マウス骨格筋からのI型およびII型ペリクルの単離

サマリー

この研究は、骨格筋からのI型およびII型周皮細胞の容易かつ同時の単離を可能にするFACSベースのプロトコールを記載する。

要約

角質細胞は血管周囲多分化能細胞であり、異なる器官または同じ組織内でさえも異質性を示す。骨格筋には、異なる分子マーカーを発現し、明確な分化能力を有する、少なくとも2つの周皮細胞亜集団（I型およびII型と呼ばれる）が存在する。 NG2-DsRedおよびNestin-GFP二重トランスジェニックマウスを用いて、I型（NG2-DsRed ⁺ Nestin-GFP-）およびII型（NG2-DsRed ⁺ Nestin-GFP ⁺ ）の周皮細胞が正常に単離された。しかしながら、これらの二重トランスジェニックマウスの利用可能性は、この精製方法の広範な使用を妨げる。この研究は、骨格筋からのI型およびII型の周皮細胞の容易かつ同時の単離を可能にする代替プロトコールを記載する。このプロトコルは、蛍光活性化細胞選別（FACS）技術を利用し、Nestin-GFPシグナルと共にNG2ではなくPDGFRβを標的とする。分離後、I型とTy型pe II周皮細胞は異なる形態を示す。さらに、この新しい方法で単離されたI型およびII型の周皮細胞は、二重トランスジェニックマウスから単離されたものと同様に、脂肪生成性および筋原性である。これらの結果は、このプロトコルを用いて、周皮細胞亜集団を骨格筋から、場合によっては他の組織から単離することができることを示唆している。

概要

筋ジストロフィーは、これまでのところ有効な治療法を持たない筋変性疾患である。組織の再生を促進する治療法の開発は、常に大きな関心を集めています。損傷後の組織の再生と修復は、幹細胞/前駆細胞に依存する¹ 。衛星細胞は、筋肉再生に寄与する筋原性前駆細胞である2,3,4,5,6,7。しかしながら、それらの臨床的使用は、制限された移動および注射後の低い生存率、ならびにインビトロ増幅後のそれらの減少した分化能力によって妨げられる8,9,10,11。サテリに加えて骨格筋はまた、血小板由来成長因子受容体 - ベータ（PDGFRβ） - 陽性間質細胞などの筋原性ポテンシャル12,13,14,15,16を有する多くの他の細胞集団を含む。筋肉由来のPDGFRβ ⁺細胞が筋原性細胞に分化し、筋病変および機能を改善することが示された証拠がある14,17,18,19,20。 PDGFRβは、主に多能性を有する血管周囲細胞である周皮細胞^21を標識する22,23。 PDGFRβに加えて、Neuron-Glial 2（NG2）およびCD146を含む多くの他のマーカーもiに使用される周皮細胞を鑑定する²¹ 。しかしながら、これらのマーカーのいずれも周細胞特異的^21ではないことに留意すべきである。最近の研究では、異なる分子マーカーを発現し、....

プロトコル

野生型およびネスチン-GFPトランスジェニックマウスを、ミネソタ大学の動物施設に収容した。すべての実験手順は、ミネソタ大学の施設動物実験および使用委員会によって承認され、実験動物のケアおよび使用のためのNIHガイドに従っていた。

1.筋肉解離と単細胞分離

1. トリブロモエタノール（250mg / kg、腹腔内）で成体マウス（男性および女性の両方）を安楽死させ、腹部皮膚を70％エタノールで滅菌する。
   注：ケタミンはNMDA受容体と相互作用することが知られているので、試験に影響を与える可能性があるため、ここではトリブロモエタノールを麻酔/安楽死のためにケタミンの代わりに使用した。
2. マウスを仰臥位に置き、メスを使用して腹部の皮膚を水平に切開する。後ろの筋肉を露出させるために反対方向に引っ張って手で皮膚を剥がします。
3. コレク鉗子とハサミを使用して両方の後肢から筋肉を取り除く。氷上で1％ペニシリン - ストレプトマイシン（P / S）を補充した滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS）にそれらを保存する。
4. 1％P / Sを補充した氷冷PBSで解剖した後肢筋肉を2回洗浄し、滅菌10cmプレートに移す。
5. 慎重に2倍の倍率で解剖顕微鏡下で鉗子とハサミを使用して、筋肉から神経、血管、および結合組織を切開する。
6. 滅菌はさみと刃を使用して細かく切って筋肉を小さな片（1〜2mm ^....

結果

レーザ強度およびチャネル補償を含むFACSパラメータは、無染色対照および単色対照の結果に基づいて補正される。 PDGFRβ-PE-FMOコントロールを用いてPDGFRβ-PE ⁺集団のゲーティングを設定する（ 図1A ）。 PDGFRβ-PE-細胞の中で、Nestin-GFP ⁺およびNestin-GFP-細胞を表す2つの集団が明確に分離されている（ 図1A ）。 PDGFRβ-PE ⁺ネスチン-GFP ⁺およびPDGFRβ-PE ⁺ネスチン-GFP集団のゲーティング境界は、PDGFRβ-PE ⁺およびネスチン-GFP ^+のゲーティングに基づいて設定される（ 図1A ）。これらの境界は、PDGFRβ-PE ⁺ネスチン-GF.......

ディスカッション

角質細胞は、毛細血管21,26の管腔外表面上に位置する多分化能血管周囲細胞^{22,23 で}ある。骨格筋において、周皮細胞は、脂肪生成経路および/または筋形成経路19,20,24に沿って分化することができる。最近の研究により、異なるマーカー発現および明確な分化能を有する周皮細胞の2つの亜集団が明らかになった（19,24,25）。タイプI（NG2 ⁺ネスチン^- ）周皮細胞は脂肪生成性であり、タイプII（NG2 ⁺ネスチン⁺ ）周皮細胞は筋原性である。 インビトロ研究のためのこれらの亜集団の単離は、NG2-DsRedおよびNestin-GFP二重トランスジェニックマウス系統を必要とする。この精製の依存性プロトコールは、その適用を著しく制限し、従って、周皮細胞亜集団の生物学に関する研究を制限する。

このビデオ記事は、マウスの骨格筋からのI型およびII型の周皮細胞の単離の代替方法を示しています。この新しい方法は、依然とし.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
セルソーター		ソニー SH800
自動セットアップビーズ		ソニー LE-B3001
DMEM	Gibco	11995
Avertin	Sigma	T48402
周皮細胞増殖培	ScienCell	1201
MSC 基礎培地 (マウス)	Stemcell Technologies	5501
脂肪産生刺激サプリメント (マウス)	Stemcell Technologies	5503
ウシ胎児血清	Gibco	16000
馬血清	Σ	H1270
コラゲナーゼ2型	ワーシントン	LS004176
0.25%トリプシン/ EDTA	Gibco	25200
ペニシリン/ストレプトマイシン	Gibco	15140
PDL	Sigma	P6407
PDGFR&β;-PE 抗体	eBioscience	12-1402
ペリリピン抗体	Σ	P1998
S-ミオシン抗体	DSHB	MF-20
Alexa 555-anti-rabbit 抗体	サーモフィッシャーサイエンティフィック	A-31572
Alexa 555-抗マウス抗体	サーモフィッシャーサイエンティフィック	A-31570
封入剤 DAPI	ベクターラボラトリーズ	H-1200
DAPI	サーモフィッシャーサイエンティフィック	D1306
HEPES	Gibco	15630
EDTA	フィ	ッシャーBP120
BSA	Sigma	A2058
NH4Cl	フィッシャー・サイエンティフィック	A661
KHCO3	フィッシャー・サイエンティフィック	P184
PBS	Gibco	14190
18 G ニードル	BD	305196
10 mL セロジカル・ピペット	BD	357551
OneComp eBeads	eBioscience	01-1111

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