炎症反応に関与する新規血管内皮レギュレータを特徴付けるための試金をスクリーニング

サマリー

血管内皮細胞は、しっかりと白血球動員を制御します。不十分な白血球の血管外漏出は、炎症性疾患に貢献します。したがって、内皮活性化の新しい規制要素の検索は、炎症性疾患の改善治療を設計する必要です。ここでは、白血球は炎症時に人身売買を変更できる新しい内皮調節を特徴付けるための包括的な方法論について述べる。

要約

内皮層は、多くの異なる機能を制御することによって体内の恒常性を維持するために不可欠です。内皮層による炎症反応の調節は、効率的に有害な入力との戦いや、被災地の回復の援助に不可欠です。Ccl5、Cxcl1、Cxcl10 など水溶性の炎症性サイトカインを表現してトリガー内皮細胞がリポ多糖 (LPS)、グラム陰性の細菌膜の外側のコンポーネントなど、炎症性の環境にさらされる、循環白血球の活性化。さらに、内皮細胞表面に接着分子 E セレクチン、VCAM 1 と icam-1 の発現は相互作用および内皮層と最終的に炎症を起こしている組織へ漏出する活性化白血球接着できます。このシナリオで、過剰なまたは欠陥のある活性化白血球動員は炎症関連疾患につながる可能性がため血管内皮機能はしっかりと調整されなければなりません。これらの疾患の多くは効果的な治療法はありません、ので血管の層を中心に新しい戦略を調べる必要があります。白血球機能を変更新規の内皮レギュレータの検索に有用な包括的な試金を提案します。含むいくつかのテクニック (など、サイトカイン、ケモカイン、および接着分子) 白血球動員に関与する特定の表現ターゲットを用いた内皮活性化分析: リアルタイムの量的なポリメラーゼの連鎖反応 (RT-qPCR)、西部のしみ方、フローサイトメトリーおよび接着アッセイの流れ。これらのアプローチは、炎症における血管内皮機能を決定して新しい治療戦略の設計の潜在的価値のある小説の内皮炎症性の規制当局を特徴付けるためのスクリーニングアッセイを実行する非常に便利です。

概要

炎症が感染性病原体、病原体を排除し、損傷した組織を修復する主要な目的に対して有益な生物学的反応です。炎症は慢性感染症や自己免疫疾患など、特定の条件下では解決しません。代わりに、連続浸潤白血球、組織の損傷、線維化、損失関数、および全体的な障害者と患者のいくつかの例の死につながる長期免疫応答の結果の異常な反応があります。これらの人間の疾患、炎症性疾患としてカタログ化すべては白血球の血管外漏出^1,2の制御のための血管を含みます。

血管内皮細胞は、白血球が人身売買を制御することによって炎症反応の調節に基本的な役割を果たします。安静時の内皮をアクティブにし、炎症性サイトカイン(Cxcl10、Cxcl5、Cxcl1 等)と接着分子 (E セレクチン、VCAM 1 と icam-1) 表現内皮層が LPS など炎症性メディエーターにさらされて、その好意感染部位に白血球の循環の募集。リリースされたサイトカインによってプライミング白血球ローリングと特派員の接着対応による内皮層との相互作用を仲介する: セレクチン VCAM 1 α4β1 インテグリン、icam-1 へ αLβ2 インテグリン PSGL 1。最後に、白血球は炎症³の焦点に向かって血管間で移行します。

プロトコル

1 です血管内皮細胞培養

37 ° C で 30 分間

1. 1. 2.5 mL ゼラチンでコート 100 mm 組織培養プレートを 培養処理板 のソリューション (蒸留水のオートクレーブ、ゼラチン 0.1%); これ。必要な井戸のフォーマットに推測することができます。ゼラチン溶液を吸引し、ティッシュ文化フードで風乾するプレートのままにします
   。
2. 組織培養条件
   1. (37 ° C、湿度 95%、5% CO ₂) 生物インキュベータ内 MLEC 04 細胞を養います。ダルベッコの完全なメディアのセルを育てる ' s 修正イーグル培地: 栄養混合物 F-12 (DMEM/F-12) 10% 胎仔ウシ血清 (FBS) と 100 単位/ml ペニシリン ストレプトマイシン 100 μ g/mL (P/S) と補完
   。
   2. 標準ノイバウアー チャンバー法によるセルをカウントし、MLEC 04 セルを 10 mL の完全なメディア、2-11 × 10 ⁴ セル/cm ² の低密度で 100 mm のゼラチン処理版に追加します。合流点に達すると 1:3 のセルを分割します
      。 注: 通常これは文化で 2 〜 3 日後に発生します
   。
   3. サブカルチャー 10 ml 滅菌リン酸緩衝生....

結果

RT qPCR による内皮細胞の LPS 誘導性活性化の評価

飢えた血清 MLEC 04 細胞が 100 ng/mL LPS の 6 時間によって刺激され、内皮細胞の遺伝子発現は、休憩状態に活性化マーカーの発現を比較することによって RT qPCR を使用して査定されました。図 1 aのように、LP 培養 MLEC 04 細胞は炎症性応答 (E セレクチン、VCAM 1 と icam-1) 中に白血球動員に関与する選択した接着分子の発現を誘導しました。この実験的な治療下式は変更されていないので、PECAM 1 は内部統制として使用されました。図 1 bは、Ccl5、Cxcl10、および Cxcl1 サイトカインの mRNA 発現の増加によって測定される組合による内皮活性化を表します。これらの分子は、白血球、内皮層と炎症のサイトに後で漏出に、.......

ディスカッション

この内皮細胞のプロトコルでは、炎症反応の調節に関与する探索機構のための基礎を確立する段階的な技術について説明します。これらのアプローチ LPS 刺激血管内皮の活動の研究に基づいており、具体的には炎症性応答の間に白血球動員に関与する重要なステップの評価: 内皮細胞のサイトカインのリリースでは、内皮細胞の接着血管層に分子式と白血球接着。内皮のパラメーターを確立すると、システムの内皮機能の調節に関与する新規な化合物が検索でき、その結果、炎症の進行。それらの規制薬物は医薬品市場に関心の可能性のあるできます。このシーケンシャル プロトコルの主要な投影は、相対血管活動パラメーターを調整することにより内皮細胞の種類と刺激条件にこれらの研究を拡張するための基盤を確立することです。

このスクリーニングによって選択された薬は炎症性疾患に対する新規治療戦略の設計の興味深い候補を構成します。一方、内皮細胞の応答を支持し白血球動員に貢献化合物は免疫不全の条件^16,17のために有望になります。.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ゼラチン	シグマ	G9391
DMEM-F12	ロンザ	BE12-719F
ウシ胎児血清	シグマ	A4503
ペニシリン ストレプトマイシン	ロンザ	DE17-602E
トリプシン	ロンザ	BE17-160E
EDTA	シグマ	ED2SS
LPS	シグマ	L2880
Trizol	Sigma	T9424	RNA抽出バッファー
イソプロパノール	シグマ	33539
エタノールアブsoluto	Panreac	1,310,861,612
Pure H2O	Qiagen	1017979	RNAseフリー
アガロー	プロナディサ	8020
アガロースゲル用染色	Invitrogen	s33102
SuperScript III First-Strand Synth	Invitrogen	18080051	試薬 RT-PCR
Fast SYBR Green Master Mix	Applied Biosystems	4385610	蛍光染色
MicroAmp Fast Optical 96ウェル	Applied Biosystems	4346906 10	qPCR
U-bottom 96ウェルプレート	Falcon	353072
サイトメトリーチューブ	ファルコン	352054
TX100	パンレアック	212314	非イオン性界面活性剤
トリスHCl	パンレアック	1,319,401,211
塩化ナトリウム	メルク	1,064,041,000
ピロリン酸ナトリウム	グマ	221368
フッ化ナトリウム	シグマ	S7920
オルトバナジン酸ナトリウム	Sigma	13721-39-6
プロテアーゼ阻害剤カクテル	Sigma	P8340
Pierce BCA Protein Assay Kit	Pierce	23225	ビシンコニン酸アッセイ用試薬
&β;-メルカプトエタノール	メルク	805,740
PVDF トランスファー メンブレン、0.45 µm	Thermo Scientific	88518
Tween-20	Panreac	1,623,121,611	ポリソルベート 20
PBS	Lonza	BE17-515Q
ECL	ミリポア	WBKLS0500
フィブロネクチン		Sigma F1141
ラミニン	Sigma	L2020
コラーゲン I 型	Σ	c8919
酢酸	Panreac	1,310,081,611
トリパンブルー	Sigma	T8154
パラホルムアルデヒド		Σ P6148
メタノール	Panreac	1,310,911,612
クリスタルバイオレット		Sigma HT90132
クエン酸ナトリウム	Σ	C7254
エタノール 96%	Panreac	1,410,851,212
CFSE	Sigma	21888
RPMI	Lonza	BE12-115F
SDS	Bio-Rad	161-0418
Infinite M200	Tecan	M200	マルチモードマイクロプレートリーダー
Gel Doc 2000	Bio-Rad	2000	ゲルドキュメンテーションシステム
StepOnePlus	Applied Biosystems	StepOnePlus	qPCR system
MACSQuant Analyzer 10	Miltenyi Biotec	Analyzer 10	サイトメトリー装置
ChemiDoc MP	Bio-Rad	MP	化学発光検出システム
名前	会社名	カタログ番号	コメント
Antibodies
PECAM-1	BD Biosciences	553370	10 & microで使用;g/mL
ICAM-2	Biolegend	1054602	10 μ で使用。g/mL
E-セレクチン	BDバイオサイエンス	553749	10 μmで使用。g/mL
VCAM-1	BD Biosciences	553330	10 & micro で使用。g/mL
ICAM-1	Becton Dickinson	553250	10 & micro で使用;g/mL
抗ラット IgG-FITC Jackson	Immuno Research	112-095-006	10 & micro;g / mL
抗アルメニアハムスター-FITC	Jackson Immuno Research	127-095-160	10 & microで使用;g/mL
ラット IgG アイソチオペコントロール	Invitrogen	10700	10 & micro;g/mL
アルメニアハムスター IgG アイソタイプコントロール	Invitrogen	PA5-33220	10 & micro;g / mL
P-I&κ;&ベータ;-&アルファ;	Cell Signaling	2859	10 & micro で使用。g/mL
β-Actin	Sigma	A5441	10 µg/mL
P-ERK	細胞シグナル伝達	9101	10 μ;g/mL
抗マウス HRP	GE ヘルスケア	LNXA931/AE	1:10,000 で使用
抗ウサギ	HRP GE ヘルスケア	LNA934V/AG	1:10,000 で使用
抗ラット HRP	サンタクルーズ	Sc-3823	1:10,000 で使用

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