ショウジョウバエの上椎間板上皮におけるモザイククローン解析は、腫瘍形成の遺伝的メカニズムおよび細胞メカニズムを研究するための強力なモデルシステムです。ここでは、GAL4-UASシステムを用いて、 ショウジョウバエの翅の椎間板に腫瘍を誘導するプロトコールについて説明し、腫瘍の表現型を分類するための診断法を紹介する。
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この記事について
サマリー
要約
癌の初期段階では、形質転換された突然変異細胞は細胞学的異常を示し、制御されない過増殖を開始し、組織組織化を漸進的に破壊する。 Drosophila melanogasterは、腫瘍発生の遺伝的メカニズムおよび細胞メカニズムを研究するために、癌生物学における一般的な実験モデルシステムとして登場しました。特に、 ショウジョウバエ （ Drosophila） imaginal disc（幼生の上皮発生）のための遺伝的ツールは、正常な上皮組織内で形質転換された前腫瘍細胞の生成を可能にする。これはヒト癌の初期段階と同様の状況である。しかし、 ショウジョウバエの翅の椎間板の腫瘍形成に関する最近の研究では、腫瘍の開始は組織固有の細胞構造および局所微小環境に依存することが示され、imaginalの腫瘍表現型を評価する際の腫瘍原性刺激に対する領域特異的感受性を考慮することが重要であるディスク。腫瘍進行の表現型分析を容易にするためにGAL4-UASシステムを用いた遺伝子実験のプロトコールについて説明します。この実験では、翅の椎間板に腫瘍性腫瘍を誘導します。以前には報告されていなかった腫瘍の進行の様々な段階（肥厚、形成異常または腫瘍形成）を識別するための明確な分類方法として、想像上皮に誘発されたクローン病変の表現型を分類するための診断方法をさらに紹介する。これらの方法は、 ショウジョウバエの種々の臓器における腫瘍表現型のクローン分析に広く適用可能であろう。
概要
上皮組織は、発達および細胞代謝回転を通じて組織を維持する顕著なホメオスタシス能力を有する高度に組織化されたシステムである。しかしながら、この堅牢な自己組織化システムは、腫瘍発生の間に次第に破壊される。腫瘍発生の開始時に、腫瘍遺伝子活性化または腫瘍抑制遺伝子不活性化から生じる個々の変異細胞が上皮層内に出現する。この形質転換された「プロ腫瘍細胞」が抑制的環境を回避し、上皮組織を破壊し、制御されない増殖を開始すると、腫瘍形成が起こる1 。過去数十年の間に、遺伝学および分子生物学における優れた技術的進歩は、がん研究において顕著な進歩を遂げました。特に、FLP-FRT（フリッパーゼリコンビナーゼ/フリッパーゼリコンビナーゼ標的）有糸分裂組換え体のようなショウジョウバエメラノガスターにおける遺伝的モザイク分析ツールを用いた最近の研究エーション2とフリップアウト-GAL4-UAS（上流活性化配列）システム3、大幅に良好腫瘍4、5、6の形成および転移に関与する遺伝的メカニズムを理解することに貢献しています。
保存されたショウジョウバエ
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プロトコル
1.フライクロスクローン誘導
- バイアルのハエを収集する前に、バイアル内のすべてのハエを12時間後に除去する。
- バイアル内のハエをCO 2ガスを注入して麻酔し、飛行船をCO 2フライパッドに置きます。
- CO 2フライパッドから10〜20匹の未処理の雌と10匹の雄を新鮮なバイアルに移し、25℃で1日間インキュベートする。
- これらのハエを新鮮なバイアルに移し、25℃で12時間インキュベートする。
注：最初の日に十分な卵を置いていないバージンの雌が最初のバイアルを捨てます。 - エンハンサー-GAL4系統については、成虫のハエを除去し、解剖まで25℃でバイアルをインキュベートする。
- フリップアウトGAL4によるモザイククローンの誘導のために、成虫のハエを除去し、バイアルを25℃で2〜4日間インキュベートする。熱ショック前のインキュベーション時間は、実験目的に依存する。卵の沈着の2日後の熱ショック（AED）は、未成熟の第2期にモザイククローンを生成する想像上皮を始める。 3または4日後の熱ショックAEDは、分化した早期から中期の第3齢の上皮上皮においてモザイククローンを生成する。
注：腫瘍原性表現型に対する熱ショックタイミングの変化の影響を調べることが重要である。 - フリップアウト-GAL4によるモザイククローンの誘導のために、バ....
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結果
ショウジョウバエのウイング上の椎間板におけるRNAi媒介性のnTSGノックダウンによって実験的に誘導された腫瘍形成を実証するために、3種の異なるGAL4ドライバを用いてlglまたはscribに対するUAS-RNAiを発現さ せた ：（1） sd-GAL4ウィングポーチ、およびヒンジ領域における軽度の発現（ 図2および図3A ）。 （2）背側内側襞の2つのドメインにおける強い発現、1つの前外側ドメインにおける軽度の発現、および腹側 - 後方ドメインにおける弱い発現を含む、ヒンジのサブドメインを駆動するupd-GAL4 （ 図2および図3C ）。 （3）UAS遺伝子を発現するラン.......
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ディスカッション
GAL4-UASシステムは、 ショウジョウバエ 26の標的遺伝子発現のための最も強力な遺伝子ツールの1つであり、in vivoで腫瘍細胞の誘導と解析を大いに容易にします4 。このシステムは、野生型上皮組織内の腫瘍抑制遺伝子のノックダウンまたは癌遺伝子の過剰発現を有するクローンの生成を可能にする。これは、形質転換された前腫瘍細胞が正常上皮細胞に取り囲まれているヒト癌の初期段階と非常に類似した状況である。 GAL4エンハンサー - トラップ系統またはJanelia GAL4系統27のようなエンハンサー配列によって調節されるGAL4ドライバー系統は、独自の空間的に制限された発現パターンを有する。従って、これらのエンハンサー-GAL4系統は、限定された想像上の椎間板において一貫して腫瘍を誘導するために有用である。この研究で示されたsd-GAL4およびupd-GAL4に加えて、本発明者らは、 lglノックダウンがb.......
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開示事項
著者は何も開示することはない。
謝辞
私たちは、原稿の批判的読解に対するJ.ヴォーゲンに感謝します。この研究は、日本学術振興会グラント番号26891025,15H01500およびYTへの武田科学財団研究助成金
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| <強>試薬 | |||
| リン酸緩衝生理食塩水(PBS) | 和光 | 162-19321 | |
| TritonX-100 | 和光 | 168-11805 | |
| ホルムアルデヒド | 和光 | 064-00406 | |
| ウシ血清アルブミン | ΣA7906 | ||
| 正常ヤギ血清 | ΣG6767 | ||
| 封入剤、Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| マウス抗DLG 4F3 | Developmental Studies Hybridoma Bank | 4F3 anti-discs large、RRID:AB_528203 | dilute in PBTG、1:40 |
| mouse-anti-MMP1 | Developmental Studies Hybridoma Bank | 3A6B4、RRID:AB_579780 | 3 混合 1:1:1 およびPBTGで希釈、1:40 |
| マウス抗MMP1 | 発生研究ハイブリドーマバンク | 3B8D12、RRID:AB_579781 | 3混合1:1:1とPBTGで希釈、1:40 |
| マウス抗MMP1 | 発生研究ハイブリドーマバンク | 5H7B11、RRID:AB_579779 | 3混合1:1:1とPBTGで希釈、1:40 |
| 抗atubulin | >Developmental研究ハイブリドーマバンク | AA4.3、RRID:PBTGで希釈されたAB_579793 | 、PBS、1:100 |
| Alexa Fluor 546 Phalloidin | 分子プローブ | A22283 | PBSで希釈、1:40 |
| ヤギ抗マウスIgG抗体、Alexa Fluor 546 | 分子プローブA11030 | PBTGで希釈、1:400 | |
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | Comments |
| Fly strains< | |||
| em>sd-Gal4 | Bloomington Drosophila Stock Center | #8609 | recombined with UAS-EGFP |
| >upd-Gal4 | Bloomington Drosophila Stock Center | #26796 | UAS-EGFP |
| UAS-lgl-RNAi | >Vienna Drosophila RNAi center | #51247 | |
| UAS-scrib-RNAi | Vienna Drosophila RNAi center | #105412 | |
| UAS-RasV12組み換えました> | ブルーミントンショウジョウバエストックセンター | #64196 | |
| UAS-Yki3SA | ブルーミントンショウジョウバエストックセンター | #28817 | |
| hsFLP | ブルーミントンショウジョウバエストックセンター | #6 | |
| Act>CD2>GAL4(フリップアウトGAL4) | >ブルーミントンショウジョウバエStock Center | #4780 | UAS-EGFP |
| UAS-EGFP | Bloomington Drosophila Stock Center | #5428 | X chromosome |
| UAS-EGFP | Bloomington ショウジョウバエ Stock Center | #6658 | 3 chromosome |
| UAS-Dicer2 | >BloomingtonDrosophila Stock Center | #24650 | second chromosome |
| UAS-Dicer2 | Bloomington Drosophila Stock Center | #24651 | third chromosome |
| vkg-GFP | Morin et al. 2001 | GFP protein trap |
参考文献
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. The hallmarks of cancer. Cell. 100 (1), 57-70 (2000).
- Xu, T., Rubin, G. M. Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues. Development. 117 (4), 1223-1237 (1993).
- Struhl, G., Basler, K.
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再版と許可
