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方法論記事

腫瘍の誘導および診断

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⸱

DOI:

10.3791/55901

⸱

2017年7月25日

 , 
1Structural Biology Center, National Institute of Genetics and Department of Genetics, School of Life Science, SOKENDAI, 2Graduate School of Media and Governance, Keio University

この記事について

サマリー

ショウジョウバエの上椎間板上皮におけるモザイククローン解析は、腫瘍形成の遺伝的メカニズムおよび細胞メカニズムを研究するための強力なモデルシステムです。ここでは、GAL4-UASシステムを用いて、 ショウジョウバエの翅の椎間板に腫瘍を誘導するプロトコールについて説明し、腫瘍の表現型を分類するための診断法を紹介する。

要約

癌の初期段階では、形質転換された突然変異細胞は細胞学的異常を示し、制御されない過増殖を開始し、組織組織化を漸進的に破壊する。 Drosophila melanogasterは、腫瘍発生の遺伝的メカニズムおよび細胞メカニズムを研究するために、癌生物学における一般的な実験モデルシステムとして登場しました。特に、 ショウジョウバエ （ Drosophila） imaginal disc（幼生の上皮発生）のための遺伝的ツールは、正常な上皮組織内で形質転換された前腫瘍細胞の生成を可能にする。これはヒト癌の初期段階と同様の状況である。しかし、 ショウジョウバエの翅の椎間板の腫瘍形成に関する最近の研究では、腫瘍の開始は組織固有の細胞構造および局所微小環境に依存することが示され、imaginalの腫瘍表現型を評価する際の腫瘍原性刺激に対する領域特異的感受性を考慮することが重要であるディスク。腫瘍進行の表現型分析を容易にするためにGAL4-UASシステムを用いた遺伝子実験のプロトコールについて説明します。この実験では、翅の椎間板に腫瘍性腫瘍を誘導します。以前には報告されていなかった腫瘍の進行の様々な段階（肥厚、形成異常または腫瘍形成）を識別するための明確な分類方法として、想像上皮に誘発されたクローン病変の表現型を分類するための診断方法をさらに紹介する。これらの方法は、 ショウジョウバエの種々の臓器における腫瘍表現型のクローン分析に広く適用可能であろう。

概要

上皮組織は、発達および細胞代謝回転を通じて組織を維持する顕著なホメオスタシス能力を有する高度に組織化されたシステムである。しかしながら、この堅牢な自己組織化システムは、腫瘍発生の間に次第に破壊される。腫瘍発生の開始時に、腫瘍遺伝子活性化または腫瘍抑制遺伝子不活性化から生じる個々の変異細胞が上皮層内に出現する。この形質転換された「プロ腫瘍細胞」が抑制的環境を回避し、上皮組織を破壊し、制御されない増殖を開始すると、腫瘍形成が起こる1 。過去数十年の間に、遺伝学および分子生物学における優れた技術的進歩は、がん研究において顕著な進歩を遂げました。特に、FLP-FRT（フリッパーゼリコンビナーゼ/フリッパーゼリコンビナーゼ標的）有糸分裂組換え体のようなショウジョウバエメラノガスターにおける遺伝的モザイク分析ツールを用いた最近の研究エーション2とフリップアウト-GAL4-UAS（上流活性化配列）システム3、大幅に良好腫瘍4、5、6の形成および転移に関与する遺伝的メカニズムを理解することに貢献しています。

保存されたショウジョウバエ腫瘍サプレッサー遺伝子、 致死性の巨大幼虫 （ lgl ）、 大型ディスク （ dlg ）、 落書き （ scrib ）の研究は、これらの遺伝子が重要な役割を果たすため、上皮組織の消失と腫瘍発生の重要な関係を明らかにした上皮組織7で、頂端-基底細胞極性および細胞増殖の調節インチショウジョウバエの原始椎間板は通常単層上皮であるが、これらの3つの遺伝子のいずれかのホモ接合突然変異は、細胞が構造および極性を失い、過剰増殖し、​​最終的に隣接する組織と融合する多層アモルファス塊を形成する7 。同様に、哺乳動物におけるこれらの遺伝子の破壊は、悪性腫瘍8,9の開発に関与しています。変異体組織によって示される腫瘍性表現型は、保存、新生物、腫瘍抑制遺伝子（nTSGs）として、これら三つの遺伝子の分類7,8につながっています。ホモ接合nTSG変異細胞は散発的にFLP-FRT媒介有糸分裂組換えを使用して、野生型の成虫を開発する際に生成される場合しかし、変異細胞はc-Jun N末端キナーゼ（JNK）依存性アポトーシス10、11を介して組織から除去されます、12、13、14、15、押出し 、 16 、または隣人による貪食および食作用17 。この遺伝的にモザイク上皮では、アポトーシスは主に隣接する正常細胞はnTSG変異細胞10、11、12、18のアポトーシスを引き起こすことを示唆し、クローンの境界に位置nTSG変異体細胞において検出されます。哺乳動物細胞における最近の研究では、プロの腫瘍細胞のこの細胞競争依存除去は癌19、20、21、22、23に対する進化的に保存された上皮の自己防御機構であることを確認しました。

しかし、最近のショウジョウバエの成虫の研究では、モザイクのnTSGノックダウンクローンが腫瘍性腫瘍を特異的に誘導することが示されています翼の想像上のディスクのIC領域16 。初期の腫瘍形成は末梢「ヒンジ」領域に常に見られ、ウイングディスク上皮の​​中央「ポーチ」領域では決して観察されず、nTSGノックダウン細胞の腫瘍形成能は局所環境に依存することが示唆された。中央ポーチ領域は、プロ腫瘍細胞が形成異常増殖を示さない一方で、周辺ヒンジ領域が「腫瘍ホットスポット」として振る舞う「腫瘍コールドスポット」として機能する16 。 「コールドスポット（cold spot）」ポーチ領域では、nTSG-ノックダウン細胞は基底面から剥離し、アポトーシスを起こす。対照的に、「ホットスポット」ヒンジ細胞は基底面に頑強な細胞骨格構造のネットワークを持っているため、nTSGノックダウン細胞は上皮の頂端側から剥離し、腫瘍原性の過増殖を開始する16 。したがって、原始椎間板における腫瘍表現型の解析には、注意深い検討が必要である腫瘍形成刺激に対する領域特異的感受性の低下。

ここでは、正常なウイングディスク上皮においてnTSGノックダウン細胞が生成されるGAL4-UAS- RNAiシステムを利用して、 ショウジョウバエのウイングのヘルニア椎間板に腫瘍性腫瘍形成を誘導するためのプロトコールについて説明する。これらの実験系は癌の初期段階を研究するのに有用であるが、椎間板上皮における腫瘍進行の段階を評価するための明確な分類方法はこれまで明らかにされていない。したがって、我々はまた、ウイングディスク上皮に誘導された前腫瘍クローン表現型を3つのカテゴリーに分類する診断法を提案する：過形成（増殖が増加した正常数の細胞の過剰な蓄積）、異形成（異常に出現する前悪性組織細胞）、および新生物（異常な外観および異常な増殖パターンを有する細胞からなる良性または悪性の腫瘍）。

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プロトコル

1.フライクロスクローン誘導

  1. バイアルのハエを収集する前に、バイアル内のすべてのハエを12時間後に除去する。
  2. バイアル内のハエをCO 2ガスを注入して麻酔し、飛行船をCO 2フライパッドに置きます。
  3. CO 2フライパッドから10〜20匹の未処理の雌と10匹の雄を新鮮なバイアルに移し、25℃で1日間インキュベートする。
  4. これらのハエを新鮮なバイアルに移し、25℃で12時間インキュベートする。
    注：最初の日に十分な卵を置いていないバージンの雌が最初のバイアルを捨てます。
  5. エンハンサー-GAL4系統については、成虫のハエを除去し、解剖まで25℃でバイアルをインキュベートする。
  6. フリップアウトGAL4によるモザイククローンの誘導のために、成虫のハエを除去し、バイアルを25℃で2〜4日間インキュベートする。熱ショック前のインキュベーション時間は、実験目的に依存する。卵の沈着の2日後の熱ショック（AED）は、未成熟の第2期にモザイククローンを生成する想像上皮を始める。 3または4日後の熱ショックAEDは、分化した早期から中期の第3齢の上皮上皮においてモザイククローンを生成する。
    注：腫瘍原性表現型に対する熱ショックタイミングの変化の影響を調べることが重要である。
  7. フリップアウト-GAL4によるモザイククローンの誘導のために、バイアルを37℃の水浴中に10〜45分間浸漬し、25℃で2〜3日間インキュベートすることによってバイアルを熱ショックする。
    注：各実験における熱ショック時間、タイミング、およびインキュベーション時間の情報は、図の凡例に示されています。

2.幼虫の解剖

  1. 蛍光立体顕微鏡下で適切な蛍光マーカー（ 例えば 、EGFP）で遺伝子型を木製スティックまたは鈍い鉗子で放浪している第3齢の幼虫を収集し、PBS（リン酸緩衝食塩水）を含む解剖皿に入れる。
  2. 2mLのプラスチックトランスファーピペットでピペッティングすることにより、PBS中の幼虫を洗浄する。
  3. 1つの鉗子で幼虫の中心をピンチし、他の鉗子で半分に体を裂く。
  4. 1つの鉗子で前半の口のフックを挟み、他の鉗子で体に向かって口を押して、体を裏返しにします。
  5. 唾液腺や脂肪体など不要な物質を鉗子で取り除きます。

3.固定および抗体染色

  1. 幼虫体の解剖学的前半部（imaginal wing discsを含む）を1.5mLプラスチックチューブに移し、穏やかに回転させながら暗所で室温で10分間Fix溶液（PBS中4％ホルムアルデヒド）1mLを固定する。
    注意：ホルムアルデヒドは有毒で発癌性があります。皮膚に接触しないよう保護手袋と衣類を着用する。
    注意：この部分では、特に明記されていない限り、すべてのステップは暗所で室温でナッターで行われます。
  2. Fixソリューションを削除して破棄します。組織を1mLのPBT（0.3％TritPBS中のX-100）上で3回、各15分間。
  3. PBTを除去し、ブロッキングのためにPBTG（0.2％ウシ血清アルブミンおよび5％正常ヤギ血清）1mLを添加し、室温で1時間または4℃で一晩インキュベートする。
  4. PBTGを除去し、PBTG（ 材料表を参照）で適切に希釈した一次抗体溶液を加え、4℃で一晩インキュベートする。
  5. 一次抗体溶液を除去し、1mLのPBTで組織を3回、それぞれ15分間洗浄する。
  6. PBTを除去し、PBTG（1：400）で適切に希釈した二次抗体溶液を加える。室温で2時間、または4℃で一晩、ナットする。
  7. 二次抗体溶液を除去し、1mLのPBTで組織を2回、それぞれ15分間洗浄する。
  8. F-アクチンを染色するために、PBTを除去し、PBS（1:40）で適切に希釈したPhalloidin溶液を加える。次に20分間寝かせる。ファロイジン溶液を除去し、1mLのPBTで組織を2回、それぞれ15分間洗浄する。
  9. 核DNAを対比染色するために、PBTを除去し、DAPI（4 '、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール）溶液（PBS中0.5μg/ mLのDAPI）を加える。その後、10分間ナットする。
    注意：DAPIは発癌性があります。皮膚に接触しないよう保護手袋と衣類を着用する。
  10. DAPI溶液を除去し、1mLのPBTで組織を2回、それぞれ15分間洗浄する。
  11. 室温で10分間、1mLのPBSで1回すすいでください。
  12. PBSを除去し、プレマウント培地として500μLの100％グリセロールを添加する。

4.顕微鏡スライドへの取り付け

  1. 2mLのプラスチックトランスファーピペットを用いて顕微鏡スライド上に染色した組織を置く。
  2. 鉗子で別の顕微鏡スライド上のマウント媒体の滴に組織を転送します。
  3. 1つの鉗子で解剖組織の終わりを押さえ、脳と目の触角円板を他の鉗子で引き離します。
    注：脳を翼の想像上のディスクの近くに置くように切開したままにしておきます。頭脳は、カバーガラスが羽の想像上のディスクを粉砕するのを防ぐプラットフォームとして機能する。
  4. 翼の想像上のディスクを隔離するには、解剖された組織の端を1つの鉗子で押さえ、体の壁を静かに引っ掻き、他の鉗子で椎間板を引き裂く。
    注：羽の想像上のディスクを見つけることが困難な場合は、後部から前側に気管を剥がします。ウィングの想像上の円板は気管にくっついている。
  5. 穏やかにカバーガラスでイーガルディスクを覆い、マニキュアでシールします。 4℃で保存する。

5.共焦点顕微鏡法

  1. 発光波長の範囲、レーザ強度、ゲイン、オフセット、走査速度と画像サイズ24を含む共焦点顕微鏡設定された画像取得パラメータを用いた共焦点画像を取得します。
    注：画像取得設定の詳細な手順については、各顕微鏡メーカーが提供する取扱説明書を参照してください。
  2. 単一の共同をキャプチャするにはウイングイメージディスク全体の非焦点部分には、20倍の対物レンズを使用します。
  3. 40倍または60倍のレンズを使用して、0.5〜1.0μmのステップサイズでzスタックスキャンによって3次元画像を取得します。
    注：細胞の表現型を高解像度で解析するには、画像サイズが512 x 512ピクセルより大きくなければなりません。

6. ImageJを用いた画像解析

  1. 共焦点zスタック画像を取得し、分析するために、フィジー、生体画像分析（https://fiji.sc/）25に集中オープンソースのImageJソフトウェアを使用します。
  2. 垂直セクションを取得するには、ImageJでzスタックイメージを開き、メニューアイテム "Image / Stacks / Reslice"を選択します。
    注：XZ軸またはYZ軸のいずれかは、[再分割]メニューで選択できます。垂直断面は、zスタック画像上に直線または矩形を描くことによって任意の方向に得ることもできる。

7.新生物表現型の診断

  1. 垂直を開く1組のz-スタック画像から得られた切片（XZまたはYZ軸）を分析し、形態学的表現型および抗体染色を分析する。
  2. （1）ノックダウンクローンを含む細胞塊が主上皮層から逸脱する場合、（2）接合細胞タンパク質の細胞内局在がこの細胞塊で変化した場合、腫瘍表現型の診断のために、 、および（3）この細胞塊の直径が4細胞より大きい場合。
  3. 図1に示すフローチャートに従って、腫瘍表現型を分類する。

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結果

ショウジョウバエのウイング上の椎間板におけるRNAi媒介性のnTSGノックダウンによって実験的に誘導された腫瘍形成を実証するために、3種の異なるGAL4ドライバを用いてlglまたはscribに対するUAS-RNAiを発現さ せた ：（1） sd-GAL4ウィングポーチ、およびヒンジ領域における軽度の発現（ 図2および図3A ）。 （2）背側内側襞の2つのドメインにおける強い発現、1つの前外側ドメインにおける軽度の発現、および腹側 - 後方ドメインにおける弱い発現を含む、ヒンジのサブドメインを駆動するupd-GAL4 （ 図2および図3C ）。 （3）UAS遺伝子を発現するラン...

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ディスカッション

GAL4-UASシステムは、 ショウジョウバエ 26の標的遺伝子発現のための最も強力な遺伝子ツールの1つであり、in vivoで腫瘍細胞の誘導と解析を大いに容易にします4 。このシステムは、野生型上皮組織内の腫瘍抑制遺伝子のノックダウンまたは癌遺伝子の過剰発現を有するクローンの生成を可能にする。これは、形質転換された前腫瘍細胞が正常上皮細胞に取り囲まれているヒト癌の初期段階と非常に類似した状況である。 GAL4エンハンサー - トラップ系統またはJanelia GAL4系統27のようなエンハンサー配列によって調節されるGAL4ドライバー系統は、独自の空間的に制限された発現パターンを有する。従って、これらのエンハンサー-GAL4系統は、限定された想像上の椎間板において一貫して腫瘍を誘導するために有用である。この研究で示されたsd-GAL4およびupd-GAL4に加えて、本発明者らは、 lglノックダウンがb...

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開示事項

著者は何も開示することはない。

謝辞

私たちは、原稿の批判的読解に対するJ.ヴォーゲンに感謝します。この研究は、日本学術振興会グラント番号26891025,15H01500およびYTへの武田科学財団研究助成金

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
<強>試薬
リン酸緩衝生理食塩水(PBS)和光162-19321
TritonX-100和光168-11805
ホルムアルデヒド和光064-00406
ウシ血清アルブミンΣA7906
正常ヤギ血清ΣG6767
封入剤、VectashieldVector LaboratoriesH-1000
DAPISigmaD9542
マウス抗DLG 4F3Developmental Studies Hybridoma Bank4F3 anti-discs large、RRID:AB_528203dilute in PBTG、1:40
mouse-anti-MMP1Developmental Studies Hybridoma Bank3A6B4、RRID:AB_5797803 混合 1:1:1 およびPBTGで希釈、1:40
マウス抗MMP1発生研究ハイブリドーマバンク3B8D12、RRID:AB_5797813混合1:1:1とPBTGで希釈、1:40
マウス抗MMP1発生研究ハイブリドーマバンク5H7B11、RRID:AB_5797793混合1:1:1とPBTGで希釈、1:40
抗atubulin>Developmental研究ハイブリドーマバンクAA4.3、RRID:PBTGで希釈されたAB_579793、PBS、1:100
Alexa Fluor 546 Phalloidin分子プローブA22283PBSで希釈、1:40
ヤギ抗マウスIgG抗体、Alexa Fluor 546分子プローブA11030PBTGで希釈、1:400
名前会社カタログ番号Comments
Fly strains<
em>sd-Gal4Bloomington Drosophila Stock Center#8609recombined with UAS-EGFP
>upd-Gal4Bloomington Drosophila Stock Center#26796UAS-EGFP
UAS-lgl-RNAi>Vienna Drosophila RNAi center#51247
UAS-scrib-RNAiVienna Drosophila RNAi center#105412
UAS-RasV12組み換えました>ブルーミントンショウジョウバエストックセンター#64196
UAS-Yki3SAブルーミントンショウジョウバエストックセンター#28817
hsFLPブルーミントンショウジョウバエストックセンター#6
Act>CD2>GAL4(フリップアウトGAL4)>ブルーミントンショウジョウバエStock Center#4780UAS-EGFP
UAS-EGFPBloomington Drosophila Stock Center#5428X chromosome
UAS-EGFPBloomington ショウジョウバエ Stock Center#66583 chromosome
UAS-Dicer2>BloomingtonDrosophila Stock Center#24650second chromosome
UAS-Dicer2Bloomington Drosophila Stock Center#24651third chromosome
vkg-GFPMorin et al. 2001GFP protein trap
マウス、

参考文献

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