初期エンドソーム機能 F アクチンの重合によって決まります。ここで、この複雑な一連の反応の生化学的・遺伝的影響を受けやすいレンダリング核生成と、試験管の初期エンドソーム膜に F-アクチンの重合を再構成培養顕微鏡ベースのアッセイを説明します。操作。
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この記事について
サマリー
要約
多機能初期エンドソーム、特に貨物蛋白質を並べ替えると膜変形、エンドソームの膜の上に核形成した短い F アクチンのパッチに依存します。この複雑な一連の反応の遺伝学的および生化学的影響を受けやすいレンダリング核生成と、試験管の初期エンドソーム膜に F-アクチンの重合を再構成培養顕微鏡ベースのアッセイを設けています。操作。エンドソーム分数は初期エンドソーム タンパク質 RAB5 GFP を発現する細胞からのサッカロースの勾配の浮上によって準備されます。細胞質画分は、細胞の別のバッチから用意しています。エンドソームと細胞質画分格納できます液体窒素で凍結に必要な場合。アッセイのエンドソームと細胞質画分を混合、および混合物は、適切な条件 (例えば、イオン強度、環境を削減) の 37 ° C で培養しました。希望の時間に反応混合物を固定すると、および F-アクチン ファロイジンで明らかにされます。アクチン核形成と重合は、蛍光顕微鏡で分析しています。ここで、アクチン核形成膜、またはそれ以降の伸び、分岐、または F アクチン繊維の架橋のどちらかに関与している因子の役割を調査するこのアッセイを使用ことができることを報告します。
概要
高等真核生物の細胞のタンパク質や脂質は並べ替えが発生する初期エンドソームを内面化します。いくつかのタンパク質や脂質は、住宅がする運命にあるは初期エンドソームの管状地域に組み込むし、トランスゴルジ ネットワーク (TGN)1、2細胞膜に輸送。対照的に、他のタンパク質や脂質は、多胞性の外観を示す初期エンドソームの領域に選択的にパッケージ化されます。これらの領域を展開し、初期エンドソーム膜から剥離時に無料エンドソーム キャリア小胞または多胞体 (ECV/MVBs) に最終的に成熟したから責任がある後期エンドソーム1,に向かって貨物輸送2。
アクチンは、エンドソーム並べ替え容量とエンドソームの形成と関連付けられる膜改造プロセスで重要な役割を果たしています。タンパク質のリサイクルの経路に沿って、TGN の細胞膜には、レトロマー複合体と関連付けられているタンパク質に依存します。この仕分けの機械リサイクル尿細管を介しての相互作用レトロマー複合体、ハチと傷跡相同 (洗浄) 複雑で分岐したアクチン3,4,<....
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プロトコル
1 ですソリューションおよび準備
注: すべてのバッファーおよび解決は、ダブル蒸留 (dd) H 2 o. で準備する必要が。糖度計を使用してすべてのスクロース溶液の最終濃度を決定する必要がありますショ糖の水和状態によって異なりますので、.
- 準備リン酸緩衝生理食塩水 (PBS-) の二価陽イオンなし: 137 mM よる、2.7 mM KCl、1.5 mM KH 2 PO 4、および 6.5 mM ナ 2 HPO 4。7.4 に pH を調整します。オートクレーブ滅菌 (121 ° C で 15 分間 1 サイクル) で殺菌し、常温で保存します 。
- 300 mM のイミダゾールの貯蔵液の準備: ddH 2 O.Adjust 塩酸フィルター滅菌 0.22 μ m を使用してを使用して 4 ° C、7.4 に pH サイズ フィルターの細孔し、4 デパートの 10 mL のイミダゾールの 0.204 g ° C
- 準備均質化バッファー (HB; 約 100 mL を準備): 3 mM のイミダゾールの 250 mM ショ糖。PH 計を用いた 4 ° C、7.4 に pH を調整します。0.22 μ m 孔サイズ フィルターを使用してフィルター滅菌し、4 で保存 ° C. 補完 HB 使用直前....
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結果
F-アクチンのパッチを初期エンドソーム膜形成についての洞察を得るためには、図 2に示すプロトコルを追った簡単に言えば、細胞が GFP RAB5 を導入させたし、し、初期エンドソームは細胞レベル下の分別により作製しました。これらの精製された初期エンドソーム自体だけでなく、他の反応に関与の可能性の要因は、アクチンを提供するために細胞質で培養。潜伏期間の終わりに、反応は混合物の固定によって停止されました。サンプルが収集し、顕微鏡スライド上に堆積します。最後に、F アクチンは、ファロイジン (図 3 a) で明らかになった。その後重合プロセスと同様に、初期エンドソーム膜に F-アクチン核形成が急速に発生しました。確かに、F アクチンは、反応 (図 3 a) の初めの後 1 分以内エンドソームに既に視覚化でした。 最初短いが、これらのアクチン構造は急速に長く、分岐、アクチン フィラメント (
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ディスカッション
アクチンは、エンドソーム膜ダイナミクス4,14の重要な役割を果たしています。我々 はアクチン核形成と重合では、初期エンドソーム小 F アクチン パッチやネットワーク形成を報告しました。これら F アクチン ネットワークがを超えて分解経路に沿って早期エンドソーム膜輸送のため絶対に必要です。この核と重合プロセスのすべてのステップに干渉エンドソーム成熟およびこうして後期エンドソーム andlysosomes9,11,15に向かって下流トランスポートを防ぎます。特に、初期エンドソームに F-アクチン重合の一連のステップを分析し、分子レベルでプロセスを特徴付ける上記アッセイを使用しました。
これらの実験初期エンドソームが生体内でGFP RAB5 の付いた、細胞分画法により精.......
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開示事項
著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。
謝辞
スイス国立科学財団からの支援を得てください。スイスの Sinergia プログラム;ポーランド語-スイスのリサーチ ・ プログラム (PSPB-094/2010)化学生物学の国立がんスイス SystemsX.ch イニシアティブから LipidX (j. g.) にスイスの全米科学財団によって評価されます。O. m. は、エンボ長期フェローシップ (ALTF-516-2012) によって支えられました。
....アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| NaCl | Sigma-Aldrich | 71380 | |
| KCl | Acros Organics | 196770010 | |
| KH2PO4 | AppliChem | A1042 | |
| Na2HPO4 | Acros Organics | 424370025 | |
| Hepes | AppliChem | A3724 | |
| マグネシウンアセテート四水和物 | フルカ | 63047 | |
| チオスレイトール(DTT) | AppliChem | A2948 | |
| ミダゾール | シグマアルドリッチ | 10125NaOH | |
| フルカ | 71690 | ||
| 糖 | メルクミリポア | 107687 | |
| ロイペプチン | ロシュ | 11017101001 | |
| ペプスタチン | ロシュ | 10253286001 | |
| アプロチニン | ロシュ | 10236624001 | |
| パラホルマルデハイド | ポリサイエンス。Inc | 380 | |
| Alexa Fluor 555 phalloidin | Molecular Probes | A34055 | |
| Actin rhodamine | Cytoskeleton.Inc | APHR-A | |
| Mowiol 4-88 | Sigma-Aldrich | 81381 | poly(ビニルアルコール), Mw ~31 000 |
| DABCO | Sigma-Aldrich | D-2522 | |
| Tris-HCl | AppliChem | A1086 | |
| β-casein | Sigma-Aldrich | C6905 | |
| Filter 0.22 μm | Millex | SL6V033RS | |
| 丸型 10 cm 細胞培養用皿 | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 150350 | |
| プラスチックパスツールピペット | Assistent | 569/3 40569003 | |
| 15 mL ポリプロピレンチューブ | TPP | 91015 | |
| 皮下注射針 22G ブラック 30mm | BD Microlance | 300900 | |
| 滅菌ルアースリップ 1mL シリンジなしニードル | BD Plastipak | 300013 | |
| マイクロガラススライド | Assistent | 2406 | |
| 18 x 18-mm ガラスカバースリップ | Assistent | 1000/1818 | |
| SW60 遠心分離管 | ベックマン・コールター | 344062 | |
| TLS-55 遠心分離管 | ベックマン・コールター | 343778 | |
| 200-μL イエローチップ | Starlab | S1111-0706 | |
| 1,000-μL ブルー 目盛り付きチップ | Starlab | S1111-6801 | |
| 1.5 mL 試験管 | Axygen | MCT-175-C 311-04-051 | |
| 直径 18 mm 丸型カバースリップ | Assistent | 1001/18 | |
| 35 mm 丸皿、ガラス底 20 mm (0.16 - 0.19 mm)In | vitro Scientific | D35-20-1.5-N | |
| 屈折計 | カールツァイス | 79729 | |
| プラズマクリーナー | ハリック プラズマ | PDC-32G | |
| ソルバル WX80 超遠心機 | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 46900 | |
| 卓上超遠心機 | ベックマン・コールター | TL-100 | |
| SW60 ローター | ベックマン・コールター | 335649 | |
| TLS-55 ローター | ベックマン・コールター | 346936 | |
| 共焦点顕微鏡 | カールZeiss | LSM-780 | |
| Fugene HDトランスフェクション試薬 | Promega | E2311 | |
| タンパク質アッセイ試薬A | Bio-Rad | 500-0113 | |
| タンパク質アッセイ試薬B | Bio-Rad | 500-0114 | |
| タンパク質アッセイ試薬S | Bio-Rad | 500-0115 | |
| セルスクレーパー | 自家製 | 約 2 cm のシリコーンゴム片を非常に鋭角に切断し、金属棒に取り付けるか、鉗子で保持 | |
| 屈折計 | カールツァイス | ||
| ミニマム エッセンシャル ミディアム イーグル (MEM) | シグマ アルドリッチ | M0643 | |
| FCS | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 10270-106 | |
| MEM 非必須アミノ酸 (NEAA) | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 11140-035 | |
| L-グルタミン | サーモフィッシャーサイエンティフィ | 25030-024 | |
| ペニシリン-ストレプトマイシン | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 15140-122 | |
| pHメーター 691 | メトローム | ||
| ImageJ ソフトウェア | NIH、ベセスダ MD |
参考文献
- Huotari, J., Helenius, A. Endosome maturation. EMBO J. 30 (17), 3481-3500 (2011).
- Scott, C. C., Vacca, F., Gruenberg, J. Endosome Maturation, Transport and Functions. Semin. Cell Dev Biol. 31, 2-10 (2014).
- Puthenveedu, M. A., et al.
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