外ヴァーサ栄養血管の血流をブロックすることにより腹部の大動脈瘤の齧歯動物モデルの作成

サマリー

大動脈内腔と大動脈の縫合結紮にポリウレタン製カテーテル挿入、外栄養血管の血流の低下による慢性的な低酸素症を誘発します。この記事では、人間の AAA のものと同様の特性を持つ腹部大動脈瘤 (AAA) の新たな動物モデルについて説明します。

要約

ヴァーサ号外管の脈管 (VV) は、酸素、大動脈壁の栄養を提供します。大動脈壁における低酸素には、拡大された腹部大動脈瘤 (AAAs) 可能性があります。この記事で紹介し、大動脈内腔と上腹部大動脈の縫合結紮にポリウレタン製カテーテル挿入の組み合わせで作成された外 VV 低灌流を AAAs を誘導するために使用される標準プロトコルです。

プロトコルは、食糧および水の自由が提供される 300 から 400 グラムの重量を量る雄ラットの使用を含みます。腹側正中腹部切開で開腹、大動脈の剥離が実行されますと、血管周囲組織からの血流をブロックします。大動脈腎動脈の枝に隣接して小さな切開を含むを実行し、18 g 留置針を用いたポリウレタン製カテーテルが挿入されます。切開部を修復した後、カテーテルを大動脈のタイトな結紮は大動脈の血流を乱すことがなく大動脈壁から近位方向から VV 血流をブロックします。この手法は、進行性の大動脈拡張と AAA を引き起こすことができます。

このモデルの最大の利点は、VV 低灌流が組織低酸素症および形態学的および病理学的特性を人間の AAA のものに似ている上、AAA の開発を引き起こすことです。

概要

腹部大動脈は次の 3 つの層から成る: 血管の内壁 (内膜)、内側層 (メディア)、および外側の血管壁 (膜) と、これらの外膜がユニークな血液供給システム (VV) 栄養血管、として知られています。大動脈組織は外 VV 灌流と大動脈血流¹から簡単な酸素の拡散によって酸素が供給されます。ただし、地理的に、腹部大動脈、大動脈の他の部分に比べると VVs の少なくとも分布です。²

人間の腹部大動脈瘤の組織の低酸素 (AAA) 壁厚管腔内血栓 (ILT)³の以前の研究報告。また、動脈瘤の壁の外の VV は AAA 壁⁴組織低酸素症に関連付けられて大幅に高い率で動脈硬化性変化と閉塞が示されています。これらの調査結果に基づいて、AAA の小説齧歯動物モデルは外 VV 低灌流⁵を誘導することによって作成されました。このモデルでは、VV 低灌流は組織低酸素症と形態学的および病理学的特性人間の AAA⁶のそれらに類似していた上、AAA の開発を引き起こした。首相の例では、クラスルーム ・の存在過脂肪細胞⁶、および破裂^7、8を引き起こす可能性の蓄積をご利用され。これらの調査結果は、ほとんど以前の齧歯動物モデルで観察されています。したがって、このモデルが AAA 開発と破壊のメカニズムのより深い理解に大きく貢献します。紹介を通じて外 VV 低灌流、AAAs を誘導するために使用する標準プロトコルを記述し、手術手技を用いた大動脈壁に低酸素血症を誘発する方法を説明します。

プロトコル

動物のケアと実験動物のケアのための浜松大学学校の医学動物ケア委員会中心にガイドラインに従って行われた

。

1。 モデルを作成するため手術

注: 10 のビードの殺菌剤に手術器具を配置 s 術。術中滅菌手袋を使用します

。

1. 使用ラット 300-400 g. の重量を量るラットに食糧へのアクセスを許可および水の 自由
。
2. は、イソフルラン吸入 (2.0 3.0 mL/L) とラットを麻酔します。つま先のピンチによって適切な anesthetization を確認します
。
3. 電気カミソリ、腹部の毛を剃るし、アルコールとポビドン ヨード液と腹部をスクラブします
。
4. は、仰臥位操作テーブルの上にネズミを配置します。ラット獣医軟膏を使用 ' 麻酔中の乾燥を防ぐため s 目
。
5. は、はさみを使用して腹側正中腹部切開で開腹したを実行します。明確な手術野を確保するため腹部の内容を腹腔内傷リトラクターを使用して滅菌ガーゼでパックします
。 血管周囲組織から大動脈を切断する
6. が優しくをピックアップし、ピンセットで大動脈の壁を公開してから分岐する左腎静脈のレベルから後腹膜腔の上行大動脈の剥離する後腹膜を引き裂く、血管周囲組織 ( 図 1 a).
7. ブロック血液 5-0 絹弦と腹部大動脈から分岐血管を大動脈の内腔を狭くしない大動脈から時点で供給 Ligate
。 大動脈の血流をブロックする
8. 血管クリップすぐ下腎動脈と大動脈の分岐のすぐ上に配置します
   。 注: クリップのサイズは、血流を完全にブロックする大動脈の直径よりも大きくなければなりません。一時的な 5-0 絹弦の合字もクリップではなく血流をブロックするため十分だ
。
9. ポリウレタン製カテーテルを挿入する遠位大動脈腎動脈の枝に隣接するクリップからマイクロはさみ 5 mm を使用して前の大動脈壁をカット、大動脈の壁の表面にドット出血を作成すると似ています
。
10. ポリウレタン製カテーテルを挿入 (0.55 mm、内径外径 0.37 mm) 水で大動脈の血を洗い流すため切開浅く針留置 24 ゲージを使用します。ポリウレタン製カテーテルに水で満たされた 1 mL の注射器の管理し、水で大動脈の血の残りを洗い流します。洗浄した後に、大動脈からカテーテルを削除します
。
11. ポリウレタン製カテーテルを挿入する前に (1.20 mm、内径外径 0.94 mm) 長さ 10 mm ( 図 1 b) をポリウレタン製のカテーテルをカット、18 g の留置針を使用しています。
    1. 挿入カット ステップ 1.9 の切開から大動脈の内腔にポリウレタン製のカテーテルの作品。完全に大動脈の内腔に 10 mm のカテーテルを挿入し、切開の位置に合わせてカテーテルの中点の位置を変更 (すなわち カテーテルで切開をカバー).
12. 切開を縫合 8-0 モノフィラメント文字列 ( 図 1) を使用して修復します
。
13. 結紮 5-0 絹弦とポリウレタン製のカテーテル ( 図 1) の組み合わせを用いた腹部大動脈
    。 注: 留置カテーテルによる大動脈の内腔を維持できます。カテーテルの位置を始まるようにしっかりと大動脈を縛る。外科医 ' 形成二重止め結びの結び目の最初のスローをつなぐとき、それは余分なねじれを追加します、追加ターンがより多くの摩擦を提供し、緩みを減らすことができますので、s の結び目をお勧めします
。
14. 結紮後、大動脈分岐部の血管クリップを取り外し、順行血流を回復する腎動脈以下の血管クリップを取り外します。総大動脈の拍動を確認します
。
15. は、2 つの層、腹膜および 4-0 ポリプロピレン縫合糸で、他のレイヤーで腹部切開を閉じる。しっかりと突出した器官を防ぐために切開部を縫合します
。
16. は、腹部の切開に局所リドカインを適用します。意識が戻るまで、加熱パッドのラットを配置します。放置しないでください、ラットまでそれは胸骨の横臥を維持するために十分な意識を取り戻しました。それは完全に回復するまで他のラットの会社に操作を経たラットを返しません
。
17. は、操作後ラットを密接に監視します。ラットが苦痛や体の重量損失の兆候を示している場合、滅菌生理食塩水 (1.0 2.0 mL) のボーラスを皮下注入します
。
18. は術後、超音波エコーで拡大した大動脈の経時的発展を観察します。説明 ⁵ として腹部大動脈の外側のエッジにエッジの内側から最大径測定
。

2。収穫、修正、および弾性線維 (EVG) 染色

1. 28 日術後管理ペントバルビ タール ナトリウム ≥ 100 mg/kg 腹腔内にラットを安楽死させる
。
2. カット ラット ' s 腹部キャビティ腹。メスを使用して初期の切開を行います。はさみを使用して動脈瘤を収穫し、24-48 h. のための中立的バッファー 10% ホルマリンで収穫された大動脈を配置
   注: 外科医は、大動脈やその他の臓器に損傷を防ぐため、動脈瘤を公開するときに注意しなければなりません。AAA の形成を示す、高架の腹部臓器を観察すべき。生体内の イメージと 前のヴィヴォ イメージ 図 2 を示していますAAAs のこの代表的なサンプルが破裂しない
。
3. EVG 染色 ⁹
   1. 1. 準備その行動 に調製した溶液 の ' 特定の順序で、次を混合することによって s ヘマトキシリン: アルコール ヘマトキシリン 20 mL、10% 塩化第二鉄 8.0 mLルゴール ' s ヨウ素 8 mL。各添加の間ソリューションをミックスします。このソリューションは必要に応じて新鮮な準備することができます
      。
      2. 準備バン維 ' 1% 酸フクシンを混合することによって s ソリューション 1 mL 及び飽和ピクリン酸 45 mL。一晩立つし、よく混ぜるようにします。このソリューションは、2 週間安定
      。
      3. 10% した FeCl ₃ 40 mL に 10 mL を混合することによって差別化ソリューション (2% 塩化第二鉄) の準備蒸留水します。このソリューションは必要に応じて新鮮な準備があります
      。
      4. 準備 5% ハイポ チオ硫酸ナトリウム 5.0 g 100 ml の蒸留水に溶解します。この解決策は、1 年間安定した
      。
   2. 染色手順
      注: 詳細に ⁹ を参照を参照してください。
      1. 10 分が、その行動、大動脈の蒸留水で収穫された大動脈固定パラフィン切片を簡単に、メタンハイド レート ' s ヘマトキシリン 25 分洗浄水と 10-30 倍 (2% した FeCl ₃) ソリューションの差別化でひと泳ぎ。水ですすいでください。5% ハイポ 1 分水で洗浄のために配置します。ヴァン維の場所 ' s 向け 5 分
      2. Dehydrate 以下のアルコールで順序: 30 の 75%、90%、95%、100%、100% のアルコールそれぞれ秒。その後、2 回、5 分間のキシレンのオフにします。樹脂製取付中 coverslip の場所
         。 注: 弾性線維は黒に青黒表示します。核: bla にブルーck。コラーゲン: 赤;およびその他の組織の要素: 黄色
      。

結果

記載された手術方法は、ラットのポリウレタン製カテーテル挿入と高齢者の腹部大動脈の縫合結紮の組み合わせを使用して、慢性的な低酸素状態における動脈瘤の新たな動物モデルを作成します。プロトコルのセクションで説明したラットは、プロシージャの後の 28 日の安楽死だった。大動脈は、収穫され、動脈瘤形成を可視化するイメージングします。図 2は、紡錘状の AAA の開発を示しています。前のヴィヴォの大動脈の上下の端は、拡張なし通常直径を持っています。大動脈の直径は、経腹超音波検査 (図 3) を使用して測定しました。直径一般にプロシージャの後約 14 日で最大サイズに達したその後、そのまま残るか、またはわずかに増加します。図 4は、EVG 染色後、最大直径で動脈瘤の病理組織学的イメージを示します。28 日目の組織像 (動脈瘤) 0 日目と比較して弾性線維の顕著な低下を示した。

図 1: 腹部大動脈瘤 (AAA) を誘導する手術。
(A) 上大動脈周囲の組織から剥離されます。(10 mm 長いカット B) ポリウレタン製カテーテルが大動脈の小さな切開を通して挿入されます。(C) 切開が 8-0 モノフィラメント縫合糸で修復され、血流が復活しました。(D) 大動脈は、挿入されたカテーテルの上 5-0 シルク縫合糸で結紮は。スケール バー = 5 mm.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 2: 代表的な予後。
紡錘状の腹部大動脈瘤の術後 28 日目表示開発に関する肉眼。後腹膜の高マージンは、(破線; 左) 動脈瘤の外側のエッジに対応します。前のヴィヴォの大動脈の上部と下部の端 (右) 正常です。スケール バー = 3 mm.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 3: 最大大動脈径経腹超音波断層法を用いて測定します。
大動脈径は、このラットのモデルで着実に増加しました。大動脈の直径は平均 ± 標準偏差として表示されます (n = 12)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 4: エラスティカ ・ ヴァン ・維染色と動脈瘤の組織の代表的なイメージ。
EVG 染色を示す変性弾性板腔内血栓の形成とメディアのプロシージャの後の 28 日 (右) の組織学的評価。大動脈の弾性繊維の断片化と大動脈外膜スパース コラーゲン線維は、28 日に観察されます。0 日目 (左) 施術前に、です。スケール バー = 500 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

ディスカッション

生理学的な条件の下で外側と中間層によって養われています VV、外膜から内側 VV¹に浸透するのに対し、大動脈壁の内層が腔血流からの拡散によって栄養します。腹部の大動脈の壁に VV 血流が次の 3 つの方向/領域に属します: (1) 近位大動脈、大動脈壁と (3) 血管周囲組織¹⁰(2) 遠位方向方向。以前は、有意な狭窄や閉塞腹部大動脈の壁に VV 血流が低下⁴をすることができますを示唆している AAA の壁に VV の人間のティッシュの組織学的分析が識別されます。AAA、高齢者がポリウレタン製カテーテル挿入と高齢者の腹部大動脈の縫合結紮の組み合わせによって引き起こされたこのプロトコルでは非常に重要なポイントです。慎重に組織の層を剥離するには、外科医はスムーズにポリウレタン製カテーテルを大動脈に挿入する必要があり、外 VV と動脈瘤形成の血流の低下による慢性的な低酸素症を引き起こす大動脈をしっかりと縛る。これらのテクニックを使用して、大動脈壁内の血流が減少しその結果、ローカル低酸素環境が誘発されます。血流低下と低酸素状態における動脈瘤形成は、腹部の大動脈の壁に VV 血流が AAA 形成の病因の役割を果たしていることを示します。

具体的には、大動脈瘤モデルは次の条件を満たす必要があります: ベースライン、チュニカ メディアの変性、大動脈壁の炎症と比較して血管径の 1.5 倍の増加。最も人気のある動物モデルは、CaCl₂¹¹、エラスターゼ¹²、アンジオテンシン II¹³などの物質を使用して炎症反応を誘導することによって構築されています。これらのモデルは再現性の高い、明らかに病理学的変化を引き起こすことができ、調査研究でよく使用されます。私たちのモデルの手順を手順 (図 3) 後 28 日目まで行った前に超音波検査から 7 日ごと大動脈径を検討しました。その結果、大動脈の径がやや増加する 28 日間この直径の変更が以前の齧歯動物モデルと同様であることを示します。血管のフォームの肉眼観察では、滑らかな紡錘形 (図 2) が示されます。28 日に我々 はラットを犠牲にし、回収された大動脈組織の病理組織学的分析を行った。涙と判ったと外膜の弾性およびコラーゲン線維の消失 (図 4) を認めた.さらに、マクロファージなどの炎症細胞外膜からチュニカ メディアに存在していた。

現在、AAAs の利用可能な治療法の選択肢は、手術と血管内ステント術、AAA 破裂¹⁴患者の 30-50% の死亡率とに限定されます。しかし、AAAs の治療に医療用医薬品が認められています。人間と AAA の研究で使用される確立された動物モデルの病理学的所見に矛盾があること議論があります。人間の AAA と AAA モデル動物の病態の類似性は、薬理学的治療法の開発に不可欠です。齧歯動物モデルの有効性に関する我々 のラットのモデルは腔内血栓⁵と脂肪細胞形成⁸面で人間に類似した形態。さらに、本研究ではラットの約 20% は AAA 破裂をいたし、術後後 28 日以内に死亡しました。腹部大動脈瘤破裂はこの病気の最も重要なイベントが、破裂は、確立された実験の AAA モデルと共通、メカニズムは解明されていません。したがって、このモデルは大動脈径の拡張や動脈瘤の破裂のメカニズムを理解するために役立ちます。

このモデルの作成は、いくつかの手術に必要です。したがって、研究者は、このモデルの制限は、このモデルの作成を練習しなければなりません。将来的に、我々 できる血流が低下徐々 に VV 壁を厚くことにより自発的な大動脈瘤の齧歯動物モデルを作成したいと思います。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ラット	ジャパンSLC。Inc	SLC:SDラット	Sprague–Dawley ratTM
ポビドンヨード溶液	Libatape Pharmaceutical Co., Ltd.
5-0 絹紐	秋山メディカル(株	JIS No.1
vascular clips	(株)夏目製作所	C-42-S-2
ポリウレタンカテーテル(24ゲージ留置針)	メディキット	24G	スーパーカテーテル Z4VTM、24ゲージ留置針
ポリウレタンカテーテル(18ゲージ留置針)	メディキット	18G	スーパーカテーテル Z3VTM、18ゲージ留置針
8-0モノフィラメント紐	エチコン縫合糸	c-42-S-2	プロレンポリプロピレン縫合糸、縫合糸で切開部を修復