of Liège, 5Physical Medicine and Sport Traumatology Department, FIFA Medical Center of Excellence, University Hospital of Liège, University of Liège

この記事について

サマリー

このプロトコルでは、アキレス腱の部分を削除した後同種多血小板血漿 (PRP) と食塩水注入されているラット腱治癒の評価プロセスについて説明します。腱治癒の進行状況は、別のタイプの解析を使用していくつかの時点で評価されます。

要約

この資料では、PRP が積極的に腱の治癒に影響かどうかを観察する実験手順について説明します。4 主な手順があります: アキレス腱; で病変を誘発します。PRP を準備し、それ (または食塩液) を注入腱; を削除します。分子、生体力学的および組織学的評価を行います。各ステップでは簡単に再現できるように、すべての手続きと方法の詳細に説明されます。

アキレス腱は、外科的切片 (5 mm 長いセクションの除去) をされています。その後、PRP や食塩は、PRP が腱の治癒に肯定的な効果を持つかどうかを研究する注入しました。40 動物 (ラット 120 の合計はこの研究で使用された) の 3 つのグループ、2 つのサブグループに細分された: PRP 投与群と生理食塩水注入制御グループ。ラットが増加 (グループ a: 5 日の時点で犠牲になったグループ b: 15 日;グループ c: 30 日) 腱が削除されました。90 腱が生体力学的トランスクリプトーム解析を実行する前にテストを受けたし、30 の残りの腱組織学的解析提出しました。

概要

凝固、炎症性プロセス、および血小板の免疫変調の役割はよく知られている1 です。最近では、修復プロパティ2,3がまたあることが実証されています。確かに、様々 なサイトカインや成長因子 (IGF、TGF B、PDGF VEGF- ・ HGF) 脱顆粒中に血小板によって解放されます。これらの成長因子は、血管新生、組織の改造、および創傷治癒 (骨、皮膚、筋肉、腱)2を促進します。多血小板血漿 (PRP) 分離法によって高い血小板濃度が含まれているを生成する自己血を遠心分離 (3 間と 10 回血のベースライン濃度)。確かに、さまざまな PRP 作製手法は、同じ最終製品を提供できません。これまでは、この問題に関する国際の一般協定がないがあった。全体的にみて、PRP は、寛解、足底筋膜炎、変形性関節症、偽関節4など、慢性的な筋骨格の条件を治療するための魅力的な治療オプション可能性があります。それは改善し、歯科インプラントを配置した後治癒を加速する口腔外科とインプラント4で初めて使用されました。本研究では動物実験4の PRP の買収ができる再現性のある方法をについて説明します。

腱の病変は、スポーツマン、物理的な労働者に多く認められ, 大きな関心5が癒しのプロセスとリカバリの時間を短縮を強化します。新しいの多くを開発している治療法は、成長因子の使用を伴うし、PRP の管理は内因性の成長因子4のブレンドを提供するシンプルで低侵襲の方法。

いくつかの生体外でまたは動物の研究は生物の仲介人の解放によって血小板の高レベルを含むプラズマの管理が生物学的調停6 を解放することによって腱・靭帯の修復を刺激することを実証しています。、7,8,9。さらに、他の研究は、PRP が私と腱の III コラーゲン産生細胞の9,10,11種類を刺激することが示されています。それは、PRP するマトリックスメタロプロテアーゼ (Mmp) の活性化が低下し、ため、行列の分解を減らすことも示唆されています。炎症プロセスに関与している細胞は、MMP-9、組織の改造 (生理・病理) 炎症12誘導の役割を果たすを生成できます。

この情報に基づいて、我々 は単一 prp 血小板注入断面のアキレス腱にラットの回復プロセスと修復組織の機械的強度を改善することを仮定しました。これは、回復処理中に腱の力学的特性を測定することによって、コラーゲンの新しく形成された組織のリモデリングを評価する組織学的および分子の解析を実行することによってテストされます。研究の目的は、同種 PRP の単回投与が断面のアキレス腱の治癒に影響を与えるかどうかを観察することだった。

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プロトコル

動物の手入れと取り扱いは心配のためのガイドに従って行われた化と全米科学アカデミーにより作製した実験動物の使用健康国立研究所 (アメリカ) での公開ヨーロッパおよび国の立法は慎重に続いていた。

1. 動物の準備

  1. 132 2 ヶ雄 Sprague-dawley ラット体重 320 450 g (実験のため 120 ラット) および 12 のラットの採血、図 1を使用します。Dell の13に基づき、グループごとに 15 のラットは 0.8 (指定の効果が存在する場合、統計的有意性を見つけることの 80% のチャンス) の力のために十分だった。
  2. 変化する駅を備えた従来施設の分離条件下で古典的なケージの中ですべてのラットを家します。購入されて具体的には SPF (特定病原体無料) ラットと下大静脈 (個別換気ケージ) ラックに繁殖を扇動します。
  3. 次の住宅条件を使用: 19-24 ° C の温度範囲相対湿度: 40 ~ 60%;換気: 空気更新の頻度: h; あたり 10-15ダーク/ライト サイクル: 12 12 h。
  4. すべてのケージ装置を殺菌および照射の寝具を使用します。全身ケージ内部滅菌の段ボールのトレイとタオルを置くことによって豊かなケージを実装します。
  5. 限定された状況でゾーンへのアクセスを許可する: 入口に新しい研究室コート、マスク、手袋、履物、および髪ボンネット。
  6. 植民地状態監視の歩哨動物 Felasa14従来設備指針によると、年間ベースで汚れた寝具の収納を行います。ケージ、適切な照射あたり 4 ~ 5 動物の食事提供維持酸性水自由です。毎日監視します。
  7. 手術室手術前に 2 h にトップのケージをフィルタ リングの外科介在のため選出されたラットを転送します。

2. 手術

  1. 手術器具の準備: はさみ、クランプ、2 つの止血クランプ、針ホルダーの罰金します。すべてのプロシージャの間に手袋、マスク、フード、実験用の上着を着用します。
  2. ラットを 2 つのグループ (PRP ・食塩) にランダムに分割します。
  3. そのケージのラットを取るし、それの重量を量る。ラットを識別するために番号の付いた耳タグを使用します。目の乾燥を避けるためには、角膜に水滴を配置します。
  4. 腹腔キシラジン (10 mg/kg 体重) とケタミン (80 mg/kg 体重の) ラットを麻酔します。Anesthetization を確認するには、心肺監視および任意の目の反射のチェックの下で動物を配置します。
  5. ブプレノルフィンの 50 μ L を皮下注入 (0.01 0.05 mg/kg ごとの 8-12 h) に鎮痛剤として頸部領域。
  6. 左後肢を電気シェーバーで剃る、3 iso betadine/アルコール (希釈 1:10) ソリューションのスクラブを交互に消毒、ラット解剖顕微鏡の下で暖かいパッド (20 ° C) にします。場所優れた位置で操作する足側臥のラット。手術用鉗子の足を保持します。
  7. はさみを使って、左アキレス腱の周囲の皮膚に小さな横切開 (20-25 mm) は、そして高級はさみを使用してアキレス腱複合体 (図 2 a) を公開する筋膜を解剖します。
  8. はさみ (図 2 b) と足底腱を削除します。
  9. アキレス腱ノテクノロジー 5 mm カット、踵骨の挿入する近位とはさみを使用して 5 mm 長い部分を削除します。(図 2 c、2 d) 腱を縫合しないで。
  10. -6 オーバージェット縫合 (連続縫合) をやって吸収性の糸で、皮膚と筋膜を縫合します。モノフィラメント縫合糸は、外科的切開を皮膚から発散性を防ぐためにも使用できます。
  11. 目を覚ましまで暖房ランプの下でラットを置き、ケージ (58 x 38 cm) に戻ってラットを置き (ノタベネ: 固定が適用されません)。

3. PRP 作製15

  1. 腹腔内投与によってキシラジン (10 mg/kg 体重) とケタミン (80 mg/kg 体重) ドナー ラットを麻酔します。Prp 血小板注入は、任意の日時麻酔せず術後 2 時間実施されています。
  2. 鎮痛剤としてブプレノルフィンの 50 μ L を皮下注入します。
  3. 全血を収集 (ラット、あたり 20 mL 最終出血) 生殖不能の管に心臓穿刺で 3.2% を含むクエン酸ナトリウムをバッファー (0.109 M 抗凝固剤)。その後、心腔内注入によるラットを安楽死させます。
  4. PRP を得るためには、150 × g、室温で 10 分間の血液を遠心します。この初期の低速遠心分離のステップをもたらす 2 つのフェーズ: 赤い血球 (赤血球) の総容積の約 80-90% を占めているから成る下相と多血小板血漿 (PRP) (通常 10-20% の血液から成る上部の段階サンプル)。
  5. 優しくプラスチック転送ピペットを使用してセカンダリ ・ プラスチック製のチューブで PRP (上相) を収集します。PRP と赤血球間のインターフェイスは非常に緩やかな、ないインターフェイスに近すぎるピペットを行います。ときに適切に処理、PRP で赤血球を汚染 103セル x 0.05 以下でなければならない/μ L。 残りのより低い段階と、主な採血管を破棄します。
  6. 収集した PRP のボリュームを決定し、血球計数装置で血小板数を測定します。これらの値は、次の手順で血小板濃度を調整するための計算に必要です。血球数はまた赤血球の潜在的な汚染の評価に有用とこの段階で PRP に白血球血小板濃度は通常 1-1.5 x106/µL。
  7. 1,000 × g、室温で 10 分間の PRP の 2 回目の遠心分離を実行します。この高速遠心分離のステップには、緩やかな血小板ペレット及び自家血小板貧しい血しょう (PPP) から成る上澄みが得られます。破棄するのには、PRP を集中し、2.5 の最終濃度に到達する上清の体積を計算手順 3.6 で決定された値を使用して x106/µL。
  8. ゆっくりステップ 3.7 で計算された最終的な容積の約 3 分の 2 を残して転送プラスチック ピペットを使用してセカンダリ プラスチック チューブに上清 (PPP) を収集します。ペレットは緩いので、PPP が破棄されると、可能性があります最終的な望ましい集中を減らし、血小板のかなりの量が失われます。
  9. 慎重に優しく繰り返しピペッティングによる残りの上清による血小板ペレットを再懸濁します。この濃縮 PRP に血小板数を測定します。必要に応じて、最終的なターゲット濃度に到達する自家 PPP の適切なボリュームを追加します。
    注: は、準備の 3 h 以内 PRP を使用します。
  10. CaCl2を 50 μ l 添加 (11 mEq 10 mL) PRP 血小板をアクティブにするの mL あたり。
  11. 21 G 針で準備の後の縫合操作サイト約 1 h に直接新鮮な PRP の食塩液 50 μ L を挿入します。この時間の間には、室温で PRP を維持します。
  12. 手術後、アキレス腱の除去の前に日の間にラットの機能回復を密接に監視します。

4. アキレス腱と生体力学の試験16の除去

  1. 5、15、または 30 日後5ラットの重量を量る。その後、キシラジン (10 mg/kg 体重) とケタミン (80 mg/kg 体重) 腹腔内投与による麻酔します。
  2. 鎮痛剤としてブプレノルフィンの 50 μ L を皮下注入します。可能な限りの生理学的条件を保つために動物を犠牲にする前に、腱を削除します。
  3. 左後肢を剃るし、解剖顕微鏡の下でラットを配置します。場所優れた位置で操作する足側臥のラット。指を使って足を保持します。
  4. 小切開 (10 mm) は、以前のサイト運営と上腕三頭筋 suralis は公開まで延長します。
  5. 癒しのアキレス腱を削除、ノテクノロジー 5-10 の mm の踵の骨遠位のアキレス腱付着するカットします。アキレス腱断裂 (図 3 b) に接続されている上腕三頭筋 suralis の一部を切り裂きます。筋の部分は、クライオ顎 (図 3 cd) に収まるように十分な大きさでなければなりません。クライオ顎にすぐにサンプルを配置使用鉗子 (図 3e)。
  6. 骨筋腱複合体を除去した後に、ネンブタール (200 mg/kg) と心腔内注入によるラットを安楽死させます。心臓のリズムと 15 分間呼吸がないことを評価することによって死を確認します。
  7. 上顎 (図 3e) に筋ユニットを置いて、それを閉じて、万能試験機に垂直方向に配置 (106.2 kN、図 3 a)。マシン (図 3 f) の下のクランプの間の骨を修正します。
  8. 筋肉を固定できるので、桁、腱よりも硬めで、引張試験の中には変形せず上顎盆地の両方に液体窒素を追加します。
  9. 凍結ゾーン金属クランプ枠に達したとき、腱、その構造を維持するために引張試験を開始します。破裂まで 1 mm/s の一定速度で機械の変位速度を設定します。コンピューターにニュートン (N) を与えられた最終的な引張強さ (UTS) を記録します。
  10. 断面積を計算するには、楕円状を形成、互いに垂直な 2 つのカメラを配置し、写真を撮る。
  11. 腱組織の断面積の差を考慮して組織に機械的ストレスを表す単位面積 (1 平方ミリメートルあたり N) に UTS を正規化します。

5. 組織学的解析

注: 各グループの 15 の腱は、組織学的解析を施行した.

  1. 除去した後すぐにその構造を維持するために 4% パラホルムアルデヒドでアキレス腱が水没 (組織の 1 mm は固定、1 時間あたりの固定時間は腱のサイズによって異なりますので)。
  2. 70% エタノールで、パラホルムアルデヒドを交換し、このソリューションで、少なくとも 1 泊分のサンプルを残します。
  3. 穴と小さなプラスチック容器に腱を置き、1 h の新鮮な 70% エタノール溶液にそのコンテナーを配置します。
  4. 場所 1 のための 95% エタノールでコンテナーを繰り返します。
  5. 場所 1 のための 100% エタノールでコンテナーを繰り返します。
  6. 場所 1 のため 100% キシレンでコンテナーを繰り返します。
  7. 今流動パラフィン (56 ° C) で、腱を含まれているプラスチック製の容器を置き、一晩おきます。
  8. (溶融ワックス、ホット プレート、コールド プレートを装備) 埋め込みステーションを使用すると、組織サンプルに最適な金型を選択し、少し流動パラフィン ベースが覆われているので、それを記入します。
    注: オリエンテーション ミクロトームで垂直方向のセクションを取得するサンプルです。
  9. サンプルが正しく配置されて、液体パラフィン包埋モールドを埋めるし、冷凍機の上にそれを置きます。それは、少なくとも 15 分間クールダウンみましょう。
  10. パラフィン ブロックから削除し、少なくとも 30 分間氷の上に置きます。
  11. いくつかのきれいなガラス スライドを準備し、それらを脱イオン水のいくつかの滴を置きます。
  12. ミクロトームで 5 μ m (腱の中央部からのみ使用セクション) のセクションのブロックを切り取り、スライドのセクション。
  13. パラフィンはちょうどガラスに組織を結合するために溶かすに開始できるようにいくつかの分の 65 ° C で加熱オーブンでスライドを配置します。
  14. スライス ホルダーにパラフィン セクションを含むスライドを配置します。
  15. 今 deparaffinize し、組織を次の連続したお風呂に置くことで水分補給。
    キシレン (バス 1) で 8 分
    キシレン (バス 2) では 4 分
    100% エタノールで 2 分
    95% エタノールで 2 分
    70% のエタノールの 2 分
    脱イオン水で 2 分
  16. ヘマトキシリン ・ エオジン染色、次のソリューションで、組織を配置します。
    1. ヘマトキシリン液 (1 g ヘマトキシリン一水和物、0.2 g 畿央3、50 g AIK (その4)2.12H2O; 200 mL グリセリン; 蒸留水 1 L に調整) で 8 分間組織を浸します。
    2. 水道の流水下で 8 分のための組織を浸します。
    3. 30 の組織を浸すエオシン液 (100 mL の蒸留水を 200 μ L の原液の酢酸を含むに 0.25% エオシン) s。
    4. 水道の流水下で 2 分のティッシュを浸します。
  17. マッソンのヒアリン汚損のため以下の手順を実行します。
    1. 水分補給の後鉄ミョウバン (0.5 g (NH4) Fe (その4)2.12H2O 10 mL H2O) とコンテナーのセクションに配置し、コンテナーを閉じます。280 W 電子レンジで 3 分のためにそれを熱します。
    2. それ分のクールダウンし、脱イオン水ですすいでみましょう。
    3. Regaud のヘマトキシリン液を密閉容器にセクションに配置 (0.5 g ヘマトキシリン 50 mL H2O 50 ° C での溶解には 5 mL 95% エタノールとグリセリン 5 mL、追加)、90 のために熱・ w ・ 280 s
    4. 脱イオン水ですすいでください。
    5. 3 分 (メタノール飽和度) でピクリン酸溶液セクションに配置、水道の流水下で 5 分間洗浄、数秒間脱イオン水でそれを置きます。
    6. 5 s とすすぎセクション配置酸フクシン (50 mL H2O 0.25 mL 原液の酢酸を含む 0.5 g) に今、色素が消えるまで水道水を実行して下。
    7. リンモリブデン酸溶液 (50 mL H2O で 0.5 g) 5 分間セクションを孵化させなさい、脱イオン水で、数秒間それを配置します。
    8. 別 5 分間ライト グリーン (50 mL H2O 0.25 mL 原液の酢酸を含む 0.5 g) ソリューションのセクションに配置し、色素が消えるまで水道水を実行して下に置きます。
  18. 今もう一度ティッシュを脱水します。
    1. 70% エタノールで 1 分間セクションを浸します。
    2. 95% エタノールで 1 分間セクションを浸します。
    3. については、100% エタノールに 1 分浸します。
    4. キシレン (バス 1) で 1 分間セクションを浸します。
    5. キシレン (バス 2) で 1 分間セクションを浸します。
    6. あまりキシレンを削除せずにセクションを削除し、サンプルにメディアをマウントのドロップを置きます。
    7. (任意の気泡をさせられる) なし上観察を入れて、それに少なくとも 2 時間を強化できます。
    8. 3 h の 6 N 塩酸の各グループの (それぞれ異なる腱) 5 の組織の切片を加水分解し、5 μ m 無染色セクションのインデックスとしてヒドロキシプロリンを測定することによってコラーゲンの濃度を決定します。
  19. 製造元のソフトウェアを使用して断面積によって結果を正規化します。
  20. ライト グリーン染色を視覚化し、コンピューター支援によるフィブリル型コラーゲンを定量化するとセクションのいくつかを染色します。
  21. セクションをスキャンし、IrfanView ソフトウェアを使用して灰色のニュアンスで画像に変換します。半定量化 (例えば数量 1 つ) のソフトウェアを使用します。

6. 分子評価

  1. 機械的テスト中に発生する腱断裂後のサンプル、スナップがそれらを液体窒素で凍結し、-80 ° C (PRP ・食塩)17に保管します。
  2. 市販の総 RNA キットを使用して総 RNA17を切り離します。
  3. コラーゲンの発現を測定 (Col I とコル III)、マトリックスメタロプロテアーゼ (MMP 2、MMP 3 と MMP-9) と RT-PCR17,18tenomodulin (TNMD)。
  4. 28 秒19のレベルに mRNA の発現レベルを正規化します。

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結果

結果は、平均の平均 ± 標準偏差として表現し、分散分析 (ANOVA) と比較しました。双方向分散分析とホックを投稿テスト デ Scheffé パラメトリック テスト、使用されました。

ラットの非負傷したアキレス腱の破裂を誘発するために必要な最終的な引張強さ (UTS) あった 42.0 ± 5.7 N (n = 10)。引張強度が有意に増加した (p < 0.0001) 5 日後両方のグループで。両群れを比較すると、UTS は、特に 15、30 日で測定された時間で PRP 群だった。生体力学的評価 (11.4 ± 5.5 mm2の非負傷した腱) を受ける前に削除された腱の断面積を測定することにより 5 日で生理食塩水群で大きいがいたことが分かった。この量だった (図 4および図 5) 生理食...

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ディスカッション

血小板は治癒過程の腱の炎症性早期に不可欠です。これらの血小板は、結合組織や血液凝固因子にさらされている、彼らは α 顆粒に貯蔵される成長因子を解放します。この相互作用による細胞外マトリックス高分子 synthetized、間葉系細胞が増殖します。血小板も血管新生を強化し、細胞の分化6,20を刺激、血液循環前駆細胞の走化性活性があります。

行われていた生体力学の試験前のヴィヴォ引張試験ラット15アキレス腱のため特別締め金で止める装置を使用します。クライオ顎筋の凍結液体窒素を追加することによってでき、供試体の下の部分は、踵の骨はマシンに直接固定します。それは非常に重要な筋肉が完全に剛体が、腱がまだ柔軟な引張試験を開始します。この手法は、組織の損傷を回避し、機械的完全性が保持されます。またこの手法は簡単、安全、非圧縮、実証できる再現可能なようにいくつかの研究は、この法4<...

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開示事項

利害の対立が宣言されていません。

謝辞

本研究は、スタンダールリエージュ支えられて、レオン Frédéricq 資金の助成金ルジューン-Lechien。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
キシラジン(キシルM)VMD非麻酔薬
ケタミン(Jéタミン1000 CEVA)CEVAサントé動物無麻酔薬
ブプレノルフィン(Vetergéシックマルチドーシス)ALSTOEなし鎮痛剤
iso-ベタジンMEDA-Pharmaなし消毒剤
吸収性糸Vicryl 6/0ジョンソン&;ジョンソン
ネンブタールCEVAサントé動物なし麻酔薬
パラホルムアルデヒドSigma-AldrichP6148組織の構造を保持
イソプロパノール 100%VWR20,922,364
エタノール 95%VWR20,823,362
キシレンVWR28973.363
パラフィンVWRLEIC3950.1006
ヘマトキシリンミリポア1.15938.0025着色剤
エオシンミリポア1.15935.0100着色剤
ユーキットシグマ - アルドリッチ3989取り付け 中
CaCl2

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