グローバルを測定する定量的蛍光ローカライズ翻訳

サマリー

本稿では、可視化し、細胞内コンパートメントのローカライズされた翻訳イベントを定量化する方法について説明します。本稿で提案する手法は基本的な共焦点イメージング システムと試薬が必要です、迅速かつ費用対効果。

要約

MRNA の翻訳を規定しているメカニズムは、複数の疾患だけでなく生殖細胞形成、細胞分化と器官形成などの様々 な生物学的過程に関与しています。多数の出版物は説得力のある特定のメカニズムがしっかりと mRNA の翻訳を調節する示されています。蛋白質の表現の翻訳による規制の高められた興味は調査し次のde novoタンパク質合成cellulo の新規手法の開発につながっています。ただし、これらのメソッドのほとんどは複雑で、高価なそれらを作ると、よく学ぶことができます mRNA ターゲット数の制限します。この原稿は、のみ基本的な試薬とを測定し、様々 な条件の下で任意のセルの行で発生する mRNA の翻訳の変化を可視化する共焦点蛍光イメージング システム必要とする手法を提案します。このメソッドはさまざまな生物の中に短い期間のde novo翻訳を可視化する可能性を提供しています、時間の短い期間で付着性のセルの細胞内の構造にローカライズした訳語を表示する最近使用されました。プロセスまたは特定の刺激への応答の橋渡し活動の変更を検証します。

概要

翻訳さまざまな細胞機能の調節は、新しいツールや mRNA の翻訳と規制タンパク質合成^{1,2 の細胞レベル下の局在を決定する方法を開発する多くの研究チームを求めています。、3,4}。これらの最近の技術の進歩により翻訳アップレギュレーションや神経の開発、薬剤応答、^{5 転移などの生物学的プロセスの間に特定の Mrna の抑圧のメカニズムの理解の改善 ,6,7,8}。ただし、これらのメソッドのほとんどは、高価なまたは危険な試薬およびほとんどの実験室にできない可能性があります特定の機器を必要。など、翻訳イベントの迅速な評価を可能にするコスト効果の高い方法は、具体的には、これらの潜在的な問題を回避するために開発されました。このメソッドは、特定の細胞プロセス中に発生する急性の並進変調を検出し、共焦点顕微鏡を用いた翻訳の局在化のためことができます。

ここで説明した方法は、拡散開始センター ....

プロトコル

1 です。 Puromycilation 条件の定量

注: この手法 MRC 5 セル接着プロセス ⁵ 中にローカライズされた翻訳を評価する方法について説明します。Puromycilation は、任意のセルで行うことができます、処理条件が各セルライン ピューロマイシン濃度と目的の面で同一ではないので、使用する特定のセル行の puromycilation 条件を最適化することが重要です。インキュベーション時間。ピューロマイシン濃度の異なるインキュベーション時間の増加で処理した 3 例のセル行 (すなわち、 hela 細胞、MRC-5、およびホ-7)、これらの条件を定義する方法を表示する ( 図 1).

1. 成長の適切な 0.5 mL で 24 ウェル プレート内のセルの同じ数字を培 16 h テストの前に完了します。種 30,000 MRC 5 セル、50,000 の HeLa 細胞あるいはウェルあたり 50,000 の許 7 セル。60-70% 合流点 (図 1 a) を超えないようにすることを確認します
。
2. 準備 6 ピューロマイシン (0、5、10、15、20、および 30 μ g/mL) の濃度の増加との完全な細胞培養液 1.5 ml チューブします。37 ° C であら....

結果

ピューロマイシン定款を使用して翻訳イベントを正確に観察するには、それぞれは異なるピューロマイシン定款動態 (図 1)^{9,11 を示していますので、各セルラインの最適条件を決めることが大事です。 ,12,18}。したがって、ピューロマイシン定款を検証するため、ピューロマイシン濃度の増加の標準化されたスペクトルを持つ目的のセルの行を処理すべきだ (1.0、2.5、5.0、7.5、10.0、および 15.0 μ G/ml) 時間 (5 〜 10 分) 期間が異なる。ローカライズされた翻訳または薬物治療への早期の対応を評価するために短い培養時間が優先 (例えば、 5 分未満)、ことができます特定の治療の直後並進イベントの直接の評価のため。理想的には、ピ.......

ディスカッション

最近の技術の進歩は、並進運動の発現に関与するメカニズムの理解または神経の開発、薬剤応答、転移などの生物学的プロセスの特定の Mrna の抑圧の許可しています。ここで説明したコスト効果の高い方法により、翻訳イベント RNA 結合蛋白質が細胞接着、移行、侵略などの転移プロセスを調節する方法を研究する細胞で可視化することです。

De novoタンパク質翻訳を評価するために多くの方法が開発されているはすべて検出部位が付いた変更されたアミノ酸が伸長のポリペプチドに組み込まれています、同じ戦略を共有しています。これらのメソッドの最初は、 ³⁵S, アルギニン混入新たに翻訳されたタンパク質に依存します。特定の条件下で翻訳率を比較するため効率的ですが、標識アミノ酸の使用はほとんどの研究チームに魅力のないメソッドをなります。したがって、小説の開発、夕日などの非放射性ラベルを使用してメソッドをクリックして-それは、またはトリック アプローチ評価し、生体内で翻訳イベントを観察する新たな機会を提供します。とはいえ、独創的なこれらのメソッドのほとんど.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
DMEM	wisent	319-005-CL
トリプシン	wisent	325-043 EL
FBS	サーモフィッシャーサイエンティフィック	12483020
Puroycin 抗体 12D10	EMD ミリポア	MABE343	ウェスタンブロット希釈 1:25,000 免疫蛍光希釈 1:10,000
抗マウス IgG, HRP 結合抗体	細胞シグナル伝達テクノロジー	7076	ウェスタンブロット希釈 1:8,000
ウェスタンライトニングプラス-ECL	パーキンエルマー	NEL104001EA
抗マウス IgG (H+L)、F(ab')2 フラグメント (Alexa Fluor 488 Conjugate)	細胞シグナル伝達技術	4408	免疫蛍光希釈 1:400
CF568 ファロイジン	ビオチウム	00044	免疫蛍光希釈 1:400
シクロヘキサミド	Σ	C1988-1G	50µg/ml 最終濃度
DAPI(4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール、二塩酸塩)	Invitrogen	D1306	最終濃度 1µg/ml
ピューロマイシン	バイオベーシック	PJ593	2.5µg / mlから10µg/ml
イビディ µ-ディッシュ 35 mm、高、ibiTreat	イビディ	81156
MRC-5 細胞	ATCC	CCL-171
HeLa 細胞	ATCC	CCL-2
Huh-7 マ	ズルイ博士 (UniversitéLaval)
Fv1000	オリンパス		共焦点イメージングシステム
フィジー ソフトウェア			http://fiji.sc
PBS (Phosphate BuffeRed Saline)	bio-Basic	PD8117
ホルムアルデヒド 37% 溶液	bio-Basic	C5300-1
Triton X-100	bio-Basic	TB0198
BSA	フィッシャーBioreagents	BP9702-100
Tween20	フィッシャーBioreagents	BP337-500