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方法論記事

マウス骨格筋からのI型およびII型ペリクルの単離

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DOI:

10.3791/55904

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2017年5月26日

 ,  , 
1College of Pharmacy, University of Minnesota

この記事について

サマリー

この研究は、骨格筋からのI型およびII型周皮細胞の容易かつ同時の単離を可能にするFACSベースのプロトコールを記載する。

要約

角質細胞は血管周囲多分化能細胞であり、異なる器官または同じ組織内でさえも異質性を示す。骨格筋には、異なる分子マーカーを発現し、明確な分化能力を有する、少なくとも2つの周皮細胞亜集団（I型およびII型と呼ばれる）が存在する。 NG2-DsRedおよびNestin-GFP二重トランスジェニックマウスを用いて、I型（NG2-DsRed + Nestin-GFP-）およびII型（NG2-DsRed + Nestin-GFP + ）の周皮細胞が正常に単離された。しかしながら、これらの二重トランスジェニックマウスの利用可能性は、この精製方法の広範な使用を妨げる。この研究は、骨格筋からのI型およびII型の周皮細胞の容易かつ同時の単離を可能にする代替プロトコールを記載する。このプロトコルは、蛍光活性化細胞選別（FACS）技術を利用し、Nestin-GFPシグナルと共にNG2ではなくPDGFRβを標的とする。分離後、I型とTy型pe II周皮細胞は異なる形態を示す。さらに、この新しい方法で単離されたI型およびII型の周皮細胞は、二重トランスジェニックマウスから単離されたものと同様に、脂肪生成性および筋原性である。これらの結果は、このプロトコルを用いて、周皮細胞亜集団を骨格筋から、場合によっては他の組織から単離することができることを示唆している。

概要

筋ジストロフィーは、これまでのところ有効な治療法を持たない筋変性疾患である。組織の再生を促進する治療法の開発は、常に大きな関心を集めています。損傷後の組織の再生と修復は、幹細胞/前駆細胞に依存する1 。衛星細胞は、筋肉再生に寄与する筋原性前駆細胞である2,3,4,5,6,7。しかしながら、それらの臨床的使用は、制限された移動および注射後の低い生存率、ならびにインビトロ増幅後のそれらの減少した分化能力によって妨げられる8,9,10,11。サテリに加えて骨格筋はまた、血小板由来成長因子受容体 - ベータ（PDGFRβ） - 陽性間質細胞などの筋原性ポテンシャル12,13,14,15,16を有する多くの他の細胞集団を含む。筋肉由来のPDGFRβ +細胞が筋原性細胞に分化し、筋病変および機能を改善することが示された証拠がある14,17,18,19,20。 PDGFRβは、主に多能性を有する血管周囲細胞である周皮細胞21を標識する22,23。 PDGFRβに加えて、Neuron-Glial 2（NG2）およびCD146を含む多くの他のマーカーもiに使用される周皮細胞を鑑定する21 。しかしながら、これらのマーカーのいずれも周細胞特異的21ではないことに留意すべきである。最近の研究では、異なる分子マーカーを発現し、異なる機能を果たすタイプIおよびタイプIIと呼ばれる筋肉周皮細胞の2つのサブタイプが明らかになった19,24,25。生化学的には、タイプIの周細胞はNG2 +ネスチンであり、タイプIIの周細胞はNG2 +ネスチン+19,24である。機能的には、I型周皮細胞は脂肪蓄積および/または線維化に寄与する脂肪生成分化を受けることができるが、II型周皮細胞は筋再生経路に沿って分化し、筋再生に寄与する19,24,25。これらの結果は、（1）I型の周皮細胞は、b（2）II型周皮細胞は、筋ジストロフィーに対して大きな治療可能性を有する。これらの集団のさらなる調査および特徴付けは、高レベルの純度でI型およびII型周皮細胞の分離を可能にする単離プロトコルを必要とする。

現在、周皮細胞亜集団の単離は、NG2-DsRedおよびNestin-GFP二重トランスジェニックマウスに依存している19,24。 NG2-DsRedマウスの利用可能性およびほとんどのNG2抗体の品質は、この方法の広範な使用を制限する。すべてのNG2 +周皮細胞もまた骨格筋19,20,24においてPDGFRβを発現することを考慮すると、我々は、NG2が、周皮細胞およびそれらの亜集団の単離のためにPDGFRβによって置換され得ると仮定する。この作業では、FACSベースのプロトコルについて説明します。PDGFRβ染色およびネスチン-GFPシグナルを使用する。この方法は、（1）NG2-DsRedバックグラウンドを必要とせず、（2）よく特徴付けられた市販のPDGFRβ抗体を使用するため、研究者の要求が少ない。さらに、これは、I型およびII型の周皮細胞を高純度で同時に単離することを可能にし、これらの周皮細胞亜集団の生物学および治療可能性をさらに調査することを可能にする。精製後、これらの細胞を培養で増殖させることができ、その形態を可視化することができる。この研究はまた、二重トランスジェニックマウスから精製されたものと同様に、この方法を用いて単離されたI型およびII型の周皮細胞が脂肪生成性および筋原性であることも示している。

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プロトコル

野生型およびネスチン-GFPトランスジェニックマウスを、ミネソタ大学の動物施設に収容した。すべての実験手順は、ミネソタ大学の施設動物実験および使用委員会によって承認され、実験動物のケアおよび使用のためのNIHガイドに従っていた。

1.筋肉解離と単細胞分離

  1. トリブロモエタノール（250mg / kg、腹腔内）で成体マウス（男性および女性の両方）を安楽死させ、腹部皮膚を70％エタノールで滅菌する。
    注：ケタミンはNMDA受容体と相互作用することが知られているので、試験に影響を与える可能性があるため、ここではトリブロモエタノールを麻酔/安楽死のためにケタミンの代わりに使用した。
  2. マウスを仰臥位に置き、メスを使用して腹部の皮膚を水平に切開する。後ろの筋肉を露出させるために反対方向に引っ張って手で皮膚を剥がします。
  3. コレク鉗子とハサミを使用して両方の後肢から筋肉を取り除く。氷上で1％ペニシリン - ストレプトマイシン（P / S）を補充した滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS）にそれらを保存する。
  4. 1％P / Sを補充した氷冷PBSで解剖した後肢筋肉を2回洗浄し、滅菌10cmプレートに移す。
  5. 慎重に2倍の倍率で解剖顕微鏡下で鉗子とハサミを使用して、筋肉から神経、血管、および結合組織を切開する。
  6. 滅菌はさみと刃を使用して細かく切って筋肉を小さな片（1〜2mm 3 ）に切ります。必要に応じて、少量のダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）を加えて、筋肉が乾燥しないようにします。
  7. 機械的に10mLの血清学的ピペットを10回上下にピペッティングすることにより組織を破壊する。
  8. 新鮮な消化溶液（0.2％タイプ2コラゲナーゼを補充したDMEM）を混合物に加える。 gentlと37℃で2時間インキュベートする35回転/分で攪拌する。
  9. 混合物を均質化するために18G針を用いて粉砕する。次に、500 xgで5分間遠心分離します。上清を捨て、ペレットを0.25％トリプシン/ EDTAに再懸濁する。 37℃で10分間インキュベートする。遠心分離を2回以上繰り返します。
  10. 20％ウシ胎児血清（FBS）を添加したDMEM 10mLを加え、500xgで5分間遠心する。上清を捨て、ペレットを赤血球溶解緩衝液（155mM NH 4 Cl、10mM KHCO 3および0.1mM EDTA）に再懸濁する。
  11. 500xgで5分間遠心分離する。上清を捨て、ペレットを選別バッファー（20mM HEPES、pH7.0; 1mM EDTA;およびCa / Mg 2+フリーPBS、pH7.0中の1％BSA）に再懸濁する。混合物を40μmセルストレーナに通して濾過して、単一細胞懸濁液を得る。
  12. 500xgで5分間遠心分離する。上清を捨て、ペレットを1 mLの分取バッファーに再懸濁する。
  13. カウント血球計数器で細胞数を測定し、単一細胞懸濁液を選別緩衝液中で5×10 6 / mLに希釈する。

2.細胞染色および選別

  1. 表1に記載されているようにコントロールとサンプルを準備する。 表1に記載されているように、氷上でそれぞれの抗体を含む単一細胞懸濁液を30分間染色する。
  2. 500xgで5分間遠心分離し、ペレットを選別バッファーで2回洗浄する。
  3. 表1に示すように、DAPIを単一細胞溶液に添加する.DAPI単色対照については5μg/ mLのDAPI（最終濃度）を使用し、PDGFRβ-PE-FMO対照および試料については1μg/ mLのDAPIを使用する。実験を通して、すべてのチューブを氷上に保つ。
  4. ソーターとソフトウェアをオンにします。プロンプトが表示されたら、100μmのソーティングチップをスキャンして挿入します。
  5. 自動セットアップ（ すなわち、チップアライメント、液滴較正、サイドストリーム較正、およびソート遅延較正自動セットアップビーズをロードすることにより、オンにすることができます。
  6. 自動設定が完了したら、[テスト]タブの[新規作成]をクリックし、[パブリックテンプレート]から[空のテンプレート]を選択します。
  7. 「測定設定」で、「FL1」に「DAPI」、「FL2」に「Nestin-GFP」、「FL3」に「PDGFRβ」を入力します。「FL4」 - 「FL6」のチェックボックスをオフにします。
  8. 405、488、および561レーザーを有効にして[新しい実験を作成]をクリックすると、そのボックスにチェックマークが付いています。
  9. 「補正ウィザードの開始」オプションを選択し、補正ウィザードを実行して補正を設定するプロンプトに従います。
    1. 染色されていないコントロールを読み込み、「開始」をクリックします。 "Detector＆Threshold Settings"をクリックし、FSCおよびBSC検出器のセンサーゲインを調整して、人口をスケールに配置します。
    2. 広告FL1-FL3蛍光チャネルのゲインレベルのみで、ヒストグラムの左側に陰性集団を配置する。 「記録」ボタンをクリックしてデータを記録します。
    3. プロンプトが表示されたら、単色のコントロールを1つずつ読み込みます。 "Start and Record"をクリックしてデータを記録します。ヒストグラム上の陽性集団のゲートを調整する。 [次へ]をクリックします。
    4. [補正]タブの[計算マトリックス]に移動し、[補正設定の計算]パネルで[計算]をクリックして補正を実行します。 「終了」をクリックして、「補償ウィザード」を終了します。
  10. PDGFRβ-PE-FMOコントロールをロードし、 "Start"をクリックします。 「すべてのイベント」プロットの下で、関心のあるセルの周囲にポリゴンゲート（ゲートA）を描画します。
  11. Gate Aの内側をダブルクリックして、子プロットを作成します。 Y軸をDAPIに変更し、ライブ（DAPI 低 ）セルの周囲にポリゴンゲート（ゲートB）を描画します。 iをダブルクリック子のプロットを作成するにはGate Bの横にある。 X軸をFSC-Hに変更し、Y軸をFSC-Wに変更し、ダブルレットを除去するためにシングレットの周りにポリゴンゲート（ゲートC）を描画します。
  12. ゲートC内をダブルクリックして子プロットを作成します。 X軸をNestin-GFPに、Y軸をPDGFRβ-PEに変更する。 「記録」ボタンをクリックしてデータを記録します。
  13. サンプルをロードし、ステップ2.11-2.12を繰り返します。記録後、 "Pause"をクリックしてサンプルを保存します。
  14. PDGFRβ-PE-FMOコントロールに基づいて、PDGFRβ +およびNestin-GFP +細胞のゲーティング境界を定義する。 PDGFRβ +ネスチン-GFP -およびPDGFRβ +ネスチン-GFP +集団のためのゲートを描く。
  15. 「選別方法」で「2-way Tubes」を選択し、「PDGFRβ + Nestin-GFP - 」および「PDGFRβ + Nestin-GFP + 」細胞を左右の採取管に割り当て、明らかに。収集バッファーに充填した15 mLの収集チューブをコレクションステージにマウントし、 "Load Collection"ボタンをクリックします。
  16. サンプルを実行し続けるには、「Resume」ボタンをクリックしてください。 PDGFRβ +ネスチン-GFP - （タイプI周皮細胞）およびPDGFRβ +ネスチン-GFP + （タイプII周皮細胞）を収集するために、「ソート開始」をクリックしてください。

3.ソート後の分析

  1. 選別した細胞を500 xgで5分間遠心分離し、ペリサイトをペリサイト培地（ 材料表を参照）1 mLに再懸濁し、血球計数器を使用して細胞密度を数えます。
  2. 約1×10 4細胞/ cm 2で、ポリ-D-リジン（PDL）被覆したカバースリップ上の種I型およびII型周皮細胞を接種する。 5％CO 2を含む37℃で3日間、周皮細胞で増殖させる。
  3. 3日目に、ペリサイト形態（位相差下）および内在性Nestin-GFP発現を蛍光マイクロ（励起レーザー：488nm、励起フィルター：470 / 40nm、発光フィルター：515 / 30nm）。 20倍の対物レンズ（0.45 NA）で画像を撮影します。
  4. 以前に記載されているように、脂肪細胞培地を脂肪生成（マウスMSC基礎培地+脂肪生成刺激補助）および筋原性（DMEM + 2％ウマ血清）培地で置換して脂肪生成および筋原分化を開始する。 2〜3日ごとに培地を交換する。
  5. 室温で20分間、4％パラホルムアルデヒド（PFA）中の17日目（脂肪生成/筋原性分化の14日後）に細胞を固定する。
    注：注意、PFAは発癌物質です。
  6. 以前の刊行物19,20に記載されているように、ペリリピン（脂肪細胞マーカー）およびS-ミオシン（成熟筋管/筋線維マーカー）に対する免疫細胞化学を行う。
    1. 室温で10分間、固定した細胞をPBSで3回洗浄する。
    2. ブロッキング緩衝液（PBS5％ロバ血清、3％BSA、および0.3％Triton X-100を補充したもの）を添加し、室温で1時間インキュベートする。
    3. 細胞を抗ペリリピン（2μg/ mL）および/または抗S-ミオシン（2μg/ mL）抗体と共に4℃で一晩インキュベートする。
    4. 室温で10分間、PBS中で細胞を3回洗浄する。
    5. 室温で1時間、Alexa 555ロバ抗ウサギ（4μg/ mL）および/またはAlexa555ロバ抗マウス（4μg/ mL）抗体と細胞をインキュベートする。
    6. 室温で10分間、PBS中で細胞を3回洗浄する。
    7. 免疫染色された細胞をDAPIを含むマウント培地でマウントします（材料の表を参照）。蛍光顕微鏡（励起レーザー：543nm; 540 / 45nm励起および600 / 50nm発光）を用いてペリリピンおよびS-ミオシン発現を調べ、40倍対物レンズ（0.60NA）下で画像を撮る。

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結果

レーザ強度およびチャネル補償を含むFACSパラメータは、無染色対照および単色対照の結果に基づいて補正される。 PDGFRβ-PE-FMOコントロールを用いてPDGFRβ-PE +集団のゲーティングを設定する（ 図1A ）。 PDGFRβ-PE-細胞の中で、Nestin-GFP +およびNestin-GFP-細胞を表す2つの集団が明確に分離されている（ 図1A ）。 PDGFRβ-PE +ネスチン-GFP +およびPDGFRβ-PE +ネスチン-GFP集団のゲーティング境界は、PDGFRβ-PE +およびネスチン-GFP +のゲーティングに基づいて設定される（ 図1A ）。これらの境界は、PDGFRβ-PE +ネスチン-GF...

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ディスカッション

角質細胞は、毛細血管21,26の管腔外表面上に位置する多分化能血管周囲細胞22,23 である。骨格筋において、周皮細胞は、脂肪生成経路および/または筋形成経路19,20,24に沿って分化することができる。最近の研究により、異なるマーカー発現および明確な分化能を有する周皮細胞の2つの亜集団が明らかになった（19,24,25）。タイプI（NG2 +ネスチン- ）周皮細胞は脂肪生成性であり、タイプII（NG2 +ネスチン+ ）周皮細胞は筋原性である。 インビトロ研究のためのこれらの亜集団の単離は、NG2-DsRedおよびNestin-GFP二重トランスジェニックマウス系統を必要とする。この精製の依存性プロトコールは、その適用を著しく制限し、従って、周皮細胞亜集団の生物学に関する研究を制限する。

このビデオ記事は、マウスの骨格筋からのI型およびII型の周皮細胞の単離の代替方法を示しています。この新しい方法は、依然とし...

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開示事項

すべての著者は、開示する利害の衝突はありません。

謝辞

この研究は、筋緊張性ジストロフィー基金（MDF-FF-2014-0013）の基金とアメリカ心臓協会（16SDG29320001）の科学者開発助成金によって部分的に支えられました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
セルソーターソニー SH800
自動セットアップビーズソニー LE-B3001
DMEMGibco11995
Avertin SigmaT48402
周皮細胞増殖培ScienCell1201
MSC 基礎培地 (マウス)Stemcell Technologies5501
脂肪産生刺激サプリメント (マウス)Stemcell Technologies5503
ウシ胎児血清Gibco16000
馬血清ΣH1270
コラゲナーゼ2型ワーシントンLS004176
0.25%トリプシン/ EDTA Gibco25200
ペニシリン/ストレプトマイシンGibco15140
PDLSigmaP6407
PDGFR&β;-PE 抗体eBioscience12-1402
ペリリピン抗体ΣP1998
S-ミオシン抗体DSHBMF-20
Alexa 555-anti-rabbit 抗体 サーモフィッシャーサイエンティフィックA-31572
Alexa 555-抗マウス抗体サーモフィッシャーサイエンティフィックA-31570
封入剤 DAPIベクターラボラトリーズH-1200
DAPIサーモフィッシャーサイエンティフィックD1306
HEPESGibco15630
EDTAフィッシャーBP120
BSASigmaA2058
NH4Clフィッシャー・サイエンティフィックA661
KHCO3フィッシャー・サイエンティフィックP184
PBSGibco14190
18 G ニードルBD305196
10 mL セロジカル・ピペットBD357551
OneComp eBeadseBioscience01-1111
地

参考文献

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