成熟シュワン細胞の発生源としての骨髄由来前駆細胞の低酸素プレコンディショニング

サマリー

骨髄内には、神経ポテンシャルを有する骨髄間質細胞（MSC）が存在する。我々のプロトコルは、低酸素プレコンディショニングを介してこの細胞集団を濃縮し、その後それらを成熟シュワン細胞にするよう指示する。

要約

この原稿は、骨髄間質細胞（MSC）集団から神経前駆細胞を濃縮し、その後それらを成熟シュワン細胞運命に導く手段を記載している。我々はラットおよびヒトのMSCに一時的な低酸素状態（16時間酸素1％）を与え、続いて表皮成長因子（EGF）/塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）補充を伴う低付着層上のニューロスフェアとしての拡大を行った。ニューロスフェアをポリ-D-リシン/ラミニン被覆組織培養プラスチック上に播種し、β-ヘレグリン、bFGFおよび血小板由来増殖因子（PDGF）を含有する膠原性カクテルで培養してシュワン細胞様細胞（SCLC）を生成させた。 SCLCは、E14-15妊娠Sprague Dawleyラットから得られた精製背側根神経節（DRG）ニューロンを用いて、共培養によるコミットメントを2週間行った。成熟シュワン細胞は、S100β/ p75発現の持続性を示し、ミエリンセグメントを形成することができる。このようにして生成された細胞は、脊髄損傷後の自己細胞移植における応用、ならびに疾患モデリングに有用である。

概要

神経前駆細胞およびそれらの誘導体の移植は、外傷性神経損傷^1,2および神経変性3,4の後の治療戦略として有望であることを示している。臨床応用の前に、i）幹/前駆細胞の自己由来源にアクセスして拡大する方法、およびii）それらを関連する成熟細胞型に導く手段を確実にすることが不可欠である³ 。脊髄損傷に対する細胞療法への関心は、成体組織からの神経前駆細胞の堅牢な自己由来の細胞供給源を模索するようになった。

MSCの亜集団は、神経堤に由来し、骨髄腔から容易にアクセス可能である。これらの細胞は、ニューロンおよびグリアを生成し得る神経前駆細胞である。脳虚血の動物モデルは、低酸素症がprolを促進することを実証する脳内の神経前駆細胞の発情と多分化能⁶ 。これは、骨髄由来神経前駆細胞を拡張する手段として低酸素プレコンディショニングを利用するための基礎となった。

損傷した脊髄へのシュワン細胞の移植は、再生を促進する² 。 SCLCは、グリオジェニック因子（ すなわち、 β-ヘレグリン、bFGFおよびPDGF-AA）を補充することによってMSCから生成され得るが、表現型の不安定性を示す。成長因子の回収時に、線維芽細胞様表現型^7に戻る 。表現型の不安定性は、異常な分化および発癌のリスクのために、細胞移植において望ましくない。シュワン細胞前駆体は、胚末梢神経⁸内の軸索束と関連しているので、我々は、精製胚DRGニューロン⁷を共培養SCLCに導き^、ass = "xref"> 9。成熟シュワン細胞は運命決定されており、in vitro ^7,9およびin vivo ^{10で機能を示す} 。

MSCからの神経前駆細胞の濃縮に関する我々のプロトコールは、単純かつ効率的であり、その後のアッセイのための細胞数の増加をもたらす。共培養プラットフォームを介した運命決定シュワン細胞の誘導は、グリア分化の研究、および潜在的な臨床適用のための安定かつ機能的なシュワン細胞の生成を可能にする。

プロトコル

動物を含むすべての処置は、実験動物のケアおよび使用のためのNIHガイドに厳密に準拠して実施され、香港大学の医学のLi Ka Shing教授のための生きた動物の使用に関する委員会によって承認された。インフォームドコンセントを得た後、健康なドナーの腸骨稜からヒト骨髄サンプルを得た。議定書は、香港大学の制度審査委員会の承認を受けています。

1.ラットMSC培養液の調製

1. 大腿骨からのMSCの収穫
   1. 使用前に少なくとも2時間、180°Cですべての切開ツール（ すなわち、はさみ、鋭い切開はさみ、および歯を切った鉗子）をオートクレーブする。
   2. 15％ウシ胎仔血清（FBS）およびペニシリン/ストレプトマイシン（P / S、1％v / v）を補充した最小限の必須培地α修飾（αMEM）を含むMSC増殖培地を調製する。）。
   3. ペントバルビタールの過剰投与（240mg / kg体重、腹腔内）により、若い雄Sprague Dawleyラット（体重200〜250g）を犠牲にする。
      注：異なるラットの骨髄サンプルは別々に処理する必要があります。
   4. 犠牲動物を仰臥位に置く。腹部と下肢を70％エタノールで完全にきれいにする。
   5. 細かい切開はさみと鉗子を使用して、内側の太ももの上の皮膚と皮下組織を削除します。大腿筋が露出するまで、大腿筋を円周方向に外します。膝と股関節が見えるまで、この近位および遠位に継続する。大腿骨を股関節と膝関節に通し、鋭利な先端を切って切り取ってください。
      注：この段階で大腿骨を切開して骨髄腔を露出させないでください。インタクトな大腿骨を層流組織培養フードに移し、さらなる処理を行う。
   6. 骨幹端部を通って大腿骨の遠位端および近位端を横断するために、尖った切断されたはさみを使用する。
   7. 70μmセルストレーナーを50mLコニカルチューブの上に置きます。露出した大腿管にリン酸緩衝生理食塩水（PBS、10mM Na ₂ HPO ₄ 、pH7.4）を含む21G、10mLシリンジを挿入し、洗浄を繰り返すことによって円錐管に骨髄内容物を洗い流す。
      注：各大腿骨を洗い流すために約20mLのPBSを使用する。洗い流された内容物の色が血液で汚染されて濁っている場合、より大きな容積を使用することができる。
   8. 480 xgで5分間遠心分離して細胞を集める。上清を捨てる。細胞ペレットを10mLのMSC増殖培地に再懸濁する。 10cmの組織培養皿に細胞をプレートする。組織培養皿を細胞インキュベーター（37℃、5％CO ₂ ）に入れる。メッキの最初の日を0日目として記録する。
      注：遠心を含むすべてのステップで、ブレーキを最大減速に設定します。
2. MSCコロニーの設立と拡大
   注：このプロトコルr骨髄腔内からMSCを選択するための手段として、組織培養プラスチック粘着性を欠く。骨髄の内容物を組織培養プラスチックに2日間付着させる。
   1. 2日目に、10mLのPBSで培養プレートを3回すすぎ、非接着細胞を除去する。すすいだ後、PBSを10 mLのMSC増殖培地に交換する。細胞をPBSで洗浄し、3日ごとにMSC増殖培地を補充する。
      注：MSCコロニーは、6-7日目に見えるはずです（ 図2A ）。
   2. 増殖培地を除去し、細胞をPBSですすぐことにより、10日目までに細胞を通過させる。組換え酵素細胞解離試薬1.5mLを添加し、37℃で5分間インキュベートする。反応を中和するために3mLのMSC増殖培地を添加する。 250×gで5分間遠心分離して分離した細胞を集める。
   3. PBSで適切に希釈した後、血球計を用いてペレット内の細胞を定量する。
   4. 40,000細胞/ cm ^2の密度で継代した細胞をMSC増殖培地中の10cm培養プレートに継代した。
      注：ラットのMSCは継代の2日以内に80〜90％の合流に達するはずである（ 図2B ）。細胞は、最大8継代について、工程1.2.2に記載されているように継代することができる。 MSCは、免疫細胞化学および三分化分化能力を特徴とすることができる（ 図3 ） ¹² 。第3および第8継代の間のMSC培養物のみが、その後の低酸素プレコンディショニングおよび神経前駆細胞濃縮の対象となる。より大きい継代数のMSCは、平らな形態をとっており（ 図2C ）、十分な数の神経前駆細胞を産生しない。これらの培養物は捨てるべきです。

ヒトBMSC培養物の調製

1. 1mLのヒト骨髄を9mLのMSC増殖培地で希釈し、細胞を10cmの組織培養皿上に置いた。細胞培養器（37℃、5％CO ₂ ）で培養物を維持する。
2. 2日後に培地を除去し、10mLのPBSで培養液を3回穏やかにすすいで非接着細胞を除去する。最後のすすぎ後、PBSを除去し、10mLのMSC増殖培地と交換する。 PBSすすぎ後の培養3日ごとに増殖培地を補充する。
   注：MSCコロニーは、6-7日目まで可視でなければなりません。コロニーの数は被験者によって異なる場合があります。
3. ステップ1.2.2に記載されているように、10日目に細胞を通過させる。 PBSで適切に希釈した後、血球計を用いてペレット内の細胞を定量する。継代した細胞をMSC増殖培地中の10cm培養プレート上に40,000細胞/ cm ^2の密度で播種する。
   注：ヒトMSC（ 図2D ）は、ラットMSCと同様の形態を示し、同様に、継代の2日以内に80〜90％の合流に達するはずである。彼らは奇妙でなければならない免疫細胞化学および三重化分化のためのそれらの能力によって凍結される¹² 。ラットのMSCと同様に、第3および第8継代間のヒトMSCは、その後の低酸素プレコンディショニングおよび神経前駆細胞濃縮に供される。

3.低酸素プレコンディショニング

1. リングクランプを外した後、低酸素チャンバーの部品（ベース、フタ、トレイ）を分解し、70％エタノールで個々の部品をきれいに拭きます。チャンバ構成要素を、層流組織培養フード内に置き、UV光下で15分間滅菌する。
2. 低酸素プレコンディショニングの前に、培地を除去し、10mLのPBSでラットおよびヒトMSC培養物（セクション1および2）をリンスする。 PBSを、25mMのHEPESを補充した10mLのMSC増殖培地で置換する。
   注：10cm皿上で培養されたMSCは、低酸素プレコンディショニングの対象となる前に80〜90％のコンフルエントに達しているはずです。
3. カウルを置く低酸素室の中で皿を作る。チャンバーのコンポーネントを再構成し、リングクランプを締めます。 99％N ₂ /1％O _2のガス混合物を10L /分の流速で5分間チャンバ内に流す。
4. 低酸素室の接続端をシールして、ガス漏れがないことを確認します。チャンバーを細胞インキュベーター（37℃、5％CO ₂ ）の中に16時間置く。
5. 低酸素プレコンディショニングが完了したら、その後の神経前駆細胞濃縮培養に備えて培養液をチャンバーから取り出す。

4.神経前駆細胞濃縮培養

1. B27（2％v / v）、塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF、20 ng / mL）、上皮成長因子（EGF、BGF）を補充したダルベッコ変法イーグル培地/ハム栄養混合物F12（DMEM / F12） 20 ng / mL）、およびP / S（1％v / v）であった。
2. ステップ1.2.2に記載されているように、低酸素プレコンディショニングラット/ヒトMSCを分離する。250×gで5分間遠心分離して分離した細胞を集める。 PBSで適切に希釈した後、血球計を用いてペレット内の細胞を定量する。
3. 6,000細胞/ cm ^2の密度で、神経前駆細胞および細胞を低付着性の6ウェルプレートに再懸濁する。培養物を細胞インキュベーター（37℃、5％CO ₂ ）に12日間置く。 3日ごとに神経前駆細胞の75％を補充する。
   注：サイズの大きい非接着性細胞クラスターは、6-7日目まで観察されるべきである。 10〜12日目までに、直径が100μm以上のニューロスフェアを観察することができます（ 図4 ）。低酸素プレコンディショニングMSCは正常酸素条件下で培養されたMSCと比較してより多くのニューロスフェアを生じるはずである⁹ 。
4. 10日目のピペットに吸引し、15 mLコニカルチューブに移すことにより、12日目に神経球を収集する。神経球を250xgで5分間遠心分離する。
   注：ニューロスフェアは、ネスチンおよびGFAPなどの神経前駆マーカーについて12日目に特徴付けられた。

5. DRGニューロンと共培養による運命決定シュワン細胞の作製

1. 精製ラットDRGニューロンの調製
   1. 使用前に少なくとも2時間、180°Cですべての解剖器具（ すなわち、解剖はさみ、鉗子、2つの顕微解剖鉗子、およびマイクロダイシングハサミ）をオートクレーブする。
   2. ポリ-D-リシン（PDL、PBS中10μg/ mL）を含む6ウェル組織培養プレートを4℃で一晩コートする。 PDLを除去し、1ウェルあたり1.5mLのPBSですすぐ。
   3. プレートをラミニン（PBS中10μg/ mL）で37℃で2時間コーティングすることにより続行する。 1ウェルあたり1.5mLのPBSでプレートをすすぐ。
   4. B27（2％v / v）、L-グルタミン（1％v / v）、神経成長因子（NGF、20ng / mL）およびP / S（1％v / v）を補充した神経基底培地からなるDRGニューロン維持培地を調製する。 ％v / v）。
   5. B27（2％v / v）、L-グルタミン（1％）、NGF（20ng / mL）、P / S（1％）、フルオロデオキシウリジン（FDU、10）を補充した神経基底培地からなるDRGニューロン精製培地を調製する。 μg/ mL）、およびウリジン（10μg/ mL）である。
   6. 妊娠中のラットを第14-15妊娠期にペントバルビタール過剰投与（240mg / kg体重、腹腔内）で屠殺する。
   7. 犠牲動物を仰臥位に置く。 70％エタノールで腹部を完全にきれいにする。
   8. 細かい切開はさみと鉗子を使用して、動物の下腹壁を縦に切る。解剖はさみを使用して子宮を特定し、除去する。子宮の壁を切断して胚を露出させ、抽出する。 PBSで満たされた滅菌10cm培養皿に胚を移す。培養皿を氷上に置きます。
   9. 解剖用の胚をPBS（室温）で満たした滅菌10 cm培養皿に移し、解剖顕微鏡の下に置く。胚を伏せやすい位置に置いてください。
      NOTE：白っぽい脊髄および付着したDRGは、その半透明な皮膚を介して、胚の背側に見える。
   10. 脊髄のいずれかの側に沿ってmicrodissecting鉗子を挿入し、周囲の軟部組織から脊髄を分離し始めるために鈍的な解剖を使用してください。頚部の開口部と尻尾のスタブに沿ってマイクロ鉗子を使用して動物から脊髄を切断します。周囲の柔らかい組織からそれを解放するためにコードの腹側の面にさらに鈍的な解剖を行います。
   11. 解放された脊髄の背側の面に残っている柔らかい組織を除去するためにマイクロダイシング鉗子を使用してください。
       注：この段階では、脊髄、神経根、および付着したDRGのみが残るはずです。
   12. microdissecting鉗子を使用して、それらの接続神経根から個々のDRGを切り離します。 PBSを含む1.5mLの滅菌遠心分離管にDRGを移すために、1mL先端に取り付けられたピペットペンを使用する。
       注：各1.5 mLチューブについて、最大100のDRGを収容できます。
   13. 5分間250xgでDRGを遠心分離し、組換え酵素細胞解離試薬（200μL/チューブ）にそれらを再懸濁する。 10分間インキュベートする（37℃、5％CO ₂ ）。 250×gで5分間DRGを遠心分離し、上清を除去し、DRGニューロン維持培地に再懸濁する。 200μLピペットチップを用いて穏やかに粉砕することによりペレットを解離させる。適切な希釈後、血球計を用いてペレット内の細胞を定量する。
   14. 1ウェル当たり1.5mLのDRGニューロン維持培地中のPDL /ラミニンでコーティングした6ウェルプレートに5,000細胞/ cm ^2の密度で細胞を播種する。培養2日後、DRGニューロン維持培地を除去し、PBSですすぎ、DRGニューロン精製培地で置き換える。
       注：精製サイクルごとに、DRG培養物を精製培地で2日間処理し、続いてメンテナンス培地で1日間インキュベートする。 3-4回の精製サイクルの後、remすべての内因性グリアの楕円形が予想される⁷ 。これには約14日かかります。精製された培養物は、ニューロンマーカーTUJ1に対して陽性であり、S100β発現には存在しない（ 図5 ）。
2. シュワン細胞様細胞の生成
   1. β-ヘレグリン（100ng / mL）、bFGF（10ng / mL）、血小板由来成長因子（PDGF-AA、5ng / mL）、FBS（10％）、及びα-D-セレクチンを補充したαMEMからなるグリア誘導培地を調製する。 P / S（1％v / v）。
   2. 1ウェル当たり1.5mLのグリア誘導培地中、5〜10球/ cm ^2の密度で、PDL /ラミニンでコーティングした6ウェルプレート中のセクション4で調製したニューロスフェアをプレートする。 PBSで細胞をすすいだ後、グリア誘導培地を2日ごとに交換する。
      注：播種されたニューロスフェアからの細胞は、2日目までに外向きに移動することが見られる。7日目までに、移動性細胞はテーパ状の外観を有し、シュワン細胞に対する免疫陽性を示すはずであるマーカーp75ニューロトロフィン受容体（p75）およびS100β7。これらのセルはSCLCと呼ばれます。
3. SCLCとDRGニューロンとの共培養
   1. DRGニューロン維持培地（ステップ5.1.4）およびグリア誘導培地（ステップ5.2.1）からなる共培養培地を1：1の体積対体積比で調製する。
   2. FBS（5％）、β-ヘレグリン（10ng / mL）およびP / S（1％v / v）を添加したDMEM / F12からなるシュワン細胞維持培地を調製する。
   3. 7日目のSCLCから培地を除去し、PBSですすぎ、37℃で5分間、組換え酵素細胞解離試薬0.5 mL /ウェルと共にインキュベートする。共培養培地中にSCLCを再懸濁する。
   4. 適切な希釈後、血球計を用いて細胞を定量する。
   5. SCLCを精製されたDRGニューロン培養上に1,000細胞/ cm ^2の密度でシードする。共培養を14日間維持し、培地交換は2日ごとに行う。
      注：共培養の間、SCLCsは、成熟シュワン細胞の典型的な紡錘体様形態を獲得した（ 図6 ）。これらの細胞は、成長因子の回収後に表現型を維持し、 インビトロおよびインビボで軸索をミエリン化することができる7,10。シュワン細胞マーカー（ すなわち、 p75およびS100β）の陽性は、免疫蛍光によってモニターされるべきである。
   6. 共培養が完了すると、ステップ1.2.2に記載されている通り、運命決定されたシュワン細胞を通過させる。 1ウェルあたり0.5 mLの解離試薬を使用する。適切な希釈後、血球計を用いて細胞を定量する。
   7. 運命決定されたシュワン細胞をシュワン細胞維持培地に10,000細胞/ cm ^2の密度で再懸濁する。免疫蛍光のために細胞をPDL /ラミニンでコートした6ウェルプレートに植えます。
      注：共培養には必然的に線維芽細胞を採取したMSCが含まれている細胞運命⁷ 。これらの細胞は、同時培養の完了時に運命決定シュワン細胞と一緒に継代される。この線維芽細胞の上に横たわるシュワン細胞は、他の場所で記載されているように、PBSの「コールドジェット」（4℃）ですすぎ洗いした後、容易に剥がすことができる。運命決定されたシュワン細胞は、維持培地中で1ヶ月間増殖させることができる。

結果

我々のプロトコルの重要なステージの概要を図1に示します。要約すると、ラットおよびヒトMSCは、組織培養プラスチックの接着によって選択される。拡張されたMSCは、低酸素状態で前処理され、次いで、ニューロスフェア形成条件に供される。ニューロスフェアをプレートし、SCLCに分化させる。 SCLCは、精製されたDRGニューロンと共培養され、運命決定されたシュワン細胞を生成する。

培養したラットおよびヒトMSCの形態を図2に示す 。彼らの健康なテーパード形態は、多分化能を失った高継代数について維持されたMSCの四角形の外観と対照的に示される。拡大したラットおよびヒトのコロニーは、造血幹細胞マーカーの欠如であるMSCマーカーの発現および三倍化のための能力を示すべきであるferentiation（ 図3

ディスカッション

低酸素プレコンディショニングおよびニューロスフェア培養を介して神経前駆細胞を濃縮する前に、MSCの「幹細胞」を保存することが不可欠です。我々の経験から、多分化能MSCは、それらの細長い線維芽様の形態によって確実に同定され得る。対照的に、顕著な細胞骨格ストレスファイバーを有するより平らな四角形形態を採用したMSCは、容易に神経細胞運命を採用せず、廃棄すべきである。一般的に、我々は、8を超える通過数を有するMSCを利用しない。それらの幹細胞性を維持するために、MSCが100％コンフルエンスに達する前に速やかにMSCを通過させることが重要である。逆に、MSCを低すぎるコンフルエントに維持することは望ましくない。私たちの経験から、40,000細胞/ cm ^2の密度でMSCを播種するか、または1：2の比率で80％コンフルエントな細胞を単純に継代培養することにより、最良の結果が得られる。

DRGネットワ​​ークの適切な確立と維持は評論家です共培養の成功の決定因子である。 DRG収穫に必要な時間は最小限に抑える必要があります。個々の神経節は、神経根のみを扱うのが最善である...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
&アルファ;MEM	Sigmaaldrich	M4526
DMEM/F12	サーモフィッシャー scientific	12400-024
神経基礎培地	サーモフィッシャー scientific	21103-049
FBS	Biosera	FB-1280/500
B27	サーモフィッシャー	scientific 17504-001
上皮成長因子 (EGF)	サーモフィッシャー scientific
塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)	ペプロテック	100-18B/100UG
神経成長因子(NGF)	ミリポア	NC011
血小板由来成長因子-AA (PDGF-AA)	ペプロテック	100-13A
ヘレグリンβ-3, EGFドメイン (β-Her)	ミリポア	01-201
ウリジン	グマアルドリッヒ	U3003
5-フルロ-2' - デオキシウリジン (FDU)	シグマアルドリッヒ	F0503
ポリ-D-リジン (PDL)	Sigmaaldrich	P7886-1G
ラミニン	サーモフィッシャー科学	23017015
GlutaMAX	サーモフィッシャー科学	35050061
ペニシリン/ストレプトマイシン (P/S)	サーモフィッシャー サイエンティフィック	15140-122
TrypLE Express	サーモフィッシャー サイエンティフィック	12604-013
接着培養	用 10 cm プレートTPP	93100	組織培養接着によるMSCの選択に使用
培養用6ウェルプレート	TPP	92006	継代後のMSCの拡張に使用
UltraLow 非接着培養用6ウェルプレート	コーニング	3471	神経前駆細胞濃縮抗
ヒトCD90(Thy-1)	BDバイオサイエンス555593
抗ヒトCD73	に使用BDバイオサイエンス550256
抗ヒト/ラットSTRO-1	R&Dシステム	ズMAB1038
反ヒトネスチン	R&D Systems	MAB1259
anti-human CD45	BD Biosciences	555480
抗ラット CD90(Thy-1)	BD Biosciences	554895
抗ラット CD73	BD Biosciences	551123
抗ラットネスティン	BD Biosciences	MAB1259
抗ラット CD45	BD Biosciences	554875
アンチS100β	ダコ	Z031101
反 p75	ミリポア	MAB5386
反 GFAP	シグマアルドリッチ	G3893
反クラス III-β チューブリン (Tuj-1)	コーヴァンス	MMS-435P
反ヒト核	ミリポア	MAB1281
低酸素チャンバー	ビラップス-ローテンベルク	MIC-101
HEPES	バッファーSigmaaldrich	H4034-100G