ここでは、ヒト細胞におけるモロニーマウス白血病ウイルスベースのレトロウイルスベクターの組み込み部位のゲノムワイドマッピングのためのプロトコールについて記載する。
ここでは、ヒト細胞におけるモロニーマウス白血病ウイルスベースのレトロウイルスベクターの組み込み部位のゲノムワイドマッピングのためのプロトコールについて記載する。
モロニーマウス白血病（MLV）ウイルスベースのレトロウイルスベクターは、主にアセチル化エンハンサーおよびプロモーターに組み込まれる。この理由から、mLV組込み部位は、活性調節エレメントの機能的マーカーとして使用することができる。ここでは、細胞特異的エンハンサーおよびプロモーターのゲノムワイドな同定を可能にするレトロウイルススキャニングツールを紹介します。簡潔には、標的細胞集団をmLV由来ベクターで形質導入し、ゲノムDNAを頻繁に切断する制限酵素で消化する。適合するDNAリンカーでゲノム断片をライゲーションした後、リンカー媒介ポリメラーゼ連鎖反応（LM-PCR）により、ウィルス - ホストゲノム接合の増幅が可能になる。アンプリコンの大規模な配列決定は、全ゲノムのmLVインテグレーションプロファイルを定義するために使用されます。最後に、細胞型特異的転写プログラムの活性化に関与する細胞特異的調節領域を同定するために、反復インテグレーションのクラスターを定義する。
例えば、体細胞幹細胞）の遡及的同定のための道具技術を表す。
細胞同一性は、特定の遺伝子セットの発現によって決定される。プロモーターおよびエンハンサーのようなシス調節要素の役割は、細胞型特異的転写プログラムの活性化にとって重要である。これらの調節領域は、特異的ヒストン修飾、転写因子および補因子結合、およびクロマチン接近可能性などの特定のクロマチン特徴によって特徴づけられ、いくつかの細胞タイプ1,2,3 においてそのゲノムワイド同定に広く使用されている。特に、ヒストンH3リジン27（H3K27ac）のアセチル化のゲノムワイドプロファイルは、一般に、活性プロモーター、エンハンサーおよびスーパーエンハンサー4,5,6を定義するために使用される。
モロニーマウス白血病ウイルス（MLV）は、遺伝子に広く使用されているガンマ - レトロウイルスである哺乳動物細胞での転移。標的細胞を感染させた後、レトロウイルスRNAゲノムは、ウイルスおよび細胞タンパク質に結合して、前組み込み複合体（PIC）を構築する二本鎖DNA分子に逆転写される。 PICは核に入り、宿主細胞のクロマチンに結合する。ここで、重要なPIC成分であるウィルスインテグラーゼは、プロウイルスDNAの宿主細胞ゲノムへの組み込みを媒介する。ゲノムDNAにおけるmLVの組込みは、ランダムではなく、細胞特異的様式で、プロモーターおよびエンハンサーのような活性なシス調節エレメントにおいて起こる（7,8,9,10）。この特有の組込みプ....
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
1.ヒト細胞のMLV形質導入
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
レトロウイルススキャニング手順のワークフロー
レトロウイルススキャニング手順のワークフローは図1に図式化されています。標的細胞集団を精製し、eGFPレポーター遺伝子を発現するmLV由来のレトロウイルスベクターで形質導入する。導入遺伝子には、2つの同一の長い末端反復（5 'および3'LTR）が隣接し、ウイルスゲノムの合成、逆転写および宿主DNAへの組み込みを確実にする。形質導入効率は、eGFP発現のFACS分析によって評価される。高比率（> 30％）のmLV形質導入細胞を含む細胞集団を増幅し、続いて溶解して、mLVウイルスカセットを含むゲノムDNAを抽出する。ゲノムDNAを消化し、互換性のあるリンカーで連結し、ウイルス3'LTRと宿主ゲノムとの間の接合部をLM-PCRにより増幅する。ヴィルその後、我々の宿主ゲノム接.......
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
ここでは、クロマチン領域を標的とするレトロウイルスであるmLVの組込み部位のゲノムワイドマッピングのためのプロトコールについて記載し、活性化プロモーターおよびエンハンサーとしてエピジェネティックにマークした。プロトコルの重要なステップおよび/または限界には、（i）標的細胞集団のmLV形質導入; （ii）LM-PCRによるウイルス - 宿主接合部の増幅; （iii）集積部位の高い割合の回収。 mLVベースのレトロウイルスベクターは分裂細胞に効率的に形質導入する。分裂していない細胞（例えば、有糸分裂後の神経細胞）の形質導入効率が低いことは、この技術の潜在的な限界である。しかし、それは、レポーター遺伝子（ 例えば、 eGFP）の発現に基づいて、形質導入された集団の細胞選別によって克服することができる。 LM-PCR（150〜500bp）による比較的短いアンプリコンの生成は、現在使用されている大規模な配列決定戦略に適合するアンプリコンのライブラリーを作製し、mLV組込み部位の全般的分析。一例として、> 500 bpのLM-PCR産物の増幅は、部分的ゲノムDNA消化またはTru9I消化ゲノム断片のライゲーション（LM-PC.......
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
著者は何も開示することはない。
この研究は、イタリア教育省、大学および研究省（FIRB-Futuro in Ricerca 2010-RBFR10OS4G、FIRB-Futuro in Ricerca 2012-RBFR126B8I_003）の欧州研究評議会（ERC-2010-AdG、GT-SKIN） 、EPIGEN Epigenomics Flagship Project）、イタリア保健省（若手研究者は2011年GR-2011-02352026）、Imagine Institute Foundation（フランス、パリ）があります。
....アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| PBS、pH 7.4 | ThermoScientific | 10010031 | または同等の |
| ウシ胎児血清 | ThermoScientific | 16000044 | または同等の |
| 0.2 mlチューブ | 1.5 | ||
| mlチューブ | QIAGEN | ||
| QIAmp DNAミニキット | QIAGEN | 51306 | または同等の |
| T4 DNAリガーゼ | ニューイングランドバイオラボ | M0202T | |
| T4DNAリガーゼ反応バッファーニュー | イングランドバイオラボ | M0202T | |
| リンカープラスストランドオリゴヌクレオチド | 一般ラボサプライヤー5 | '-PO4-TAGTCCCTTAAGCGGAG-3' (精製グレード:SDS-PAGE) | |
| リンカーマイナスストランドオリゴヌクレオチド | 一般ラボサプライヤー5 | '-GTAATACGACTCACTATAGGGCTCCGCTTAAGGGAC-3'(精製グレード:SDS-PAGE) | |
| Tru9I | ロシュ・シグマ・アルドリッチ | 11464825001 | |
| SuRE/カットバッファー M | ロシュ・シグマ・アルドリッチ | 11417983001 | |
| PstI | Roche-Sigma-Aldrich | 10798991001 | |
| SuRE/Cut Buffer H | Roche-Sigma-Aldrich | 11417991001 | |
| Platinum Taq DNA Polimerase High Fidelity | Invitrogen | 11304011 | |
| 10 mM dNTP Mix | Invitrogen | 18427013 | または同等の |
| PCR グレードの水 | 一般ラボ サプライヤー | ||
| 96 ウェル サーマル サイクラー (加熱蓋付き) | 一般ラボ サプライヤー | ||
| リンカー プライマー | 一般ラボ サプライヤー | 5'-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3'(精製グレード:PCRグレード) | |
| MLV-3'LTRプライマー | ジェネラルラボサプライヤー5 | '-GACTTGTGGTCTCTCCTGTTCCTTGG-3'(精製グレード:PCRグレード) | |
| リンカー ネストプライマー 454 | 一般ラボサプライヤー | 5'-GCCTTGCCAGCCCGCTCAG[AGGGCTCCGCTTAAGGGAC](精製グレード:SDS-PAGE) | |
| MLV-3'LTRネストプライマー454 | 一般ラボサプライヤー5 | '-GCCTCCCTCGCGCCATCAGTAGC[GGTCTCCTCTGAGTGATTGACTACC](精製グレード:SDS-PAGE) | |
| リンカーネストプライマーイルミナ | 一般ラボサプライヤー5 | '-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG-[AGGGCTCCGCTTAAGGGAC](精製グレード:SDS-PAGE) | |
| MLV-3'LTR ネストプライマー Illumina | 一般ラボサプライヤー | 5'-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG-[GGTCTCCTCTGAGTGATTGACTACC](精製グレード:SDS-PAGE) | |
| 酢酸ナトリウム溶液 (3M) pH 5.2 | 一般ラボサプライヤー | ||
| 分子生物学用エタノール(絶対) | Sigma-Aldrich | E7023 | または同等の |
| Topo TA クローニングキット (pCR2.1-TOPO ベクター付き) | Invitrogen | K4500-01 | |
| QIAquickゲル抽出キット | QIAGEN | 28704 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | または同等の |
| 臭化エチジウム | Sigma-Aldrich | E1510 | または同等の |
| 100 bp DNA ラダー | Invitrogen | 15628019 | または同等の |
| 6x ローディングバッファー | ThermoScientific | R0611 | または同等の |
| NanoDrop 2000 UV-Vis 分光光度計 | ThermoScientific | ND-2000 | |
| Nextera XT インデックスキット | Illumina | FC-131-1001 または FC-131-1002 | |
| 2x KAPA HiFiホットスタートレディミックス | KAPA Biosystems | KK2601 | |
| Dynal 磁気スタンド 2 ml チューブ用 | Invitrogen | 12321D | または同等品 |
| Agencourt AMPure XP 60 ml キット | Beckman Coulter Genomics | A63881 | |
| Tris-HCl 10 mM, pH 8.5 | 一般ラボサプライヤー | ||
| Agilent 2200 TapeStation システム | Agilent Technologies | G2964AA | または同等品 |
| D1000 ScreenTape | Agilent Technologies | 5067-5582 | または同等の |
| D1000 試薬 | Agilent Technologies | 5067-5583 | または同等の |
| KAPA ライブラリ Illumina プラットフォーム用 定量キット (ABI Prism) | KAPA Biosystems | KK4835 | |
| ABI Prism 7900HT 高速リアルタイム PCR システム | Applied Biosystems | 4329003 | |
| NaOH 1.0 N, 分子生物学グレードの | 一般ラボサプライヤーHT1 | ||
| (ハイブリダイゼーションバッファー) | Illumina | MiSeq Reagent Kit | |
| MiSeq Reagent Kit v3 (150 cycles) | イルミナ | MS-102-3001 | |
| ミセクシステム | イルミナ | SY-410-1003 | |
| PhiX Control v3 | イルミナ | FC-110-3001 |
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
このJoVE記事のテキストまたは図の再利用許可をリクエスト
許可をリクエスト