海馬シータバンドのチューニングインビトロ：隔離されたげっ歯類胸腺腫回路からの記録方法

海馬のシータ振動（4から12 Hz）は哺乳動物の脳におけるリズム活性の最も優勢な形態の中で、そのようなエピソードメモリ^1、2、3の時空間情報及び形成の処理として、認知機能に重要な役割を果たしていると考えられています。空間ナビゲーションと病変の研究、ならびに臨床的証拠を有するシータ変調場所細胞の関係を強調いくつかのin vivo研究は、海馬のシータ振動が記憶形成^4、5、6、関連するメカニズムに関与しているという見解を支持しながら海馬の生成は、まだ完全に理解されていない。初期のインビボでの研究では、シータ活性は主として外因性オシレータ、特にリズム入力に依存していることが示唆された求心性脳構造から、このような隔壁及び嗅内皮質^{7、8、9、10}として。一緒に海馬ニューロンの特性を有する海馬ニューラルネットワークの内部接続- -内因性因子の役割はまた、in vitroの観察^{11、12、13、14、15、16、17、18}に基づいて仮定されました。しかし、離れていくつかの画期的な研究^{19、20、21、} 体外スライス標本でシンプルに生理的に現実的な人口の活動を複製することができなアプローチを開発する上での困難から長い間、海馬の固有の能力および関連領域のより詳細な実験的検討が、シータ振動を自己生成するのを遅らせてしまった。

インビトロ薄切片実験の標準的な設定の重要な欠点は、脳構造の3D細胞およびシナプス組織が通常損なわれていることである。これは、局所的なグループ（半径1mm以下）から1つ以上の脳領域（> 1mm）にわたって広がるニューロンの集団に及ぶ、空間的に分布した細胞アセンブリに基づく協調的ネットワーク活動の多くの形態がサポートされないことを意味する。これらの考察を考慮して、シータ振動が海馬でどのように現れ、関連する皮質および皮質下の出力構造に伝播するかを研究するために、異なるタイプのアプローチが必要であった。

近年、双方向性を調べるための「完全なsepto-hippocampal」準備の初期の開発2つの構造^22の構造、およびその後の「単離された海馬」調製の進化は、固有のシータ振動が外的な律動的な入力^23を欠く海馬において自発的に起こることを明らかにした。これらのアプローチの値は、これらの領域の全体の機能構成は、インビトロ ²² におけるシータリズム発生器として機能するために保存しなければならなかった最初の洞察です。

すべての手順は、McGill University Animal Care CommitteeとCanadian Animal Care Councilによって承認されたプロトコールとガイドラインに従って行われています。

1.急性海馬のインビトロ調製

注：インタクトな海馬調製物を単離するには、（1）溶液および装置の準備、（2）海馬の解剖および（3）固有のシータ振動の生成に必要な速い灌流速度システムの設定、の3つの主要ステップが必要である。このプロトコールでは、分離された海馬は、 in vitroでの構造の機能的連結性を維持することが非常に注意を要するような、高密度で繊細な調製物を構成するため、解剖から記録までのタイムリーな実行が特に重要である。すべてを事前に準備することにより、細胞dを最小限に抑えるために、できるだけ早く適切なレベルの灌流が利用可能であることが保証される麻酔し、生理的機能を維持する。

1. スクロースベースの人工脳脊髄液（aCSF）溶液
   1. 解剖と解剖後のインキュベーションに使用する1Xストックスクロース溶液を調製する。 CaCl ₂を除く表1に記載されているすべての成分を脱イオン水1Lに混合し、4℃で最大2週間保存する。
2. 標準的なaCSFソリューション
   1. 電気生理学的記録中に単離された海馬の高速流速灌流のための標準aCSFを調製する。濃縮（5X）ストックをaCSFにするには、脱イオン水2LにCaCl ₂以外の表2に記載されているすべての成分を溶解し、4℃で保存する。
3. 装置を準備する
   1. 切開を開始する前に、氷で満たされたプラスチックトレイ（30×20×5cm）、カルボゲン接続の配管ラインおよびthreeガラスペトリ皿（10×2cm）（ 図1参照）。
   2. カルボゲン（95％O _{2、5％CO 2）}およびCa ²⁺を追加[1.2 mm]として、500mLのビーカーにバブルをスクロース溶液300ml（1×ストック）を加えます。
   3. このスクロース溶液60mLをガラスペトリ皿に移し、室温で放置する。残りを4℃の冷凍庫に10〜15分間置きます。
   4. 解剖の至るところで氷冷したショ糖溶液をカルボゲンで泡立てる。
   5. 2番目のペトリ皿（冷たい保持室）をスクロース溶液（4℃）で満たし、氷上に置いてください。
   6. 30mLの氷冷スクロース溶液を50mLビーカーに加える。

2.全海馬解剖

注：単離された海馬を解剖する方法は、もともと²²に記載されたものと本質的に同一であるが、漏出速度および記録技術。

1. 脳解剖
   1. ケージに添加されたイソフルラン（100％）1mLを浸した小さなペーパータオルでヒュームフード下でマウス（P20-35）を麻酔する。
   2. 麻酔したマウスを断頭し、氷冷したショ糖溶液（50mLのビーカー、約5秒）中で頭部をすばやく水没させる。紙タオルに移します。
   3. メスを使用して内側皮膚切開（吻側への尾側）を行い、頭蓋骨を露出させるために側方の皮膚を押します。
   4. 小さなはさみで頭蓋骨を切り、スパチュラを使って脳を迅速に抽出し、氷冷したショ糖溶液を入れたペトリ皿に滴下します。脳が冷えるまで1〜2分間放置する。
   5. 脳が回復している間、氷上でペトリ（解剖）皿に覆われたレンズ紙に2〜3mLのスクロース溶液を加える。
2. 海馬の隔離
   1. 脳を解剖皿の上に置く。n。
   2. カミソリの刃で小脳と前頭皮質を除去する。 midsagittal平面に沿って半分に脳を切断し、2つの隔離された半球を保持チャンバに戻す。回復にさらに1〜2分を要します。
   3. 単一の半切断された脳を解剖皿上に直立に置く。
   4. midsagittal構造体が観察者に向くようにディッシュを回転させ、中隔複合体の埋め込まれた輪郭が、視床前方の薄い洋梨型の組織層として見えるようにする。
   5. 半切開脳をマイクロスパーテルでしっかりと保持し、ポリテトラフルオロエチレン（PTFE）被覆スパチュラの小さい端を中隔領域のすぐ後（尾側）に配置する。
   6. セプタムの下にコーティングされたスパチュラを挿入し、解剖皿に達するまで先端を下に動かします。中隔領域を尾側につなぐ繊維を切断します。中隔の前縁に沿って同じ操作を繰り返し、脳の前頭部分につながる繊維を切断する。
   7. スパチュラで海馬の直上の皮質の内側を軽く直立させた状態で、視床下部、視床下部、および残りの脳幹核を注意深く引き下げるために、マイクロスペーサーを使用します。引き剥がされた組織を切り、除去するには、スパチュラを使用します。
   8. 孤立した半球をその側に回し、海馬の輪郭を確認する。
   9. 背側海馬の吻側端部の下の側脳室に被覆されたスパチュラを挿入する。
   10. ヘミスパッド脳の中緯度面と水平に整列したスパチュラを保持し、チップが尾側に現れるまで心室壁の滑らかな輪郭を通ってスライドさせる。
   11. 海馬の下にスパチュラを置き、海馬が上層の皮質と結合する内側の層に沿って、接続繊維上に軽く押し付けます。この層の外側にマイクロスパーテルを塗布し、コーティングされたスパチュラにスライドさせて、ベール。
   12. 抽出を完了するために、解剖皿を回転させ、被覆されたスパチュラを腹側海馬の下に挿入する。皮質の襞の内側をスパチュラで軽く保持し、マイクロスパーテルに対するスライス運動を用いて膣内結節を切断する。
       注：全海馬海馬複合体は、被覆されたスパチュラを海馬全体の下に置き、残りの脳組織を下から引き出すことによって除去することができる。
   13. 単離が完了したら、海馬を皿の上に置き、冷たい状態に保つために氷冷したショ糖溶液の滴を加える。慎重に残りの皮質と繊維を切り取って、穏やかに剃刀のブレードをフォルニクスに通すことによって、海馬をセプタムから分離する。
       注：ピラミッド細胞からパッチクランプ記録を行う場合（セクション4.6 Optogenetic control参照）、CA1のピラミッド層を露出させるために、隔離された海馬を45°の角度で横切ることができる（「angle-カット "準備）、海馬の残りの部分のローカルネットワーク回路を妥協することなく。
   14. 調製物を室温スクロース溶液に移し、15〜30分間回復させてから、記録チャンバーに移す。

3.分離した海馬を記録するための高速灌流の設定

1. 重力給餌式灌流システムをセットアップし、20〜25mL /分で酸素化aCSFを連続的に高速流入させることができます。
   1. あらかじめaCSF（1×）フラスコを準備し、実験の開始の少なくとも15分前に加温浴（約30℃）に浸してください。インライン溶液ヒーターシステム（30℃）をオンにします。
   2. CaCl ₂ [2 mM]を添加して灌流を開始する前に、アクアリウムバブラーとチューブをカーボジェンタンクに接続してaCSFを酸素化してください。
   3. aCSFフローを停止し、ワイドを使用して海馬を記録チャンバーに移すガラスピペットの端。スクロース飽和調製物を沈降させ、底部に沈殿させる。
   4. CA1とSUBの滑らかな表面を上にして、記録チャンバーの中心（入口 - 出口軸線に沿って）に準備物を置く。中隔および側頭の小さな体重で海馬を安定させ、aCSFの流れを再開する。

4.孤立した海馬における電気生理学

1. in vitro海馬シータ振動の細胞外記録
   1. in vitroで単離された海馬からの局所場電位（LFP）または単体活動の細胞外モニタリングのために、aCSFで満たされたガラスマイクロピペット（1〜3MΩ）を使用する。ゲインx1000のパッチクランプアンプ、オンラインバンドパスフィルタリング0.1〜500 Hz、サンプリングレート5〜20 kHzで低ノイズAC結合フィールド電位信号を記録します。
      注：このプロトコルで使用されるカスタムメイドの顕微鏡は、低倍率（2.5倍）および高倍率（40倍）の海馬の低倍率視野、ならびに赤外線ビデオ顕微鏡法および単一細胞認識のエピ蛍光を備えています。このシステムのコンポーネントには、直立蛍光顕微鏡、蛍光フィルターキューブ、アナログビデオカメラ、イメージングソフトウェア付きデジタルフレームグラバー、ステージ上のカスタム灌流チャンバー（ 図2A 、インセットi）、ニューロン記録用の高精度マイクロマニピュレーター光ファイバーの配置。
   2. 顕微鏡に取り付けられたカメラを使用し、コンピュータディスプレイに接続して、低倍率（2.5倍）で海馬の準備を検査し、アンダーカットがないか、外面が損傷していないかを素早くチェックします。 CA1の平滑な表面に沿った斜長繊維の配列は、海馬を通って透過光を照らすときに可視でなければならない（ 図2A 、インセットii）膿。
   3. 孤立した海馬と特定の記録場所にLFP電極を配置するには、低倍率の広視野対物レンズを使用します。
      注：異なる記録位置に配置された複数の電極を有する分離された海馬調製物のレイアウトが図2Aに示されている。
   4. LFP電極がCA1領域の表面（胞状突起）に接触するまで、LFP電極を槽内に下ろします。
      注記：これは通常、電極が記録媒体に接触したときに起こる現象と同様に、AC結合記録において高速過渡現象を生じる。オーディオモニタは、この手順の後にLFPチャネル信号を聞くのに便利です。
      注：しばしば、活動の初期の徴候は10〜15分後にのみ現れるので、準備に素早く進まないことが重要です。この期間の後に表面LFP電極が依然として活性を拾っていない場合は、層オリエンテーションを少し下に進める主細胞層に近づいている間に何らかの活動が発生したかどうかを定期的に確認してください。さらに5〜10分後に何も検出されない場合は、電極を注意深く引っ込め、同じ領域に沿って置きます。
   5. ピラミッド層を通してLFP電極を前進させます。個々のニューロン（主にピラミッドおよび阻害性のバスケット細胞）からの単一単位放出が検出されると、細胞外スパイク活動が最初に増加することを観察する。電極をさらに下げ、先端がラジエタムに交差するとスパイキングが再び消え始めることに注意してください。記録位置がラジオメータを通って低下するにつれて、シータ周波数範囲（4〜12Hz）で明瞭に目に見えるネットワーク発振が明らかになり、最大振幅（〜100〜300μV）に達することを観察します。
2. 単一の領域にわたるシータ振動
   1. CA1領域を横切る自発的なシータ振動の空間的特性を試験するために、中央のCA1部位（長手方向のセプタム - 時間軸に沿って中央に位置する）のLFP電極を参照し、それを前記のようにラジエタム内に下げる。
   2. 2番目のLFP電極をCA1サイト（200〜800μm中隔又は第1のLFPからの時間）に置き、CA1シータ振動が比較的大きな距離にわたって同期できることを観察する。
3. 層間のシータ振動
   1. 海馬層を横切るシータ振動の特性を試験するために、参照LFP電極をCA1ラジオサイトに残す。層のオリエンテーションのすぐ上から始まり、第2の電極をピラミッド型細胞層の中に、そして放射を通って下げる。ピラミッド層を横切るLFP信号の段階的反転（相対位相反転）を観察する。
      注：これらのタイプの活動の代表例については、 図2Bを参照してください。層流/深さプロファイルおよび電流源密度（CSD）分析の例分離された海馬における位相反転のサイトを説明する前に^23、24、25に公開されています。
4. インタクトな海馬におけるガンマ振動とシータ - ガンマカップリング
   1. CA1 / SUB境界にフィールド電極を置き、ピラミッド層と分子層との間の界面に位置するまで下げる。このレベルでは、局所的なリズムに位相ロックする振幅の変化を伴う明確なガンマ振動を表示する場の電位を記録することができる²⁴ 。テラγ結合の遅い時間スケールを観察するようにスケーリングを調整する。 （ - 50ヘルツ25）と高速ガンマガンマバーストが低速で進行中のLFP信号をフィルタリングするバンドパスによって明らかにすることができる2つの別個の周波数帯域に発生することに注意してください（150から250ヘルツ）の範囲（代表については、図2Cは 、濾過を見ますトレース）。
5. インビトロ海馬シータ振動中の全細胞パッチクランプ記録
   注：プロトコールのこの部分では、PVプロモーターの制御下で蛍光タンパク質tdTomatoを発現するトランスジェニックPV-TOMマウスからの単離された海馬における同定された介在ニューロンから視覚的に誘導された全細胞パッチクランプ記録を得ることが目標である詳細は材料および参考文献^26を参照）。
   1. PV-TOMマウス（ 図3 ）からの海馬調製物の表面近くに位置するtdTomato陽性介在ニューロンを視覚化するために、低（2.5倍）および高倍率（40倍）の倍率で蛍光ビデオ顕微鏡を使用する。 PV-TOMニューロンは、アルブス（最大100μm）を介してパッチをうまく可視化し、標的化することができるが、アーマチュアを用いて海馬を調製すると、非蛍光性ピラミッド細胞に比較的容易に到達することができることに留意されたいセクション2.2.14注）。
   2. 海馬の低倍率ビューの下で、CA1 / SUBにLFP電極を置き、パッチクランプ実験の準備中にシータ振動を監視する。
   3. 40倍の倍率に切り替え、目的領域を標的領域に浸します。上部のレイヤーが見えるようになるまで下げます。顕微鏡の位置を操作して、反対側からのパッチピペット接近のための十分な開放アクセスを確保する。
   4. 蛍光顕微鏡下で、蛍光PV-TOM細胞を選択し、標準的な細胞内溶液で満たされたパッチピペット（2-3MΩ）で接近させる。
   5. マウスピースを使用して軽い正の圧力をピペットに加え、電極が細胞上に降ろされるときに抵抗を監視する。先端が標的細胞に遭遇すると、陽圧が膜を押すにつれてピペット抵抗が増加し、明確なディンプルが現れる。圧力を解放し、シールが形成され始めると、現在のパルスが平らになることを確認します。すぐにcl（-70mV）まで上昇させ、一旦GΩシールが達成されると、ピペットホルダーを通して加えられる少量の負圧で細胞膜を破裂させる。
   6. 全細胞構成になったら、自発的な海馬振動の間に同定されたPV細胞の生理学的特性を調べる（ 図3B ）。
   7. PV細胞からの細胞内膜電位記録は、進行中のCA1 /SUBθリズムに同期した速いスパイク挙動およびバーストの活動電位によって特徴付けられることを観察する。
   8. 電圧クランプに切り替え、異なる膜電位で細胞を保持して、内因性の律動的な活動によって生成される興奮性対阻害性のシナプス電流の比を特徴付ける。比較のためにピラミッド型セルからのパッチクランプ記録の例を図3Aに示す。
6. 単離された海馬における光発生制御 注：これらの細胞は、単離された海馬²⁵に主細胞集団を同期化において主要な役割を果たしていることが示されたように海馬ネットワーク活動の光遺伝学的制御のために、PV含有GABA作動性細胞のリズム活性化に関与する細胞型特異的な戦略は、ここで使用されます。 PV細胞における興奮性チャネルロドプシン-2（ChR2）の選択的発現は、PV-Creマウス系をChR2 Cre依存的に発現するマウス（Ai32）と交叉させ、PV-ChYマウスを作製することによって達成される。あるいは、ウイルスベクター構築物（ 例えば 、AAVdj-ケタ-のeYFP）はCA1 / SUBの介在ニューロンに興奮性オプシンの発現を駆動するためにPV-のCreまたはPV-TOMマウス（P15-16）の海馬に注入することができる（ 図4A ）。
   注：この戦略は以前に^25で説明されています。
   1. LFP電極をCA1 / SUB領域に置き、近くのピラミッド型セルを絶縁されたhippocにパッチしますPV介在ニューロンにおける青色光感受性興奮性オプシンChR2を発現するマウスのアンフォース。
   2. 海馬の準備の上に光ファイバーの光ガイド（直径0.2~1ミリメートル）を置き、記録された領域の中心に置く。光パルス（トランジスタ - トランジスターロジック信号によってトリガーされる10〜20ms）またはシータ波電圧コマンド（4〜12Hz）で提供される光発生刺激のためのLED光源からの青色光（473nm）を使用する。
      注：カスタムLEDベースの光刺激アセンブリは他の場所で説明されています²⁵ 。
   3. 電流クランプに切り替え、自発的なシータ振動中にピラミッドの活動を特徴付ける。
   4. 刺激プロトコールを開始し、光反応を記録する。記録されたニューロンにおける場の振動およびシナプス活性が、光発生刺激中にますます同期化され、PV細胞の周期的なペーシングが両方の周波数のロバストな制御をもたらすことを観察する（ 図4 ）。

このセクションは、インビトロでマウス単離された海馬調製物におけるシータ振動を研究することによって得られ得る結果の例を説明する。単離された海馬を抽出するための解剖手順を図1に示す 。この準備を使用して、複数のフィールド電極の配置中に固有のシータ振動を検査し、全体的な活動を記録し、分離された海馬の異なる領域および層（ 図2 ）の神経細胞集団に同期させたシナプス入力を記録することができる。自発的海馬シータ振動（ 図3 ）の間、およびリズム活動のオプトジェネティックな操作の間に、特定の細胞タイプの発火およびシナプス特性を特徴付けるために、全細胞パッチクランプと細胞外記録の同時の代表的結果が提示されるg ">図4）。

図1：単離された完全な海馬の調製のための解剖手順。
（ a ）解剖のセットアップの概要。右上：炭化ゲル化氷冷スクロース溶液フラスコ（1）;左下：氷で満たされたプラスチックトレイ（2）レンズペーパー（3）で覆われた解剖皿を保持する。冷たい保持チャンバは、ショ糖溶液（4）を含む。 （5）のセットを含む。 （ b ）切開皿上の半切断前のマウスの脳の図。 （ c ）冷たい保持チャンバー内の半脳梗塞脳の回復および左脳半球の拡大図（インセット）前に、コーティングされたスパチュラの小端を中隔の下に挿入する。 （ d ）CA1 / SUB領域に沿って、隔離された海馬の下に置かれたコーティングされたスパチュラ、残りの脳組織は下から引き出される。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

図2：浸水した記録チャンバーの完全な海馬調製物からのインビトロシータ振動を記録するための設定の構成。
（ a ）分離した海馬は海馬領域のレイアウトで示され、複数の電極は腹側に分布する4つの異なる記録部位に配置される（白いアスタリスクで示される）。上記の記録チャンバプラットフォーム（挿入図1）の観点から、速い灌流のための入口および出口は番号（1,2）で示されている。以下に示す海馬の拡大像（インセットii）では、単一の電極が中央絨毛膜のCA1および繊維は容易に目に見え、膣に向かって斜めに走っている。 S：中隔、T：時間的、f / fx：fimbria-fornix。 （ b ）層状オリエンテーション（灰色）と層状輻射（黒色）から同時に記録された代表的なLFPトレースを有するCA1層の組織化の概略図。 2つの層の間の信号の逆位相に注意してください。 Alv：stratum alveus、PR：stratum pyramidale、SR：stratum radiatum。 SLM：Stratum Lacunosum Moleculare。 （ c ）フィルタされていない信号からCA1 / SUB領域（20秒セグメント）および2秒の拡張セグメント（以下）から記録された自発的なシータ振動を示すLFPトレースの例。シータ周波数（0.5〜12Hz）に対してバンドパスフィルタリングされる。遅いガンマ（25~55Hz）;および高速ガンマ（125〜250Hz）。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

図4：単離CA1 / SUBピラミッドおよびPVニューロンからの局在電位および同時パッチクランプ記録、単離された海馬における自発的および光発生的に駆動されるシータ振動中の記録。
（ a b ）典型的なレギュラースパイキング（RS）特性（上部）および記録された細胞の高倍率（40X）画像（下部）を示す錐体ニューロンの特徴付け。 （ c ）LFP信号（灰色）とともに脱分極膜電位（黒色）で同じ細胞を電流クランプ記録し、自発発振（左）およびシータ周波数（6Hz）光刺激中の同期リズムIPSPを示す右）。光刺激のパターン（青色の陰影）が電圧トレースの上に示されています。 （ d ）6Hzの光シミュレーション（ベースライン、刺激、ポスト）の前、中および後のLFP波形のスペクトログラムおよびパワースペクトル。 （ e ）低倍率明視野および蛍光画像CA1 / SUB領域に局在するeYFP蛍光（緑色）を示す海馬調製物。 （ f ）記録されたPV-TOM介在ニューロン（以下の40倍蛍光画像）の高速スパイク（FS）挙動を示す現在のステップ特性決定。 （ g ）3 Hzでの自発的な場の振動中（左）および光刺激中（右）のLFP信号に同期して、大きなEPSPおよび記録されたPV細胞のリズム発火を示す膜電位記録。 （ h ）CA1 / SUB LFP信号上のPVセルスパイクのフィールドトリガ平均（FTA）。複数の試験（LFPピークを中心とする）にわたるPVセルの放電は、自発的振動（ベースライン）および光刺激（刺激）中に記録されたスパイクのFTAに変換された。中および下のグラフは、スパイクとスパイク確率ヒストグラムのラスタプロットを示しています（平均確率は赤で示されています）。一番上のグラフは、LFPの間にパワーが増加した平均LFPシグナルのプロットを示すPV細胞の高度に同期した発射と並行して、LFP振動のピークに位相ロックされた刺激を提供する。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

表1。

表2。

著者は競合する商業的または財政的利益を宣言していない。