脳虚血に対する酸性ポストコンディショニングの神経保護を研究するための実験モデル

サマリー

酸性ポストコンディショニングは、脳虚血を防ぐ。ここでは、APCを実行する2つのモデルを示します。それらはインビトロで酸素 - グルコース欠乏後に皮質層スライスを酸性緩衝液に移し、インビボで中大脳動脈閉塞後に20％CO _2を吸入することによってそれぞれ達成される 。

要約

脳卒中は限られた治療法を用いて世界中の死亡および障害の主要な原因の1つです。神経保護のための内因性戦略として、事後コンディショニング治療は、脳虚血に対する有望な治療法であることが証明されている。しかしながら、複雑な処置および潜在的な安全性の問題は、それらの臨床適用を制限する。これらの欠点を克服するために、我々は、実験的局所脳虚血の治療法として、酸性後条件付け（APC）を開発した。 APCは、虚血後の再灌流中にCO _2を吸入することによる軽度のアシドーシス治療を指す。ここでは、APC をインビトロおよびインビボで実行するための2つのモデルをそれぞれ示します。マウスの酸素グルコース欠乏（OGD）処置およびマウスの皮質層の閉塞および中大脳動脈閉塞（MCAO）を用いて、脳虚血を模倣した。 APCは、脳スライスを20％CO ₂で泡立てた酸性緩衝液に移すことによって簡単に達成することができる20％CO _2をマウスに吸入させる。組織生存率および脳梗塞容積に反映されるように、APCは脳虚血に対して有意な保護効果を示した。

概要

脳卒中は世界中の死亡および障害の主要な原因の1つです。過去数十年間に脳卒中の有効な治療法を見出すために大きな努力がなされてきたが、達成は非常に不十分である。ポストコンディショニングは、虚血性エピソードに続く亜毒性ストレスによって操作されるプロセスである。ポストコンディショニングは、虚血、低酸素、低血糖およびリモート虚血ポストコンディショニングを含め、内因性の適応メカニズムをトリガーし、脳虚血^{1、2、3、4}に対する治療を有望であることが証明されてきました。しかし、虚血後事後調整は、さらなる損傷を導入する可能性がある。同側または両側後肢^5、6、7日に20分間閉塞および再灌流-通常5の数サイクルを必要とするリモート虚血ポストコンディショニングを四肢。 Thそのため、これらの事後条件付け操作は臨床的に危険であり実用的ではありません。これらの欠点を克服するために、我々はマウスにおける局所脳虚血の治療薬としてAPCを開発した⁸ 。単に20％CO _2を吸入することによって誘発されるAPCは、虚血性脳損傷をより現実的かつより安全な方法で有意に低減する。最近、我々は、APCが再灌流ウインドウを拡張し、脳卒中治療⁹に対するAPCの意義を強調していることを証明した。

ここでは、脳虚血に対するAPCの神経保護を研究するための2つの実験モデルを提示する。最初のものは、マウスの皮質層スライスの酸素 - グルコース欠乏（OGD）モデルである。人工脳脊髄液（ASCF）のような人工環境への脳スライスの迅速な調製および伝達は、細胞生存能力およびニューロン回路を維持することができ、インビトロで脳機能を研究することを可能にする¹⁰ <¹¹ 。 ASCF模倣におけるOGD脳虚血及び虚血性傷害^{12、13、14を}誘導します。 OGDの後、脳スライスを通常のASCF（r-ASCF）で再灌流して再灌流を行い、次いで20％CO _2で泡立てた酸性ASCFを用いてAPCで処置する。皮質層スライスは、初代培養細胞と比較して無傷の組織学的特徴付けを維持する。

インビボで脳機能を研究するために、マウス中大脳動脈閉塞（MCAO）モデルを使用する。中大脳動脈は、総頸動脈を介して火炎平滑モノフィラメントを挿入することによって閉塞される。最も広く使用される脳卒中モデルの1つとして、MCAOモデルは臨床的関連性を示し、モノフィラメントの適用は再灌流をより容易に達成する。再灌流開始後に20％CO ₂を含む酸素正常混合ガスを吸入するだけでAPCは、脳梗塞容積の減少によって示される脳虚血に対して有意な保護効果を示した。

プロトコル

すべての実験は、浙江大学動物実験委員会の倫理指針に従って承認され、実施され、実験動物の管理と使用のための国立衛生研究所ガイドラインに完全に準拠していた。痛みや不快感を最小限に抑えるための努力がなされ、最低限の動物数が使用された。

コルチコステリアスライスのOGD

1. ソリューションの準備：
   1. 準備した1000mLのR-ACSF（124ミリモル/ LのNaCl、5ミリモル/ LのKCl、1.25ミリモル/ L KH ₂ PO _4、2ミリモル/ LのMgSO _4、26ミリモル/ LのNaHCO _3、2モル/ LのCaCl _2、グルコース10mmol / L、最終pH7.4）。実験を通して、5％CO ₂および95％O _2を有するバブル。
   2. 5％CO ₂と95％N ₂でバブリングしたグルコースを除いて、上記のようにグルコースを含まない200mlのACSF（gf-ACSF）を調製する。 brに適用する前に30分間ガスをバブリングする溶液中の酸素含有量を減少させる。 OGD手順が終了するまでバブリングを続ける。
   3. 20％CO ₂および80％O _2を含む 200mL r-ACSFを平衡化することによって酸性ACSF（a-ACSF）を調製する。脳のスライスに適用する前に30分間ガスを泡立てて、溶液のpHをpH6.8に下げ、APC手順が終了するまでバブリングを続ける。
   4. 3つの組織ホルダーをそれぞれr-ACSF、gf-ACSF、a-ACSFに入れる。
2. 脳スライス調製：
   注：8週齢のオスC57Bl / 6Jマウスをこの研究で使用した。動物を制御された温度（22±2℃）で12時間の明暗サイクル期間およびペレット状の食物および水に接近させて収容した。
   1. 誘導チャンバー内でイソフルラン過剰用量でマウスを犠牲にする。マウスを断つ。小さなはさみと鉗子を使って脳を解剖する。薄いスパチュラで脳を取り出し、注意深くガラスビーカーに落とす5％CO ₂および95％O _2で平衡化した氷冷r-ACSFを補充した。
      注：これらの手順は、できるだけ迅速かつ細心の注意を払って行う必要があります。
   2. 氷冷r-ACSF中に脳を5分間保持する。脳の動きを避けるためにガス圧を調整します。
   3. 2つのストリップでビブラトームプレートに寒冷沈降糊を置きます。脳を支えるために刃から離れて接着ストリップの上に3％アガロースの片を入れてください。
   4. 氷上で10cmのペトリ皿を逆さまにして、ろ紙にろ紙をのせます。氷冷したr-ACSFを滴下して濾紙を湿らせます。
   5. 鉗子で脳を濾紙に移す。前頭と小脳を刃と鉗子で切断する。
      注：横断面は可能な限り滑らかで、矢状面に垂直でなければなりません。
   6. 残りの脳組織を垂直に接着剤の他のストリップ上に置き、脳をアガロースに対して傾けたままにしておきます。切断用リザーバーに氷冷r-ACSFを加えて脳を水没させ、氷を氷ホルダーに加える。リザーバー内のr-ACSFを5％CO ₂と95％O _2でバブリングしたままにしておきます。
   7. リザーバーを上げ、カミソリの位置を調節して、できるだけ脳の近くに、そして脳のすぐ上にカミソリを置きます。
   8. 脳の切片を連続的にスライスするには、「連続」モードを選択します。切断厚さを400μm、振動周波数を6〜8、速度を3〜4に設定します。「開始/停止」ボタンを押して自動切断を開始します。
   9. 3mLのパスツールピペットの先端を切り、脳スライスの大きさに合った開口部を作ります。
      注：開口部は、脳スライスへのさらなる損傷を回避するのに十分な大きさでなければなりません。
   10. tip-cutPasteurピペットで5つの脳スライスを1つずつ引き出し、5％CO ₂および95％O _2で泡立てた氷冷r-ACSF中に組織ホルダーに入れる。作成された最初のスライスを収集しないでください。ガス圧力を調整する脳スライスの動き。
       注：脳スライスはお互いに覆われてはいけません。
   11. 脳スライスをr-ACSFと共に室温で30分間、次いで水浴中で37℃でさらに10分間置いてシナプス機能を回復させる。
3. OGDとAPC：
   1. gf-ACSFとa-ACSFを37℃の水浴中に置き、上記の1.1.2と1.1.3の対応するガスでバッファーを30分間バブリングする。
   2. コントロールとしてr-ACSFに1つのスライスを残す。他の4つの脳スライスを、予熱したgf-ACSFを慎重に組織ホルダーに移し、15分間インキュベートする。 r-ACSFの組織ホルダーにスライスを戻して再灌流を達成する。
   3. APCの時間枠を調べるには、gf-ACSFからa-ACSFに直接1つのスライスを転送します。他の3つのスライスを最初にr-ACSFに移し、その後再灌流の5分後および15分後にACSFで2つを組織ホルダーに移す。
   4. Incubata-ACSF内の2つのスライスを3分間抽出し、r-ACSFに戻します。 r-ACSF中の3つのスライスをさらに1時間インキュベートする。 r-ACSFの残りのスライスをOGDグループとして設定します。
   5. 用量応答試験のために、OGD後最初にr-ACSF中の4つの切片を組織ホルダーに移し、5分間インキュベートする。次に、1つのスライスをOGDグループとしてr-ACSFに残し、他の3つのスライスをa-ACSFに転送します。 a-ACSFのスライスをそれぞれ1分、3分および5分インキュベートし、それらをr-ACSFに戻す。 r-ACSF中の3つのスライスをさらに1時間インキュベートする。
4. スライス生存度判定：
   1. 2,3,5-トリフェニルテトラゾリウム塩酸塩（TTC）0.25％生理食塩水を0.25％調製する。 500mLの生理食塩水に1.25gのTTC粉末を加える。
      注：粉末が完全に溶解した後、溶液を24穴プレート（1ウェルあたり500μL）に移し、4℃で保存します。 TTCおよびTTCで染色された組織は軽い味方。
   2. スライスをTTC溶液を含む24ウェルプレート（ウェルあたり1スライス）に移し、溶液中のスライスを引き伸ばします。切片をTTC溶液中で37℃で浅い水浴中で30分間インキュベートする。
   3. 箔で覆われた清潔な1.5 mL遠心チューブにスライスを移し、スライスの乾燥重量を測定する。
   4. 遠心分離管（v：w = 10：1）にエタノール/ジメチルスルホキシド（1：1）を加えてホルマザンを抽出する。 24時間、室温からエタノール/ジメチルスルホキシド中の薄片を光から離してインキュベートする。
   5. チューブ中のすべてのエタノール/ジメチルスルホキシドを96ウェルプレートに加え、プレートリーダーで490nmでの吸光度を測定する。
   6. 吸光度をスライスの乾燥重量に正規化し、生存率を対照スライスのパーセンテージとして表す。

2. MCAO

1. 準備：
   1. 作業台、レーザードップラーフローメーターの表面を消毒するy（LDF）機器と70％エチルアルコールを含むアクセサリを使用してください。
   2. オートクレーブされた器具を準備する：2本のはさみ、10cm; 2つの鉗子、10cm; 1つの眼科用鉗子、11cm; 1つのマイクロ眼科はさみ、9cm; 1つの微小血管クランプ、1.8cm; oneneedle drive、r 12.5 cm;いくつかの外科用縫合糸（△1/2 4×10）;綿棒。
   3. 塩水でシリンジ（針なし）を準備し、水和された手術領域を維持する。
   4. 麻酔ガス（100％O ₂ +イソフルラン）を準備する。
2. 脳血流の検出：
   1. LDF装置をセットアップします。
   2. 鎮痛薬をマウスに腹腔内注射する：metamizol 200mg / kg、carprofen 4mg / kgおよびbuprenorphin 0.1mg / kg。
   3. 4％イソフルランを酸素に入れた誘導チャンバーにマウスを乗せ、麻酔をかけて体の動きを止め、静脈瘤を止める。
   4. マウスを腹を立てた位置に置き、次の手順のためにイソフルランを1.5％に維持する。
   5. 両眼にデクスパンテノール眼軟膏を塗布する。
   6. 70％エチルアルコールでヘッドを消毒する。
   7. ブレグマを暴露するためにメスを使用して、目と耳の間に適切なパラメディア皮膚切開を行います。
   8. 滅菌綿で頭蓋骨をこする。
   9. 頭蓋骨の表面に1〜2滴の外科用接着剤を塗布する。
   10. ブレグマに5 mmの尾側に光ファイバプローブの先端を置き、正中線に6 mmの横方向に配置する。
   11. 血流をコンピュータソフトウェアに記録し始める。安定した血流のベースラインが得られるまで待ってから、接着剤に20μLの触媒を塗布してプローブを固定します。
       注：理想的なベースラインは500以上のフラックスでなければなりません。
   12. ベースラインが200フラックス未満の場合は、適切なベースラインを得るために細かく位置を調整します。実験の間、プローブを頭蓋骨に取り付けたままにしておきます。
   13. ヨードフォアで頭部を消毒する光ファイバープローブが取り付けられています。
3. MCAO：
   1. 麻酔したマウス（その頭蓋骨に取り付けられたLDFプローブ付き）を仰臥位に置き、固定し、外科手術中に加熱ランプを用いて体温を維持する。 70％エチルアルコールで首を消毒する。
   2. メスを使って首にパラミードの皮膚を切開する。柔らかい組織を鉗子で切開して血管を露出させる。 1滴の生理食塩水を曝露された組織に加えて、それらを水和させておく。
   3. 眼の鉗子を使用して周囲の組織および迷走神経から総頸動脈を解剖する。迷走神経を損傷しないように注意してください。総頚動脈を露出させた後、ヨードフォアで再度首の皮膚を消毒する。
   4. 総頸動脈の遠位端に微小血管クランプを置き、近位端に6-0の絹の縫合糸を用いて死んだ結び目を結ぶ。後続の操作のためにクランプをできるだけ近位に配置する。長さクランプとデッドノットとの間の容器は、その後の操作のためにできるだけ長い。
   5. 緩い結び目を結ぶことで、クランプの近位に一時的な縫合を行います。モノフィラメントを挿入するために、2つの節の間に十分なスペースがあることを確認します。
   6. マイクロ眼科はさみで2つの結び目の間で縦方向の切開を行います。切開部が後続の操作のためにできるだけデッドノットに近づいていることを確認する。船を切らないように注意してください。
   7. 切開を通して12mmの先端が鈍くなったモノフィラメントを挿入して、動脈内腔に入り、数mm前進させる。モノフィラメントの先端付近の緩い結び目を締め、クランプを取り外します。
   8. LDFソフトウェアが血流の急激な減少（ベースライン血流からの> 80％の減少）を示すまで、眼科用鉗子でフィラメントを内頸動脈（中大脳動脈を塞ぐために10mm）に前進させる。オクルージョンの開始時刻を記録します。
      注：LDF計測器のセットアップは次のとおりです。セクション2.2で説明します。
   9. 中大脳動脈を1時間閉塞する。 LDFプローブを切断し、オクルージョンの持続時間の間、マウスを30℃のインキュベーターに入れる。
4. 再灌流およびAPC：
   1. 閉塞の開始の55分後に上記のようにイソフルランで動物を再麻酔する。マウスを仰臥位に置き、固定する。首の切開を開き、総頸動脈を再度露出させる。
   2. 閉塞後に眼科用鉗子でフィラメントを静かに引き出して再灌流を行い、結び目を締めて一時的縫合糸を永久縫合糸に変えます。
   3. アシドーシスの治療のために、再灌流後5、50、または100分で20％5分間、CO _{2、20％O 2}及び60％N _2を含む混合ガスにノーズコーンに吸入ガスを変更します。切断された外科用縫合糸で切開部を閉じる。
   4. マウスが意識を回復するまで30℃の熱ケージにマウスを置くマウスを清潔な個々のケージに戻します。水と湿った食物のペトリ皿をマウスに提供する。過度の痛みと死亡の手術後にマウスを注意深く監視する。
5. 脳梗塞体積測定：
   1. 再灌流の24時間後にTTC染色を用いて脳梗塞体積を測定する。
   2. 指定された犠牲の時間の前に、ステップ1.4.1で述べたように0.25％TTC溶液を調製する。箔で覆われた24ウェルプレート（1ウェルあたり1 mL）に溶液を移し、4℃で保存する。
      注：TTCおよびTTCで染色された組織は光感受性である。
   3. 再灌流の24時間後、誘導チャンバー内でイソフルラン過剰投与動物を屠殺する。マウスを断つ。小さなはさみと鉗子を使って脳を解剖する。 Willis Circleでくも膜下出血を起こしたマウスを除外するために、脳の肥厚点を調べる。
   4. -20°の清潔なガラススライド上に脳を置きます ; C氷パック。脳とスライスを-20℃の冷蔵庫に5分間置き、脳のスライスを容易にします。
   5. 脳とスライドガラスを-20℃から取り出し、-20℃の氷上に戻します。前頭極と小脳を刃と鉗子で解剖する。
   6. 脳切片を水平にスライスして1mmの厚さにし、刃で5枚のスライスを作ります。スライスをTTC溶液（1ウェルあたり1スライス）を含む24ウェルプレートに鉗子で移し、溶液中のスライスを引き伸ばす。切片をTTC溶液中で37℃で浅い水浴中で30分間インキュベートする。
   7. TTC溶液を吸引する。 10％ホルムアルデヒド（ウェルあたり1mL）を添加し、室温で30分間インキュベートする。セロファンシート上に切断された順番にスライスを置き、セグメントを写真プレートイメージャにスキャンする。
   8. ImageJ解析ソフトウェアを使用して脳全体のスライスのパーセンテージとして梗塞サイズを分析するlass = "xref"> 8である。 図2 （左）を参照してください。

結果

上記の皮質層スライスモデルにおいて、皮質層のスライス生存率を、再灌流1時間後のTTCアッセイによって定量化した。 TTC変換は、490nmでの吸収を対照スライスに正規化することによって計算した。 TTC変換によれば、APCは、発症時間および持続時間依存的様式で、OGD誘発再灌流損傷に対して保護した。詳細には、1分および3分のアシドーシス治療は、15分のOGD後5分で生存率を有意に改善したが、5分は認めなかった（OGD：0.609±0.029,5 / 1：0.758±0.034,5 / 3：0.821±0.041、 5/5：0.672±0.053、データは平均±SEMとして報告された）（ 図 1A ）。アシドーシス治療による神経保護は、再灌流後5分以内に保護されたままであったが、15分（OGD：0.584±0.044,0/3：0.762±0.036,5/3：0.833±0.062,15/3：0.627±0.038）（ 図1...

ディスカッション

ここでは、脳虚血に対するAPCの神経保護を研究するための2つの実験モデルを提示する。脳切片において、APCは、再灌流後に20％CO _2で泡立てた酸性緩衝液中でマウスの皮質層をスライスすることによって達成されるが、MCAOモデルでは、再灌流後に20％CO ₂を吸入することによってAPCが達成される。両方のモデルは、脳虚血に対するAPCの神経保護を反映する。保護は、虚血後事後調整によって達成されたものと同等であったが、より広い時間枠を有していた。 MCAOモデルでは、再灌流後50分、虚血後事後調整10分と比較して時間窓が長くなる可能性がある¹⁵ 。さらに、APCの手順はより簡単で安全です。

皮質層スライスモデルでは、脳スライスの生存率を最大限に保証するために、穏やかで迅速な操作が重要です。 MCAOの性能については、脳血流モニタリングは、中大脳動脈の閉塞を確実にするために血流の急激な低下を観察しなければならない。脳をTTC染色のために解剖した後、クモ膜下出血を排除するためには、脳の注意深い検査が...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
塩化ナトリウム		Σ S5886
塩化カリウム	Σ	P5405
リン酸カリウム一塩基性	Σ	P9791
硫酸マグネシウム		Σ M2643
重炭酸ナトリウム		Σ S5761
塩化カルシウム二水和物	Σ	C5080
D-(+)-グルコース	Σ	G7021
ビブラトーム	ライカ	VT1000 S
2,3,5-トリフェニルテトラゾリウム塩酸塩	Σ	T8877
無水エタノール	アラジン工業公社	E111993
ジメチルスルホキシ	Σ	D8418
レーザードップラー フローメトリー	ムーアInstruments Ltd	Model Moor VMS-LDF2
ジエチルエーテル無水	Sinopharm Chemical Reagent Corporation	80059618
Trichloroacetaldehycle hydrate	Sinopharm Chemical Reagent Corporation	30037517
10% ホルマリン	アラジン インダストリアル コーポレーション	F111936
24 ウェル プレート	ジェット Biofil	TCP-010-024