注射の再生療法と高スループットの薬剤のスクリーニングのための 3 D への放射能

Summary

このプロトコルは、cryogelation の技術で微細加工を統合することにより弾性三次元多孔体 microcryogels の作製をについて説明します。セルの読み込み、時に、容易に注入の生体内再生治療を容易にすることができますまたは高スループット薬剤スクリーニングの in vitroの配列に組み立てに 3 D への放射能を生成します。

Abstract

伝統的な 2 D 細胞培養を 3 D 細胞培養にアップグレードするには、多孔質マイクロ cryogels (microcryogels)、様々 な 3 D への放射能を形成する細胞の種類を読み込むことができますを生成する cryogelation 技術が微細加工を統合されている私たち。ここで、多彩な 3 D への放射能と再生医療および創薬スクリーニングに応用を作製するプロトコルを提案する.サイズと形状制御 microcryogels アレイ チップ、またはことができる収穫のオフチップ注射再生療法の個別セル ロード キャリアとして高スループットの 3 D 微少配列にアセンブルされたオンチップ更なる加工できます。薬剤のスクリーニング。これらのマイクロ スケール cryogels の高弾性性質のため 3 D への放射能は射出中に機械的せん断力から細胞を保護することにより低侵襲細胞療法のための素晴らしい injectability を展示します。これにより強化された細胞の生存とマウス下肢虚血モデルにおいて治療効果。一方、標準的なマルチ 384 ウェル フォーマットで 3 D 微少配列のアセンブリは高スループット薬剤のスクリーニングのこの汎用性の高い 3 D 細胞培養プラットフォームで有効にする共通研究施設や設備の使用を促進します。

Introduction

培養皿やウェル プレートなどの平面的な 2次元 (2 D) 表面に従来の携帯文化はほとんどのネイティブ状態に近い細胞の挙動を引き出すことができます。様々 な種類の細胞、細胞外マトリックス三次元 (3 D) アーキテクチャ^{1,2,3 の生理活性の可溶性因子を構成するネイティブの細胞微小の正確な反復、4}、、リニアアクチュエータ組織体外組織工学・再生医学のアプリケーションの構築に不可欠な基礎的生物学および創薬探索^{5,6,7 ,8,9}。

2 D の細胞培養の代わりに生体模倣マイクロ アーキテクチャを事前に 3 D 細胞培養を用い、培養細胞の機能。人気の 3 D 細胞培養法は、集計細胞スフェロイド^7,

Protocol

動物実験後清華大学バイオメディカル分析センターの動物倫理委員会によって承認された厳密なプロトコル。倫理委員会の承認を得て、ひと脂肪組織は北京連合病院の整形外科の部門から患者からインフォームド コンセントの得られた

。

1 です 3 d Microcryogels の作製

1. microstencil アレイ チップの設計と試作
   1. 円など、特徴的な形状のデザイン配列に商業ソフトウェアを使用楕円、三角形または。クローバー ¹⁴、後続のアプリケーションに応じて
      。 注: 再生医療用のプロトコルのセクション 2 を参照してください、詳細についてはデザイン創薬スクリーニングのためのプロトコルのセクション 3.
   2. は、デザインをレーザー彫刻レーザー彫刻機に付属するソフトウェアにインポートします。レーザー彫刻機の工場の勧告に従ってレーザー設定を使用してレーザー彫刻ポリ (methymethacrylate) (PMMA) にインポートされたデザイン シート
   。
   3. は、microstencil アレイ チップをレーザー彫刻からの残骸をきれいに脱イオン水を洗ってください。乾燥 microstencil アレイ チップを常温で密封された袋の 60 ° C 店でヶ月
   。
2. Mic....

Results

作製と 3 D の微少の形成のための microcryogels の評価。

このプロトコルによれば microcryogels はフォーム 3 D への放射能と個々 の microcryogels または microcryogel アレイを作製し、再生治療や創薬スクリーニング、それぞれ (図 1) に適用されました。PMMA から作製した Microstencil アレイ チップは、microcryogel アレイ チップの micromolds として適用されました。可変の幾何学的なデザインは、microstencil アレイ チップの準備でした。我々 は (すなわち円、楕円、三角形、およびクローバー) 様々 な形やサイズの異なる円形の microstencil アレイ チップを含んだ例として代表的な 45 mm × 14 mm micro.......

Discussion

薬剤スクリーニングのための再生医学との in vitroモデルは、組織工学^5,6,7,8,9の 2 つの重要なアプリケーションです。これらの 2 つのアプリケーションは、非常に異なるニーズを持って、それらの間の共通点ある培養条件詳細バイオミメティックのセル関数¹⁹を強化する必要があります。研究で改良されたセル関数のみを我々 は病気より^20,21, を扱うことができるし、我々 が薬物探索^6,7を加速することが培養細胞は薬.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
ゼラチン	sigma	G7041	他のすべての試薬は、特に明記されていない限り、Sigma-Aldrich(ミズーリ州セントルイス)から購入しました。
グルタルアルデヒド	J&K	902042	材料調製の架橋剤として使用されます。
ガラスカバースリップ(24 x 50 mm)	CITOGLASS、中国	10212450C	マイクロステンシルアレイチップにprcursor溶液をこすり落とします。
ナトリウム 水素化ホウ素、NaBH4	北京化学工場	116-8	化後に残っているグルタルアルデヒドを洗い流すため。
真空ジャー	アスペルト、中国	VC8130	下でマイクロゲルを保存するため。
ポリメチルメタクリレート(PMMA)シート	Sunjin Electronics Co.、Ltd、中国		普通PMMAシート。
レイジェットレーザーシステム	レイジェット、オーストラリア	レイジェット50 C30	PMMAシートを彫刻してウェルを形成します。
プラズマ	クリーナーMycro Technologies、米国	PDC-32GPMMA	を好温性にするため。
凍結乾燥機	ボイカン、中国	SC21CL	材料を凍結乾燥します。
トリパンブルー溶液(0.4%)	Zhongkekeao、中国	DA0065	ゲルを染色する。
ドキソルビシン塩酸塩	ENERGY CHEMICAL, China	A01E0801360010	2Dまたは3Dマイクロゲル中の細胞の薬剤耐性をテストします。
Live/Dead Assay	同人堂モレキュラーテクノロジーズ(熊本県熊本市)	CS01-10	生きた細胞と死んだ細胞を区別するために。
Cell Titer-Blue	Promega(米国ウィスコンシン州)。	G8080	細胞の生存率をテストするため。
セルストレーナー	BD Biosciences, USA	352360	マイクロゲルを採取します。
D-ルシフェリン	SYNCHEM(ドイツ)	s039	を粘着する。
走査型電子顕微鏡	FEI, USA	Quanta 200	マイクロゲルの形態を特徴づけるため。
機械試験機	Bose, USA	3230	機械的特徴の測定に。
プログラマブルシリンジポンプ	World Precision Instruments, USA	ALADINI 1000	試験用。
デジタルフォースゲージ	HBO、Yueqing Haibao Instrument Co.、Ltd.、中国	H-50	injactabiliyをテストするため。
エチレンオキシド滅菌システム	Anprolene, Anderson Sterilization, Inc., Haw River, NC	AN74i	マイクロゲルをエチレンオキシドガスで滅菌します。
マイクロプレートリーダー	Molecular Devices,USA	M5	マイクロアレイの蛍光強度を測定するため。
共焦点顕微鏡	ニコン、日本	A1Rsi	細胞の分布を3Dで観察します。
Xenogen ルミナIIイメージングシステム	キャリパーライフサイエンス社(米国)	IVIS	動物の細胞を追跡します。
液体作業統計	コットデザイン、米国	Sピペット	媒体または細胞懸濁液を高スループットでロードします。