嗅覚神経軸索分子識別コードの視覚化のための嗅球の四重免疫染色

開発中、ニューロンは、正常な脳機能にとって重要な、適切な神経回路を形成するために相互に正確に接続される。脳の異常な神経回路は自閉症や統合失調症などの精神障害の原因であると考えられているため、神経回路形成のメカニズムを理解することは神経科学の分野における大きな課題の1つです。

マウス嗅覚系では、嗅覚上皮（OE）の各嗅覚ニューロン（OSN）は機能的な嗅覚受容器（OR）遺伝子を1つしか発現せず、同じORを発現するOSNは軸索を特定の糸球体対に収束させる。嗅球（OB） ^1,2 。マウスの嗅覚系は、神経回路形成の分子メカニズムを研究するための優れたモデル系であり、研究者はOR発現を利用して特定のsOSNsのサブタイプを同定し、OSN軸索の投影部位を明確な糸球体構造として視覚化する。 OSN投影の顕著な特徴は、OSN軸索をOB 3、4、5、6に投影する際にORが有益な役割を果たすことである。より具体的には、OSN軸索が標的領域に近づくように誘導された後、それらは偏向されてOR依存的に糸球体を形成する。以前の研究では、OR分子が糸球体分離を調節する軸索選別分子の発現を制御することが示されている^7,8 。さらに、蓄積している証拠は、OR分子が軸索選別分子のユニークな組み合わせによってニューロンの識別コードを生成することを示唆している⁹ 。したがって、OR依存性糸球体分離のメカニズムを理解するためには、軸索選別モルの発現プロファイルを特徴付けることが必要であるOSNのecules。

蛍光免疫染色は、特定の遺伝子の発現を視覚化するための一般的な方法である。軸索選別分子のタンパク質は主にOSN軸索に局在するため、研究者はOSNの発現パターンを特徴づけるためにOB切片を使用する必要がある。 OBの冠状切片は免疫染色のために日常的に使用されている。しかし、この準備は、同じOBセクション内の前後軸に沿った地形情報を失う。したがって、我々はOBの内側の傍脊柱側枝の準備を開発しました。これは同じOBセクションにできるだけ多くの周囲の糸球体をマウントすることができます。複数の抗体を用いた免疫染色と組み合わせることにより、OB切片間の染色変異を伴わずに、軸索選別分子の発現パターンの比較および分析が可能になる。

さらに、免疫組織化学的染色方法が、PFAαスクロース処理。この方法により、研究者は多変量解析に十分な高品質の染色データを得ることができます。ここに提示されたプロトコルは、嗅覚神経回路形成を研究する研究者のための強力な方法の詳細を提供する。

すべての実験手順は、東京大学の動物実験倫理委員会の承認を得て、実験動物のケアと使用に関する東京大学のガイドラインに従って行われた。

1.ソリューションの準備

1. 0.01Mリン酸緩衝生理食塩水（PBS）の調製：PBS錠剤（0.14M NaCl、0.0027M KCl、0.010M PO ₄ ^3- 、pH7.4）を蒸留水1Lに加え、完全に溶解するまで室温で撹拌する。
2. PBS中4％パラホルムアルデヒド（PFA）を調製する：4mLのPFAを100mLのPBSに加える。溶液が完全に溶解するまで60℃で撹拌する。
   1. PBS中にPFAを溶解した後、1N水酸化ナトリウム（NaOH）を用いて溶液のpHを7.4に調整する。次に、氷上で冷却し、濾紙を通して溶液をろ過して粒子状物質を除去する。 4℃で保存する。
      注意：これらの試薬を使用する場合は、適切な注意を払ってください。ハンドル手袋、安全ゴーグル、および化学フードの下のラボコートを注意して使用してください。
      注：2 d以内に調製した新鮮な4％PFA溶液を使用する。
3. 0.3％Triton X-100（PBST）を添加した0.01M PBSを調製する：3mLのTriton X-100を997mLのPBSに加える。溶液が完全に溶解するまで室温で撹拌する。
4. 1％および5％ブロッキング溶液を調製する：スキムミルク10gをPBST200mLに加えて5％ブロッキング溶液を調製する。十分に溶解するまでRTで撹拌する。 5％ブロッキング溶液をPBSTで5倍に希釈して1％ブロッキング溶液を調製する。

2.パラサギュアルOBセクションの準備

1. 1〜2週齢の動物を使用する。これらの年齢群は、糸球体がはっきりと見え、頭蓋骨で脳を切断できるので、以下の実験に適している。
2. ペントバルビタール（50mg / kg体重）の腹腔内注射で動物を麻酔する。氷冷した4％Pで経心的に動物を灌流するPBS中のFA。慎重に取り扱い、手袋、安全ゴーグル、および化学フードの下の実験室コートを使用する。
3. 灌流後、はさみで頭を切って慎重に皮膚を除去する。次に、はさみの刃を上歯と下歯の間の空間に挿入し、水平に切断して下顎骨を除去する。 OBやOEを含む嗅覚組織を残すために、過剰な組織を鉗子やハサミで切り取ってください。
   注：OBを囲む頭蓋骨を取り除かないでください。これは、垂直に真っ直ぐに整列した内側の糸球体を保持するためです。
4. 嗅覚組織をPBSに浸して鼻腔の空気を除去する。脳の後部を垂直に切断し、カッティングフェイスを下にして包埋モールドの底に嗅覚組織を置きます。金型をOptimal Cutting Temperature（OCT）コンパウンドで満たし、液体窒素に金型を浸します。
   1. 化合物中の組織が完全に凍結した後、それをクライオス-20℃で1時間反応させる。
5. OBのシリアルparasagittalセクション（10μmの）をクライオスタットで作り、MASでコーティングされたスライドガラスにくっつけてそれらを集める。貼り付けた後、ブロードライヤーでスライドを直ちに乾燥させます。

3. 1日目：OBスライスの4回免疫免疫染色

1. RTでPBSで5分間スライドを洗浄する。 3回繰り返します。
2. スライドを室温で5％ブロッキング溶液と1時間インキュベートすることにより、非特異的結合部位をブロックする。
3. 室温で1％ブロッキング溶液中の一次抗体カクテル（各スライド400μL）とスライドO / Nをインキュベートする。モルモット抗Kirrel2抗体（1：1000）、ヤギ抗セマフォリン7A（Sema7A）抗体（1：500）、ラット抗OL-プロトカドヘリン（OLPC）抗体（1：500）、およびマウス抗小胞グルタミン酸トランスポーター2（VGLUT2）抗体（1：500）。

4. 2日目：OBの4回免疫染色スライス

1. 一次抗体溶液を捨て、RTでPBSTで5分間スライドを洗浄する。 3回繰り返します。
2. RTでPBS中の二次抗体（各スライド400μL）のカクテルで1時間スライドをインキュベートする。ロバ抗マウスAlexa Fluor 405（1：400）、ロバ抗ヤギAlexa Fluor 488（1：400）、ロバ抗モルモットAlexa Fluor 555（1：400）ラットAlexa Fluor 647（1：400）。
   注：すべての二次抗体は、同じ宿主種に由来するはずです。各一次抗体の二次抗体の異なる蛍光波長を選択して、波長が重ならないようにします。
3. 溶液を捨て、RTでPBSで5分間スライドを洗浄する。 3回繰り返します。
4. スライド上のカバースリップをマウント媒体でマウントする。このためには、各スライドに2滴のマウントメディアを塗布し、次に気泡を除去してカバースリップを入れます。

5.強度Me保証

1. 蛍光顕微鏡を用いて蛍光画像を得る。 Alexa Fluor 405シグナル、GFPフィルターキューブ（470/40 nm励起、525/50 nm発光、400 nm励起、460/50 nm発光、400 nmダイクロイックミラー）のDAPIフィルターキューブ（360/40 nm励起、460/50 nm発光、400 nmダイクロイックミラー） Alexa Fluor 558、TRITCフィルターキューブ（545/25 nm励起、605/70 nm発光、565 nmダイクロイックミラー）、Cy5フィルターキューブ（620/60 nm励起、700 / 75nm発光、および600nmダイクロイックミラー）をAlexa Fluor 647用に使用した。
   注：彩度のない画像の蛍光シグナルを得るために、露光時間を調整してください。
2. VGLUT2の免疫蛍光シグナルによって糸球体構造を決定する。 ImageJを用いて糸球体内の軸索選別分子の染色強度を測定する。

データ解析

1. 軸索選別分子の染色強度からバックグラウンドシグナルを差し引く。
2. 準備するe発現データマトリックスであり、軸索ソーティング分子および糸球体からなる列からなるカラムを有する。
3. 準備された発現データセットを用いて主成分分析（PCA）を行う。次に、各主成分のPCAスコア、寄与率、および因子負荷を得る。

嗅糸球体マップは、OSN軸索1,2の初期の全身ターゲッティングおよびその後の糸球体分離によって形成される。糸球体分離は、発現レベルが発現したOR分子によって決定される軸索選別分子によって媒介される接着性/斥力性軸索相互作用によって調節される7 。糸球体分離に関与する軸索選別分子は、OB 9において位置非依存モザイク様式で発現される。この研究では、 Kirrel2 、 Sema7A 、 OLPC 、 BIG-2、およびPCDH17遺伝子を選択した。これらの軸索選別分子のいくつかは、活性依存的に7,8,10で発現される。

四倍免疫ここに示されている方法は、同じセクション上で同時に4つの分子の発現パターンの可視化を可能にした。これらの軸索選別分子は位置非依存性モザイク発現を示したが、それらのパターンは同一ではなかった（ 図1A、B ）。糸球体構造は、VGLUT2の蛍光シグナルによって定義された（ 図2A ）。軸索選別分子（Kirrel2、Sema7A、OLPC）は各糸球体において示差的に発現した。しかし、糸球体マーカーとして使用されたVGLUT2は糸球体間で均一に発現していた（ 図2B、2C ）。

単一の糸球体は、複数の変数によって表されるデータ単位と考えることができる。この多変量発現データを解析するために、主成分分析（PCA）を行った。 PCAは新しい座標系を定義するので、最初の座標は分散データセットが最も大きく、座標は最大の残差分散を有する。発現データセットをPCAに供し、第1および第2主成分（PC1およびPC2）の空間にプロットした（ 図3A ）。各主成分の寄与率は、各主成分が変数の全体の傾向においてどれくらいの割合を占めるかを示す。 PC1、PC2、PC3、PC4、PC5の寄与率はそれぞれ33.4％、28.2％、19.8％、17.3％、6.3％であった（ 図3B ）。 PCAはまた、各主成分における因子負荷を明らかにした。二乗された因子の負荷は、元の変数における分散の割合が因子によって説明されているかどうかを示します。 PC1では、Sema7A、OLPCおよびKirrel2の因子負荷は積極的に負荷されたが、BIG-2およびPCDH17の因子負荷は積載されなかった（ 図3C ）。以前の研究は、環状核が欠損した突然変異マウスにおけるこれらの分子の発現を分析した嗅覚シグナル伝達11の成分である脱ゲート化（CNG）チャネル遺伝子を発現し、発現レベルにおけるCNG依存性変化のパターンがPC1 9における因子負荷と類似していることを示した。これらの結果は、これらの分子の発現の多様性が、CNGチャネル媒介性神経活動によって生成されたことを示唆した。

図1：傍胸骨OB切片の4倍免疫染色。 （ A ）OE＆OBの概略図。 （ B ）v GLUT2（白）、Kirrel2（赤色）、Sema7A（緑色）、およびOLPC（青色）に対する抗体で免疫染色した2週齢のマウス由来の傍胸骨OB切片。右側にKirrel2（赤色）、Sema7A（緑色）、OLPC（青色）の合成画像が示されています。スケールバー=100μm。/files/ftp_upload/55893/55893fig1large.jpg "target =" _ blank ">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2：Axonソーティング分子の発現解析 （ A ）VGLUT2（紫色）、Kirrel2（赤色）、Sema7A（緑色）、OLPC（青色）に対する抗体で免疫染色された傍嗅球（OB）切片。各糸球体は、VGLUT2（シナプス前マーカー）の蛍光シグナルによって定義される。糸球体構造は破線で囲まれている。 （ B ）糸球体＃1、＃3、＃4、および＃6におけるKirrel2、Sema7AおよびOLPCの発現レベル。各糸球体において、軸索選別分子の染色強度を測定した。 （ C ）糸球体間で比較した軸索選別分子およびVGLUT2の発現レベル。これらの分子のシグナル強度をeaで測定したch糸球体。グラフ上の灰色の棒は、発現レベルの平均を示す。スケールバー=100μm。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

図3：Axonソーティング分子の発現データのPCA。 （ A ）5つの軸索選別分子（Kirrel2、Sema7A、OLPC、BIG-2、およびPCDH17）の発現データセットの主成分分析（PCA）スコアプロット（PC1 対 PC2）。合計1799の糸球体を分析した。 （ B ）5つの主要構成要素すべての寄与率および累積寄与率。 PC1、PC2、PC3、PC4、PC5の寄与率はそれぞれ0.334,0.282,0.198,0.173,0.063である。 （ C ）キルレルの因子負荷2、Sema7A、OLPC、BIG-2、PCDH17を用いた。 PC1、PC2、PC3の固有値は、それぞれ1.67,1.16、0.99である。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

著者らは、競合する金銭的利益を宣言していない。