Method Article

マウスにおけるヒト化骨髄微小環境のバイオエンジニアリングとライブイメージングによるそれらの可視化

DOI:

10.3791/55914

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August 1st, 2017

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1Haematopoietic Stem Cell Laboratory, The Francis Crick Institute

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

マウスにおける異なるヒト化骨髄ニッチを作成し、ライブイメージする方法が提示される。ヒト間葉系細胞によって作り出された支持的ニッチに基づいて、ヒト内皮細胞の添加はヒト血管の形成を誘導するが、rhBMP-2の添加はヒト - マウスキメラ成熟骨組織の形成を誘導する。

Abstract

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ヒト造血幹細胞（HSC）は、骨髄（BM）ニッチ、サイトカイン、成長因子、および細胞外マトリックスを産生する成分の複雑な多因子ネットワークに存在する。 HSCが休止状態を維持し、自己複製または分化し、突然変異を獲得し、悪性化する能力は、異なる間質成分との複雑な相互作用に依存する。生理学的および病理学的状態におけるヒトHSCとヒトBMニッチとの間のクロストークを観察するために、我々は、免疫不全マウスにおけるヒト化BMニッチを異所的にモデル化および画像化するためのプロトコールを設計した。我々は、異なる細胞成分の使用が、ヒト化構造の形成および長期間のヒト造血生着を維持する機会を可能にすることを示す。 2光子顕微鏡を用いて、これらの構造を単一細胞の分解能でその場でライブイメージし、ヒトBM mの機能的特徴付けのための強力な新しいツールを提供することができる微小環境および正常および悪性造血の調節におけるその役割。

Introduction

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幹細胞区画で観察される細胞運命決定は、内因性因子と外因性因子の両方によって厳密に調節される。特に、BMの微小環境は、HSCの休止状態から活動状態への切り替え、ならびに自己再生または分化の運命決定1において、スイッチを制御する上で基本的な役割を果たすことが広く認識されている1 。さらに、最近の知見は、血液学的悪性腫瘍は、2つのコンパートメント2、3、4、5、6間のアクティブクロストークの存在を指し、BM微小環境の機能に影響を与えることを示しています。最近の進歩にもかかわらず、特定のBMニッチ成分の活性がHSCの行動および悪性形質転換にどのように寄与するかについての多くの重要な疑問が残っている。

BMの微小環境は高度にヘテロジェクトである多くの異なる細胞型の込み入った複雑な混合物であり、各々は特殊な機能を有する。豊富な内皮細胞（EC）および血管成分が栄養素及び代謝産物の代謝回転、BMおよび異なる細胞の出入り、及びいくつかのHSC機能7,8を調節します。間葉系間質細胞（MSC）は、未分化幹細胞の異種集団であり、3つの異なる系統（ すなわち、骨形成、軟骨形成、脂肪生成）によって遂行される前駆細胞は、BMニッチの別の基本的構成要素である。これらのMSCは、BMの中心領域および骨内領域の近傍の両方に局在する。これらは、脈管構造に関連することができ、HSC機能9、10、11、12、13の調節に関与しています「> 14、15。

多くの報告は、HSCが骨髄内の様々な所定の部位に存在し、それらの機能がそれらの正確な局在に依存し得ることを示唆している。 HSCおよびBM微小環境とのそれらの相互作用に関する現在の知識の大部分は、ネズミの研究1に由来する。異種移植片モデルを使用することは、免疫不全マウス16、17、18、19、20のマウスBM内に移植する、ヒトの正常および悪性造血幹細胞にこの知識を拡張しました。これは有効なモデルであるが、ヒトのHSCのホーミングおよび生着、または異種間の障壁および細胞 - 細胞相互作用へのその影響が十分に理解されていないことを可能にするために、機能。

中和抗体および遺伝子改変マウスを異種移植と一緒に使用することは、ヒトHSCがその微小環境と確立する複雑な対話を強調するのに役立っている。導入および生体二光子共焦点顕微鏡の開発は直接、高解像度を可能にする、ステップフォワードこれらの研究の移動、および骨髄19、20、21、22の動的画像化および機能のための強力なツールを提供していますBM微小環境の特徴付けおよびHSC機能の調節におけるその役割。古典的な異種移植モデルで生じるいくつかの問題を回避するために、ヒト化BM構造を操作する概念が前面に出されている。バイオマテリアルと細胞移植コンセプトを融合させることにより、ヒトの骨を模倣する可能性が示されている異領域23、24、25、26、27に微小環境を矢印。これは造血28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、腫瘍形成、および転移40、41、42人の正常および悪性を研究するためにマウスモデルにおいて生物工学を使用する可能性を開きます、43、44。

骨組織工学およびin vivoイメージング 19、22、45、46、47、48、49、50、51、52 における以前の経験に基づいて、我々は、器官型ヒトBM組織bioengineerと画像ライブするためのプロトコルを記述しています。これらの構造は、免疫不全マウスに皮下移植されたコラーゲンベースの足場へのヒトBM由来の間質細胞の移植に由来する。以前の報告では、ヒトMSCが、ヒト造血細胞の生着に適したヒト微小環境の形成を確実にすることを実証した45 。さらに、ここでは、他のヒトBM細胞成分の同時移植ヒト内皮細胞（hEC）および/または骨形成に重要なサイトカイン（ 例えば、 hBMP2）のようなサイトカインは、hMSCと協力してin situでライブイメージングすることができる異なるヒト化微小環境を生成する。

Protocol

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すべての動物実験は、英国内務省によって承認され、Cancer Research UKのガイドラインに従ってPPL 70/8904で実施された。ヒト臍帯血（UCB）および原発性ヒト急性骨髄性白血病（AML）サンプルの使用は、同意を得た後、イーストロンドン倫理委員会によって承認され、ヘルシンキ宣言に従って実施された。

1.ヒト造血細胞および間質細胞を有するバイオエンジニアリングコラーゲンベースの足場

注記：プロトコール全体は無菌状態で、無菌物質で実施する必要があります。細胞培養培地1は、hMSC培地（MEM-α、P / Sおよび10％hMSC-FBS）に対応する。細胞培養液2は、EC培地（M199,20％FBS、P / S、10mM HEPES、50μg/ mLヘパリン、2mMグルタミン、50μg/ mL ECGS）に相当し、細胞培養液3は造血細胞培地およびP / S）。

  1. 臍帯血を準備するフィコール-パック密度勾配を用いて細胞（CB-のMNC）または一次AML（骨髄又は末梢血のMNC）ononuclear、十分に確立されたプロトコル53に記載の方法。
    1. AMLの場合、OKT.3抗体を用いてT細胞を枯渇させる。 PBSで細胞を洗浄する前に、1×10 6 AML MNCあたり4μgのOKT.3を室温で30分間インキュベートする。必要であれば、2×10 8細胞/ mLで10％DMSOを含むFBS中のMNCを凍結保存する。
  2. hMSC（培養培地1）およびEC（培養培地2）細胞培養物を調製する。 hMSC培地中の通常の細胞培養フラスコ上のプレートhMSC細胞（ 材料の表参照）。 EC培地中のコラーゲン1被覆表面のプレートEC（ 材料の表を参照）。
  3. 85〜90％の細胞コンフルエンスで、培地を除去し、PBSで2回洗浄し、トリプシン-EDTA溶液（1cm 2あたり20μL）を加える。
    1. 5分後、細胞が分離されていることを確認する。 1：1に希釈して細胞を回収する。3を細胞培養培地で処理する。 300×gで5分間遠心分離し、各細胞型について対応する培地に再懸濁し、Neubauerチャンバーを用いて細胞を計数する。
    2. ミリリットルあたり10 7細胞- 2×10 6の細胞を使用します。両方の細胞タイプを一緒に使用する必要がある場合は、hMSCとECの懸濁液を1：1の比率で混合してください。
  4. 細胞懸濁液をインスリン注射器に移す。
  5. メスを使用して、滅菌ゼラチンスポンジ（ 例えば、ゲルフォーム）初期足場（20mm×60mm×7mm）を同様のサイズ（6.6mm×7.5mm×7mm; 図1AおよびB ）の24個に切断する。
  6. PBS（5分間）に浸漬してゼラチン足場を再構成する。
  7. 1つずつ、足場を滅菌組織に静かに置き、余分なPBSを除去する。 24ウェルプレート（超低取付面）の1つのウェルに足場を移し、10個の5を含む50μL注入するために注射器を使用し- 10 6細胞（hMSCの文献を1つまたはhECと組み合わせて; 図1C ）。
  8. すべての必要な足場に間質細胞が播種されるまで、各足場でステップ1.7を繰り返す。
  9. 細胞培養インキュベーター（37℃およびCO 2 5％）の中で1時間インキュベートする。
  10. 各ウェルを3mLの細胞培養培地1（ 図1D ）で満たし、一晩のインキュベーションのために足場を細胞培養インキュベーター（37℃およびCO 2 5％）に戻す。 ECが足場に使用されている場合は、細胞培養培地2を使用してください。
  11. CB-MNCを解凍し、適切なCD34 +セクションキットプロトコールに従ってCD34 +細胞を単離する。選択したCD34 +細胞を培地3に懸濁し、Neubauerチャンバーで計数する。
    注：ここでは、細胞はmLあたり2×10 6細胞の濃度で使用した。
    1. AML患者由来の一次試料を使用する場合、細胞を解凍し、FBS中で1:10に希釈し、300で5分間遠心分離するPBS-2％FBSに細胞を再懸濁し、抗ヒトCD3抗体（10 6細胞あたり2〜4μg）を添加し、室温で30分間インキュベートする。サイトカイン（20ng / mL顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）、20ng / mL IL-3および20ng / mLトロンボポエチン（TPO））を補充した造血細胞培地に再懸濁し、300xgで5分間遠心分離する。 。
  12. 上記のように、ステップ1.7〜1.9を繰り返すが、この場合には間質成分の代わりにヒト造血細胞1×10 5個を播種する。
    1. 3mLの細胞培養培地3（ 図1D ）でウェルを満たし、一晩のインキュベーションのために足場を細胞培養インキュベーター（37℃およびCO 2 5％）に戻す。 ECが足場に使用されている場合、細胞培養培地2と3の1：1混合物を使用する。
  13. 組換えヒト骨形成タンパク質-2（rhBMP-2）担体骨格のみについて、足場を滅菌組織上に1つずつ静かに置き、過剰のPを除去するBS。足場をU底、96 穴プレート（ 図1E ）の1つのウェルに移し、足場を完全に覆うrhBMP-25μLを加える。
    1. 20μLのトロンビン、20μLのフィブリノーゲンを添加し、毎回足場を完全に覆うようにする（ 図1F ）。すべての必要な足場が処理されるまで各足場に対して手順を繰り返し、37℃で5〜10分間インキュベートする。凝固がうまく形成されているかどうかを確認する。

生物工学的足場の外科的移植

注：ここでは、6〜12週齢のNSGマウスの雄または雌いずれかを使用した。動物は免疫不全であるので、全ての処置は無菌状態で行うべきである。ステップ2.10〜2.13は、生存戦略および術後ケアに関連する。

  1. 手術前60〜120分に、鎮痛剤（carprofen、5mg / kg体重/マウス）を皮下投与する。
  2. 0.5％のイソフルランおよび2L /分のO 2を有するチャンバー内で麻酔を誘導する。処置中にマウスを連続的にモニターすべきである。背中に容易にアクセスできるように、動物を腹臥位で手術領域に移す。 1.5％のイソフルランと2L /分のO 2を供給するノーズコーンを用いて動物を麻酔下に保つ。手術中にマウスを麻酔下に置いて、頻繁に動物の状態をチェックする。
  3. 麻酔下ではマウスの眼に眼科用ゲルを使用して乾燥を防ぎ、マウスを37℃に保ちます。
  4. 電動トリマーを使用して、マウスの後部に手術領域を剃る。皮膚を滅菌するには、希釈したクロレキシジン（PBSで1:10に希釈）に綿棒を浸し、この先端部を使用して皮膚表面をきれいにします。この手順を2回繰り返します。
  5. 滅菌鉗子とメス（またはハサミ）を使用して、皮膚の0.5〜0.7cm前後の完全な切開を行います。挿入された鉗子を使用する皮下組織の下にポケットを作る。
  6. 足場を皮下に挿入し、それがポケット内に深く配置されていることを確認します（ 図1GおよびH ）。手術用接着剤で切開部を閉鎖する（ 図1IおよびJ ）。
  7. 手術後の痛みを治療するために、ブプレノルフィン（0.1mg / kg体重）を皮下投与する。
  8. 回復中、動物をその側に予め温めたケージに入れ、正常な挙動が観察されるまで回復をモニターする。
  9. 鎮痛薬を水（carprofen、0.1 mg / mL水）で希釈し、手術後4日間飲料水として動物に与える。
  10. 48時間の術後の期間中、可能性のある副作用について動物および傷を頻繁に点検する。

3.マウストリートメント、安楽死、およびイメージングのためのサンプル検索

注：スキャフォールドの分析は、移植後8週および24週。

  1. 画像化の60分前に、移植したマウスを37℃の加熱ボックスに入れて温め、非特異的部位をブロックするために100μLのヒト免疫グロブリンを静脈内投与する。
  2. 画像化の30分前に、目的の細胞を標識するために10μg（1マウスあたり）の特異的抗体を静脈内投与する。
  3. イメージングの5分前に、血管構造を可視化するために、655nmフルオロフォア標識した血管プール剤（655-VPA）15μL（100μLのPBSで希釈）を静脈内投与する。
  4. 頚椎脱臼を介してマウスを安楽死させる。
  5. シャープハサミを使用して、元の移植部位の近くで、マウスの背中に長手方向の皮膚切開を行う。
  6. ピンセットとはさみの助けを借りて、足場が埋め込まれている皮下ポケットから皮膚を慎重に分離します。
  7. ピンセットで足場を保持し、残った膜を切断して皮膚から静かに外植片aはさみを使用して足場を取り囲む組織。 図2に回収される足場の例を参照してください。
  8. イメージングプレート（35mm×10mmペトリ皿）に速効性接着剤で足場を固定し、室温で生理食塩水（PBS）で満たします。
  9. BMP足場の場合、プレートをPBSで満たす前に、外科用マイクロドリルを使用して、顕微手術顕微鏡下で骨表面を薄くする。これにより、フルオロフォアの可視化および高解像度の画像キャプチャが可能になる。足場の大きさに応じて、1.2または1.6 mmのバリを使用してください。
    注：ユーザーは、骨の厚さに応じてドリルする量を認識します。一般に、BMP骨格が血管新生すると、骨は色がわずかに変化し、造影のための正確な厚さに近づくとより赤くなる。
  10. プレートを共焦点顕微鏡のステージに挿入する。

4. 2光子マイクロスコープを用いたライブイメージングオピー

注記：非デセンドディテクタ（NDD）を使用する場合は、必ずNDDスライダを使用して蛍光をNDDに向けるイメージングを行ってください。顕微鏡の構成を図3に示します。

  1. 顕微鏡とコンピュータの電源を入れ、 "Start System"をクリックしてソフトウェアを起動し、 "Acquisition"モードにします。
  2. [手動ツールを表示する]チェックボックスをオンにします。 「レーザー」メニューでは、2光子レーザーを「オン」にして、ウォームアップして安定させます。
  3. "Imaging Setup"メニューで、 "Channel Mode"と "Switch every frame"を同時にアクティブにします。 "Light Path"メニューで、 "Non Descanned"と "Main Beam Splitter MBS 760+"を選択します。 図4に示すように、4つのNDDを有効にして構成を設定します。
    注：この構成では、骨構造からのコラーゲンシグナル（秒SHG）は、380〜485nm、FITC-hCD31 +ヒト内皮細胞およびAF488-hCD45 +ヒト造血細胞（500〜550nm）および655-VPA（640〜690nm）に集められる。
  4. "Channels"メニューで、 "laser wavelength"を890 nmに設定し、パワーを50％に設定します。 「ゲイン（マスター）」を500〜600に、「デジタルオフセット」を0に、「デジタルゲイン」を各チャンネルごとに15に設定します。取得が開始されたら、これらの値を調整します。
  5. 「取得モード」では、組織に損傷を与えたり蛍光体を漂白したりすることなく、高解像度の画像を得るために必要なパラメータを設定します。 「スキャンモード」を「フレーム」、「フレームサイズ」を「x512 y512」、「ラインステップ」を1、「スピード」を9、「平均回数」を8、「ビット深度」を「8ビット」、 「モード」を「行」に、「方向」を「双方向」に、「方法」を「平均」に設定します。
    1. 「Zo」を設定する画像の最初のスキャンでは「om」を1に設定し、特定の領域に焦点を合わせる必要がある場合はそれを増やします。
  6. 足場を含むプレートを20X、1.0NA水浸レンズの下の顕微鏡ステージ上に置き、レンズが生理食塩水に触れるまで下げます。光源としてランプを使用して、顕微鏡の接眼レンズを使用して足場にレンズの焦点を設定します。
  7. "Zスタック"メニューをアクティブにし、 "ファースト/ラスト"機能を選択し、2つのサブシーケンシャルスライス（ 例えば、 2μmZスタック）の間に必要な間隔を設定します。間隔をZスタック内で一定に保つ。
  8. "ライブ"を選択すると、サンプルのライブスキャンをイメージし、最適な露出を得るために "デジタルゲイン"と "デジタルオフセット"を調整します。複数のチャンネルを同時に視覚化するには、「分割」機能を選択します。
  9. 「ステージ」メニューでは、「ライブ」モードで画像をスキャンし、ヒト造血細胞および脈管構造の位置などの、幹細胞移植（est）（ROI）。サンプルのスキャンが完了したら、最初のROIに移動してイメージングを開始します。
  10. 「ライブ」モードでは、「最初に設定する」および「最後に設定する」機能を使用して、関心領域を囲む3D Zスタックの上端および下端を設定します。終了したら、センター「C」を設定します。 「実験開始」ボタンを使用してROIの取得を開始します。 図4 、 図5 、および図6の画像の例を参照してください。
  11. 取得が完了したら、指定したフォルダに画像を保存します。次のROIに移動し、手順4.10を繰り返します。実験が完了したら、イメージングプレートを顕微鏡から取り出し、サンプルをプレートから慎重に取り外し、残っている糊をすべてきれいにします。
  12. 次の分析技術のためにサンプルを準備する。

サンプル処理g：組織学および免疫染色

注：サンプルは、サンプルの固定、埋め込み、およびセクショニングのプロセスを記述するJoVE一般的な実験技術54に記載されているプロトコルに従って処理されます。骨形成サンプルは、固定プロセスと埋め込みプロセスとの間でEDTAベースの脱灰剤で7日間処理しなければならない。ブロッキング/透過化溶液は、1％Triton X-100、1％ウシ血清アルブミン（BSA）、および10％正常ヤギ血清（NGS）を含む10mM PBS pH7.4緩衝液である。

  1. スライスをキシレンに10分間入れる）、キシレンで5分間、100％エタノールで5分間、70％エタノールで5分間、50％エタノールで5分間、H 2 Oで5分間。
  2. スライスをクエン酸塩ベースの抗原を作用させない溶液に移す。
  3. スライスを15分間煮沸し、室温まで冷ます。
  4. 1％Triton X-100（5分、3回）を含む10 mM PBS pH 7.4溶液でスライスを洗浄する。
  5. サムを転送するブロッキング/透過化溶液に加え、30分間インキュベートする。
  6. ブロッキング/透過化溶液で希釈した一次抗体を添加し、4℃で一晩インキュベートする。
  7. 1％Triton X-100（5分、3回）を含む10 mM PBS pH 7.4溶液でスライスを洗浄する。
  8. ブロッキング/透過化溶液で希釈した二次抗体を室温で暗所で1時間添加する。
  9. H 2 O（5分、3回）で洗浄する。
  10. バックグラウンド蛍光を減少させるために、スライスをスーダンブラック作業溶液に10分間、暗所および室温で浸漬する。
  11. スライスをH 2 O（5分、3回）で洗浄する。
  12. DAPI（0.5μg/ mL）を含む蛍光性マウント培地を用いてスライスをマウントする。
  13. スライスを4°Cで保存し、蛍光イメージングを行う前に、マウンティング培地が乾燥していることを確認します。 図7の画像例を参照してください。

Results

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図1には、足場細胞の播種および移植プロセスの代表的な画像が示されている。 図1Cにおいて、細胞は足場に直接注入されることに留意されたい。 図1Gにおいて、皮下ポケットが形成され足場が移植されたマウスの後ろに切開が形成されることに留意されたい。 図2は、NSGマウスに移植され、8週間後に回収された異なる足場の総形態を示す。 hMSC播種足場（ 図2A ）におけるわずかな血管新生に注目されたい。足場におけるヒトECのhMSCとの同時播種は、足場におけるより関連する脈管構造の形成を可能にする（ 図2B ）。最後に、rhBMP-2の存在は骨形成を誘導する。検索された足場は、この場合にはより大きく、骨に似た硬組織。

図3は、NDDによるライブイメージングのための顕微鏡上のチャネル構成の設定を示しています（図の凡例の詳細）。 図4およびビデオ1は、hMSCでコーティングされた足場のヒト造血細胞を示す。足場を、移植後8週間およびAF488-hCD45抗体および655-VPAの静脈内接種後に移植した。この手順は、2光子共焦点顕微鏡法による移植されたヒト造血細胞および血管構造の可視化を可能にする。この場合、足場中の血管（655-VPA）および骨格実質内のヒト造血細胞（AF488-hCD45）の長期間の移植が示される。 図5および図 2は、hECおよびhMSCを播種したヒト足場に対応する。手術8週間後、足場を移植後に外植したFITC-hCD31抗体と655-VPAを接種し、前述のように2光子共焦点顕微鏡で画像を取得した。画像は、足場における血管形成におけるhECの関与を示し、マウス - ヒトキメラ脈管構造をもたらす。

図6Aは、MSC足場における骨形成を刺激するために使用されるアプローチの代表的なデータを示す。先の図と同様に、移植8週間後、655-VPAの静脈内接種を行い、足場を回収し、2光子共焦点顕微鏡で画像を取得した。 rhBMP-2刺激された足場は、骨中のカルシウムによって提供されるSHG（画像中のシアン色）のために視覚化され得る骨組織の形成を誘発する。提供された画像はまた、BM内膜組織に非常に似ている腔および血管内臓内膜組織の​​形成を示す。 図6B Video 3では、hECCにhMSCを移植しました。足場は、FITC-hCD31抗体および655-VPAの静脈内接種後に回収され、二光子共焦点顕微鏡画像は、骨形成足場における血管新生におけるhECの関与を示す。

図7は、組織学の代表的な画像、前述の結果を裏付けるために実施された手順を示す。免疫蛍光画像は、骨格構造中のマウス脈管構造、hECs、hMSC、および長期間移植されたヒト造血細胞を示す。マウスから回収した足場を固定し、免疫蛍光のために使用した。 rhBMP-2キャリア骨形成足場（ 図 7D〜F ）において、脂肪組織と成熟骨髄に似ている組織の形態を記録する。この骨形成骨格において、本発明者らは、hMSCが線維芽細胞であり、tそれらは間質細胞として新たに形成された組織に寄与する。本発明者らは、hMSCもまた脂肪組織形成に寄与することを示すヒト脂肪細胞マーカー発現を示す。

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図1.細胞播種および移植プロセスの代表的な画像A）初期足場とそのメスを使用した切断方法。 B）最初の足場から得られた24個体。 C）シリンジを用いた足場細胞播種法。 D）細胞が植えられた培養培地を有する足場。 EF）骨形成足場のための特定のステップ： E）足場を96ウェル、U底プレートに移し、そしてF） rhBMP2、トロンビン、およびフィブリノーゲンを足場に加えるために使用される方法の代表的画像。 GJ） Surgi全身麻酔下でのカル・インプラント手順： G）皮膚に形成された創傷および足場移植、 H）移植法、およびIJ）外科用接着剤を用いた創傷閉鎖手順。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

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図2.マウスから回収された異なる足場。 MSC足場（左）、MSC + EC足場（中）、およびMSC + EC + BMP足場（右）の代表的な画像。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

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図3.チャネル構成。顕微鏡のフィルター設定が表示されます。 A） 4つのNDD検出器モジュールがあります。最初のモジュールには2つのフィルタキューブがあります。第2および第3のモジュールはそれぞれ1つのフィルタキューブを有する。最後のモジュールにはキューブがありません（使用されていません）。最初の光電子増倍管（PMT）は遠赤色チャネル（640〜690 nm）用で、低波長を反映しています。以下のものは、380〜485nm、500〜550nm、および555〜625nmである（その次数は常に低い方から高い方へ）。 B）蛍光体の発光は、上記の構成（色分け）で検出可能である。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

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図4. MSC足場ヒト造血細胞のためのニッチの形成を可能にする。 A）およびB）ヒト造血細胞を標識するためにAF488-hCD45（緑色）、および血管系を標識するために655-VPA（マゼンタ）mを静脈内接種後に移植片を採取したZ-スタックの3D再構成。スケールバーは、AおよびB（上部パネル）では20μm、B（下部パネル）では5μmを表す。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

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MSC足場は、ヒト造血細胞のためのニッチの形成を可能にする 。 MSC足場（コラーゲン構造：SHG、シアン）における脈管構造（655-VPA）に関連するヒト造血細胞（AF488-hCD45）の3D再構築。各スタックは140 x 140μmです。ef = "http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55914/55914video1.mov" target = "_ blank">このビデオを見るには、ここをクリックしてください。 （右クリックしてダウンロードしてください）

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図5.ヒトECはMSC足場にヒト化血管の形成に参加する。 MSC + EC足場におけるヒト起源のEC（FITC-hCD31）によって裏打ちされた脈管構造（655-VPA）の3D再構成。スケールバーは20μmを表す。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

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ビデオ2.ヒトECはMSC足場にヒト化血管の形成に参加する。ヒトECの3D再構成（FITC-hCD31） （655-VPA）をMSC + EC足場に含む。各スタックは240×240μmと測定されます。 このビデオを見るにはここをクリックしてください。 （右クリックしてダウンロードしてください）

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図6. rhBMP-2キャリア足場は、骨髄と類似のヒト化脈管構造を有する。 A）骨構造（SHGシアン）および脈管構造（655-VPA）の形成を示すMSC + BMP足場の3D再構築。スケールバーは、100μm（左）、70μm（中）、および50μm（右）を表す。 B）ヒトEC（FITC-hCD31）で裏打ちされたヒト化血管（655-VPA）を示すMSC + EC + BMP足場の3D再構成。スケールバーは50μm（左）および30μm（中央および右）を表す。14 / 55914fig6large.jpg "target =" _ blank ">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

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Video 3. rhBMP-2 Carrier Scaffoldsは、骨髄と同様の骨表面とヒト化脈管構造を持っています。 MSC + VERA + BMP足場（骨：SHG;血管：655-VPA;ヒトEC：FITC-hCD31）の3D再構築。各スタックは600×600μmを測定します。 このビデオを見るにはここをクリックしてください。 （右クリックしてダウンロードしてください）

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図7.固定足場上で実施された免疫蛍光の代表的な画像。 AF）移植されたヒト細胞の位置を特定するために行った免疫蛍光研究n足場。 AC） hECs、hMSCs、およびhHSCsを移植した足場。 DF） hECs、hMSCs、およびhHSCsを移植した骨形成足場。 AD）をBE）のhMSC（hVimentin、hVIM）およびマウス血管細胞（エンドムチン、ENDOM）、C）ヒト造血細胞（hCD45）、ヒトEC（hCD31）、マウスの血管構造（エンドムチン、ENDOM）：次のようにカラーチャネルであります（endomucin、ENDOM）、およびF）ヒト脂肪分化関連タンパク質（hADRP）およびマウス血管系（endomucin、ENDOM）を含むが、これらに限定されない。スケールバーは、10μm（AおよびC）、20μm（BおよびE）、および40（DおよびF）μmを表す。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

既存の方法に対する意義：

このプロトコールでは、我々は、マウスにおいて異なるヒト化微小環境を生成し、2光子顕微鏡法および組織学を介してそれらの構造を可視化する方法を記載した。提示された代表的なデータは、ヒト化組織を操作するために異なるストローマ細胞を用いて、アプローチの実行可能性を示す。プロトコールは、正常および病理学的状態におけるヒト造血細胞および骨髄ニッチ由来細胞の研究に対する特定の適用を有する。これらのアプリケーションには、ヒトHSCと間質成分との間のクローン進化、薬物スクリーニング、およびクロストークの研究が含まれる。組織工学の新興分野では、いくつかの代替アプローチが提案されている。ノートのアプローチは、 試験管 55、56、57 に 3DヒトBM構造の開発、S = "外部参照"> 58、59、60、61、62、63及びマウス64でヒトBM足場の同所性移植片。我々のアプローチは、 インビボシステムの複雑さとヒト化組織移植片の容易な解剖学的アクセス可能性とを組み合わせるという利点を有する。

変更とトラブルシューティング：

このプロトコールにおける可変性の源は、足場を播種するために使用される細胞の選択において見出すことができる。我々の研究では、BM由来のhMSCを使用した。しかしながら、いくつかの組織から間葉系細​​胞を得ることができ、起源に応じて特徴的な特性を示すことがある。したがって、異なる器官由来のhMSCの使用が考えられる。しかし、 インビボで骨組織を形成するそれらの能力は、このpで使用する前に試験しなければならないこのプロトコルは、市販のヒト内皮細胞供給源（ すなわち、 E4ORF1形質導入HUVEC）を使用する。最近、異なる目的のために器官特異的内皮細胞の使用は、65、66に報告されています。さらに、BM由来の一次hECsの使用は、プロトコルに対する興味深い改善を示し得る。したがって、内皮細胞の異なる供給源の使用は、異なるインビボ結果を生じ得る 。

我々は、ヒト化骨格の移植を促進し、組織拒絶反応を回避するためにNSG免疫無防備状態のレシピエントマウスを使用した。我々は、他のマウス系統の異所性骨髄組織を操作するためにこのプロトコルを使用する可能性を排除するものではない。確かに、のrhBMP-2は、異なる哺乳動物モデルにおける骨形成47、48、49、50を誘導することができます、 52 。しかし、異なる株/モデルを用いて、細胞生存率および長期移植の差異が観察される可能性がある。

足場回復のタイミングは、実験の最終目的に応じて柔軟にすることもできる。本プロトコールでは、長期造血生着を評価するために、移植後8〜12週間でサンプルを回収する。ヒトBMニッチ形成（ 例えば、骨軟骨組織形成47または血管発達）の初期段階を研究するために、異なる時点を選択することができる。

このプロトコールで説明したライブイメージング技術は、外植片の短期間のイメージングのために示されている。生理学的温度、酸素張力、およびCO 2濃度を維持するための平衡チャンバーの使用は、運動性挙動を研究するような長期撮像の場合に考慮されるべきである。

クリティカル・セントプロトコル内のeps：

議定書に関連する課題の中で、いくつかのステップで必要とされる技術的スキルを強調する。間充織細胞および内皮細胞は、低細胞継代数で使用すべきである。さもなければ、 インビボでのヒト造血細胞生着を支持することができず、またはインビボでの 新生血管系および骨形成に関与することができない。足場の準備と細胞播種の手順は、基本的な細胞培養技術と手順に使用される特定の細胞の特性の知識を必要とします。手術プロトコールはかなり単純ですが、いくつかの練習が必要です。免疫不全マウスにおける移植骨格の汚染を避けるための無菌環境の維持は、実験の成功を確実にするために重要である。外植片および生存画像の例は、外科手術（特にマイクロドリルの使用のため）および顕微鏡システム。最後に、サンプル処理および組織学は、使用される技術の基礎知識を必要とする。

技術の限界：

本発明者らが記述するアプローチは、ヒト骨髄微小環境を播種する生きたヒト造血細胞の視覚化を可能にし、ヒト骨髄微小環境を形成し、ヒト骨髄/骨髄腔を形成する血管構造および間葉細胞を形成する。組織がインビボで形成されるので、最終的に改変された足場は依然としてキメラ（ヒトおよびネズミ）である。この問題は、キメラ組織がヒトの骨髄の複雑さおよび環境を完全に模倣しないことがあるため、考慮されるべきである。

移植された足場のサイズは限られており（最大6.6×7.5×7mm）、異種移植のために限られた数の細胞を宿主にすることができる。回収される細胞の絶対数も制限される。したがって、移植された足場の数は、実験に必要な細胞数の関数として計算することができる。

本発明者らが記述したイメージング用途は、構造を破壊し細胞を損傷することなく、表面から150〜200μmの深さの生きた組織の広い領域を観察するのに特に有用である。したがって、足場全体の視覚化は不可能である。組織の完全なスキャンが必要な場合、標準的な免疫蛍光法がより適切であろう。

将来のアプリケーション：

この生物工学的モデルの将来の方向性は、組織内のヒト成分の複雑さを増大させることであろう。人間BMニッチの知識および特性は、近年では67を進行している、と記載されているプロトコルは、これらの新しい細胞成分および可溶性因子の機能だけでなく、正常な/悪性を支援する役割を研究する面白いプラットフォームになる可能性アリHSC。

さらに、造影技術は、手術後の回復を伴って、生存麻酔したマウスの足場を造影する技術的改善を必要とする縦断研究における足場の生体内イメージングの可能性を提供する。このアプローチはさらなるステップを必要とし、現在研究室で検討中である。

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者は何も開示することはない。

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

彼らの貴重な助けを借りて、Francis Crick Institute（生物学的研究施設、生体内イメージングおよび実験組織病理）の中心施設およびYolanda Saavedra-TorresおよびMercedes Sanchez-Garzon（CrickおよびLRIの獣医）のスタッフに感謝します。 W.グレイ博士に原稿を批評的に読んだことに感謝します。 DPはEHAの非臨床研究フェローシップによって支持された。この研究は、Cancer Research UK（FC001045）、英国医学研究評議会（FC001045）、およびウェルカムトラスト（FC001045）からの中核資金を受けているFrancis Crick Instituteの支援を受けました。

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Ficoll-PaqueGe Healthcare17-1440-03
Cd34ポジティブセレクションキットStemcell18056ストアA 4°C.
MagnetStemcell18000
Anti-human CD3 anti-human CD3 anti-human CD3 anti-human CD3 anti-human CD3anti-human CD3 anti-human CD3 anti-humanBE0001-24°Cで保存 一次AMLサンプルのT細胞の枯渇に使用。 
サイトカイン(IL3、G-CSF、TPO)PeproTech200-03、300-23、300-18ストックを行うため:サイトカインをそれぞれ100 μLの水とそれらを混ぜます。200 μ を加算します。L、45 μLと-20°Cで保存します。
DMSOSigmaD4540
FBSLifeテクノロジー1027010656°Cで熱不活性化。Cを30分間、アリコートを行い、凍結します。37°Cで暖かい。使用前のCウォーターバス。
MEM-αInvitrogen32571-0284°Cで保存 37°Cで温めます。使用前のCウォーターバス。
Myelocult H5100corning51004°Cで保管。使用前のCウォーターバス。
199Gibco41150-0204 °Cで保管 37 °C で暖かい。使用前のCウォーターバス。
hMSC-FBS、熱不活性化Gibco12662-029-20°Cで保管。使用前のCウォーターバス。
P /S Sigma-AldrichP0781-20 ° C. 37 °Cで暖かい。使用前のCウォーターバス。
ECGSMillipore02-102培地で希釈し、0.22mmフィルターを使用します。
HEPESSigma-AldrichS1558-50ML4°Cで保存
ヘパリンSigma-AldrichH31494°Cで保存
グルタミンGibco25030-20°Cで保存
コラーゲン1コーティング細胞培養プレートコーニング354505
トリプシン-EDTA溶液サーモフィッシャー25200056-20°Cで保存します。使用前のCウォーターバス。
hMSCLonzaPT-2501あるいは、ドスケ博士(パリ・ディドロ大学、パリ)から提供したhMSCは、IRB00006477. 
VeraVec HUVEC内皮細胞血管分泌バイオサイエンスhVera101あるいは、他のヒト内皮細胞源を使用してもよい。
ヒト造血細胞臍帯血または原発性急性骨髄性白血病(AML)サンプルは、インフォームドコンセントと使用プロトコルがイーストロンドン倫理委員会によって承認され、ヘルシンキ宣言に従って実施された後、ロイヤルロンドン病院(英国ロンドン)から取得されました。
Gelfoam、サイズ12 - 7mmファイザー00009-0315-08代替サプライヤー:Febelco
PBSThermo-Fisher10010023
外科用材料複数の滅菌鉗子、ピンセット、鋭利なハサミ。
滅菌ティッシュ紙ティッシュを加熱滅菌します。
25GTerumoSS+01H25161
超低接着 複数のウェルプレートCorning3473 または 3471
BMP2NoricumrhBMP-2酢酸 50 mM で 5 mg/mL で希釈し、4 °C で保存します。
トロンビンシグマT8885CaCl2 2%で希釈し、バイアルあたり500mLで希釈し、4°Cで保存します。
フィブリノーゲンSigmaF3879、PBSで4 mg / 100 mLで希釈します。.-20°Cで保管してください。温めてから使用してください。
組織培養皿 35 mm x 10 mmFalcon353001
U-Botton 96 ウェルプレートFalcon353077
NSG マウスジャクソン研究所5557NSG マウスは、レナード・シュルツ博士 (ジャクソン研究所) からの親切な贈り物でした。
クロルヘキシジンG9前に1:10希釈
カルプロフェンファイザーリマジル5 mg/kg のマウス
ブプレノルフィンアルストー獣医学0.1 mg/kg のマウス体重
イソフルランアボットB506麻酔の導入 2%、メンテナンス 1%
トリマーウェラコンチュラ HS61
外科用接着剤3MVetbond
カルボマー(ポリアクリル酸)NovartisViscotears Liquid Gel
Human Normal ImmunoglobulinGammaplex10g vial100 mL/mouse intravenously, 30 min before infusion of specific antibody.
NT-QTrackerInvitrogenQ21021MP血管プーリング剤。イメージングの5分前に15 mL /マウスを静脈内投与します。.
AF488-hCD45Biolegend304017100 mL/マウスを、イメージングの30分前に静脈内投与します。
FITC-hCD31BD Pharmigen555445100 mL/マウスを、イメージングの 30 分前に静脈内
瞬間接着剤ロックタイト瞬間接着剤
マイクロドリルキットIDEAL - Fisher ScientificNC9010016
Microsurgical microscope特定のブランド/会社についてはアドバイスされていません。
LSM 710 NLOZeiss直立共焦点顕微鏡は、電動ステージ、2光子レーザー、20X 1.0 NA水浸レンズを備えています。あるいは、同様の仕様の顕微鏡を使用することもできます。
まいたい "ハイパフォーマンス"全自動 1-box 517 モードロック Ti:Sapphire レーザー with DeepSee dispersion compensationSpectra-Physics
Formalin solution, neutral buffered, 10% Sigma-AldrichHT501128
エタノールSigma-Aldrich32294
OsteosoftMillipore1.01728.1000
ポリサインスライスThermo scientificJ2800AMNZ
抗原のマスキング解除溶液ベクターH-33004°Cで保存 H2Oで1:100を希釈して作業溶液にします。
Triton 100xSigma-AldrichT9284
ウシ血清アルブミン (BSA)Sigma-AldrichA964704°Cで保存
通常のヤギ血清(NGS)Sigma-AldrichG90234°Cで保存します。
Endomucin 抗体Santa Cruzsc-654954°C で保存
hビメンチン抗体サンタクルーズsc-62604°Cで保存。
hCD31DAKOM08234°Cで保存
hCD45DAKOM07014°Cで保存
ADRP(ペリリピン2)抗体-オンラインABIN2839184°Cで保存します。
ヤギ抗マウス二次抗体InvitrogenA11029 または A11005°C で保存します。
ヤギ抗ウサギ二次抗体InvitrogenA11037 または A11008°C で保存します。
ヤギ抗ラット二次抗体InvitrogenA11007 または A21247°C で保存します。
スーダンブラックシグマS2380タノール70%で1%スーダンブラックのストックを準備します。エタノール70%に0.1%スーダンブラックの作業溶液を準備し、使用前に濾紙を使用してろ過します。
DAPIシグマD8417H20に100mg/mgのストックを準備し、4°Cで保存します。
蛍光封入剤DakoS3023使用前にDAPIを追加してください(DAPIストックから1:400)。
カバーガラスVWR631-0147
CD3 anti-human CD3 anti-human CD3 anti-human CD3 anti-human CDbody, clone OKT-3 Bioxcell の針付き 1 mL シリンジ は使用眼科用ゲルとしての投与します。は抗体 抗体 4 4 4エ

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