注射の再生療法と高スループットの薬剤のスクリーニングのための 3 D への放射能

サマリー

このプロトコルは、cryogelation の技術で微細加工を統合することにより弾性三次元多孔体 microcryogels の作製をについて説明します。セルの読み込み、時に、容易に注入の生体内再生治療を容易にすることができますまたは高スループット薬剤スクリーニングの in vitroの配列に組み立てに 3 D への放射能を生成します。

要約

伝統的な 2 D 細胞培養を 3 D 細胞培養にアップグレードするには、多孔質マイクロ cryogels (microcryogels)、様々 な 3 D への放射能を形成する細胞の種類を読み込むことができますを生成する cryogelation 技術が微細加工を統合されている私たち。ここで、多彩な 3 D への放射能と再生医療および創薬スクリーニングに応用を作製するプロトコルを提案する.サイズと形状制御 microcryogels アレイ チップ、またはことができる収穫のオフチップ注射再生療法の個別セル ロード キャリアとして高スループットの 3 D 微少配列にアセンブルされたオンチップ更なる加工できます。薬剤のスクリーニング。これらのマイクロ スケール cryogels の高弾性性質のため 3 D への放射能は射出中に機械的せん断力から細胞を保護することにより低侵襲細胞療法のための素晴らしい injectability を展示します。これにより強化された細胞の生存とマウス下肢虚血モデルにおいて治療効果。一方、標準的なマルチ 384 ウェル フォーマットで 3 D 微少配列のアセンブリは高スループット薬剤のスクリーニングのこの汎用性の高い 3 D 細胞培養プラットフォームで有効にする共通研究施設や設備の使用を促進します。

概要

培養皿やウェル プレートなどの平面的な 2次元 (2 D) 表面に従来の携帯文化はほとんどのネイティブ状態に近い細胞の挙動を引き出すことができます。様々 な種類の細胞、細胞外マトリックス三次元 (3 D) アーキテクチャ^{1,2,3 の生理活性の可溶性因子を構成するネイティブの細胞微小の正確な反復、4}、、リニアアクチュエータ組織体外組織工学・再生医学のアプリケーションの構築に不可欠な基礎的生物学および創薬探索^{5,6,7 ,8,9}。

2 D の細胞培養の代わりに生体模倣マイクロ アーキテクチャを事前に 3 D 細胞培養を用い、培養細胞の機能。人気の 3 D 細胞培養法は、集計細胞スフェロイド^7,8,9,10にすることです。細胞スフェロイドは、高度な細胞保存と分散した細胞の注入と比較する生存と負傷者の組織に注入できること。ただし、非一様回転楕円体サイズと注入中に流体せん断力によって細胞に課された必然的な機械的損傷が悪い細胞治療効果^11,12,13に します。同様に、回転楕円体の集計中に固有の不均一 3 D 細胞を用いた高スループット薬剤のスクリーニングの挑戦¹⁰への翻訳をしました。

3 D 細胞培養のための別の方法は、通常水性ゲルまたは多孔質のセルをカプセル化する生体材料学分野の援助によって達成されます。3 D アーキテクチャを構築する上で大きな柔軟性が可能です。治療のため一括足場にカプセル化細胞通常外科的移植、侵襲性、外傷性、それゆえに枕元にその翻訳を制限することで動物の体に配信されます。その一方で、水性ゲルは、熱 - 化学か酵素架橋¹¹経由の in situゲルを許可する、動物の体にヒドロゲル前駆体溶液中に浮遊細胞を注入することにより低侵襲治療を有効にします。ただし、ヒドロゲル前駆物質水溶液の州はまだながら、細胞が配信されると彼らにさらされている機械的せん断注入中。ない限り、その場でゲル化ハイドロゲルの中に化学か酵素の架橋も内細胞への損傷を課す可能性があります。薬剤スクリーニングのため生体材料による細胞培養の均一性、制御性とスループットの問題に直面します。ヒドロゲルを使用すると、細胞の通常関与するゲル化、中にセル実行可能性と機能、プロセスを影響可能性があります。ヒドロゲルの細胞、播種前にゲル化を防ぐために氷の上に保持する必要がありますのでヒドロゲルの精度を確保するため通常非常に薄い調剤のヒント ・ ジャムが、細胞中にゲル化もほとんどの高スループット装置によって使用を妨げ高スループット スクリーニング。前もって形成された足場でした可能性のある個別の生体材料作製手順細胞培養から足場ベースの製品が比較的低いスループット¹⁴バルク材料として利用できるしかし、ほとんど。

現在の 3 D 培養法の欠点のいくつかを克服するために市販で使いやすい microcryogel アレイ チップ¹⁵を作製する微細加工 cryogelation 統合技術を開発しました。このプロトコルでは、それは生体適合性、分解性、費用対効果と細胞接着に必要なそれ以上の変更はない microcryogel 作製技術を実証するためゼラチンが選択されます。天然または合成のソースの他のポリマーは、作製、アプリケーションによっても使用できます。この技術を使って制御可能なサイズ、形状、レイアウトと小型と高弾性 microcryogels 作製することができます。さまざまな種類の細胞と共に読み込まれる、3 D への放射能は様々 なアプリケーションに対して作成でした。これらのユニークな特徴は、噴射に生体内で強化された治療効果について希望 injectability、セルの保護およびサイト指示された保存を有効にします。ない限り、一般的な実験装置と多彩な薬剤のスクリーニングおよび他の細胞アッセイのハイスループットの細胞培養を実現する機器と互換性のある 3 D 微少アレイを形成するため、microcryogels をさらに処理でした。ここで、我々 もの microcryogels と個々 の 3 D への放射能または 2 つの重要なアプリケーション、細胞治療、創薬スクリーニング、それぞれ^{10,15 の 3 D 微少配列とその後の治療の作製プロセスを詳細します。}.

プロトコル

動物実験後清華大学バイオメディカル分析センターの動物倫理委員会によって承認された厳密なプロトコル。倫理委員会の承認を得て、ひと脂肪組織は北京連合病院の整形外科の部門から患者からインフォームド コンセントの得られた

。

1 です 3 d Microcryogels の作製

1. microstencil アレイ チップの設計と試作
   1. 円など、特徴的な形状のデザイン配列に商業ソフトウェアを使用楕円、三角形または。クローバー ¹⁴、後続のアプリケーションに応じて
      。 注: 再生医療用のプロトコルのセクション 2 を参照してください、詳細についてはデザイン創薬スクリーニングのためのプロトコルのセクション 3.
   2. は、デザインをレーザー彫刻レーザー彫刻機に付属するソフトウェアにインポートします。レーザー彫刻機の工場の勧告に従ってレーザー設定を使用してレーザー彫刻ポリ (methymethacrylate) (PMMA) にインポートされたデザイン シート
   。
   3. は、microstencil アレイ チップをレーザー彫刻からの残骸をきれいに脱イオン水を洗ってください。乾燥 microstencil アレイ チップを常温で密封された袋の 60 ° C 店でヶ月
   。
2. Microcryogel アレイ チップの作製
   1. 場所 4 microstencil サンプル トレイ上のチップを配列、プラズマ クリーナーに挿入します。掃除機のドアを閉じるし、2 分間の真空ポンプをオンに最大 RF 電源 (18 W) 親水性を高めるため室温で 3 分間クリーナー プラズマ microstencil アレイ チップを治療するために.
   2. フォームに 1 mL の脱イオン水に追加 0.06 g ゼラチン 6% (重量/巻) ゼラチン前駆体溶液 (5 チップを作るのに十分な)。十分に溶解する水浴の 60 ° C で暖かい。氷上で 5 分間インキュベート
   3. 0.3% の最終的な集中にゼラチン前駆体溶液にグルタルアルデヒドの追加 3 μ L。ミックス徹底的
   。
   4. ピペット 200 μ L 前駆体溶液 microstencil アレイ チップの上面にグルタルアルデヒド
      。 注: 200 μ L で 75 mm × 25 mm チップ設計に関係なく十分です。チップの面積の増加量に比例して増加します
   。
   5. 手動で均等にソリューション チップ上後ろを削って、前後曲げガラス棒で 2 倍から 3 倍します
      。 注: 各ウェル microstencil チップ上満たすことができる前駆体溶液の親水性の性質プラズマ治療後
   。
   6. すぐに cryogelation の 16 時間-20 ° C のフリーザーに前駆体ソリューションいっぱいアレイ チップを配置します
   。
   7. 調整 30 分-40 ° C にエアカーテン、エアカーテンで cryogelation 後アレイ チップを配置し、真空中で 2 h のアレイ チップを凍乾します
      。 注: 相互接続された水ガラス ゼラチン microcryogels が形成される氷 cryogelation 気高く、エアカーテンの中に形成されているためです
   。
   8. セクション (CLI) 重症虚血肢の治療のため 2 と高スループットの薬剤のスクリーニングの 3 セクションに進んでください
   。

2。CLI の治療のフォーム注射用 3 D への放射能に個々 の Microcryogels を収穫

1. 収穫個別 microcryogels
   1. デザイン アレイ (75 mm × 25 mm) 600 円、400 μ m の直径、それぞれの注射 3 D 微少建設のための商用ソフトウェア。詳細なセクション 1.1 として microstencil アレイ チップの作製の 300 μ m 厚の PMMA を使用します
   。
   2. セクション 1.2 のように microcryogel アレイ チップを作製します
   。
   3. ステップ 2.1.1 標準ソフト ・ リソグラフィー ^{16 , 17} と同様のデザインを持つ PDMS 突き出しピン配列を作製します
   。
   4. は、各 microcryogel アレイ上の突き出しピンとを合わせ、PDMS 突き出しピン配列の上に microcryogel アレイ チップをオーバーレイします。個々 の microcryogels を収穫する PDMS エジェクタ ピン配列の突出ピンとマイクロウェルから microcryogels をプッシュするエジェクタ ピン配列に向かって microcryogel アレイ チップを押します
   。
   5. は、水の中に、microcryogel を収穫し、セル ストレーナーの助けを借りてそれらを収集します。1 チップ (すなわち、600 microcryogels) から microcryogels を収集するために 1 つのストレーナを使用します
   。
   6. ウォッシュ microcryogels 0.1 M NaBH ₄ uncross-リンク アルデヒド残余を癒やすために 20 分間氷の上で。チップ当たり 0.1 M NaBH ₄ の 5 mL を使用します。NaBH ₄ を破棄し、3 〜 5 回、15 分間 5 mL の脱イオン水で洗うたびにします
   。
   7. はセル ストレーナーから水を捨てるとセル ストレーナーあたり 1 つのクラスターに microcryogels を収集し、曲がりピンセットを使用して 1 つの 35 mm のペトリ皿に 1 つのクラスターを配置します。50-70 μ L の脱イオン水を各クラスターに、シャーレのふたのカバーを追加します。ペトリ皿の表面に microcryogels の単分子膜を形成するための別の microcryogel の上に横たわっている microcryogels がないので、すべて microcryogels を卓上にペトリ皿を軽く
   。
   8. は、2 h (1.2.7 のステップを参照)、それらを lyophilizing する前に 4 に 16 時間-20 ° C で収穫された microcryogels をフリーズします。さらに使用するまで室温で真空 microcryogels を格納します
   。
2. Microcryogels の
   1. 、microcryogels の細孔を走査電子顕微鏡 (SEM) イメージングによる評価。
      1. 固定両面粘着テープと 90 用スパッタ コーターとゴールド コートのサンプル ホルダーに収穫と凍結乾燥 microcryogels s、SEM ¹¹ によるイメージングの前に。評価し、画像解析ソフトを用いた 7 異なる SEM 画像から microcryogel の細孔径の分布を分析します
      。
   2. Microcryogels 乾燥ゼラチン (GMs) の重量の 35 mm のペトリ皿に 600 の凍結乾燥 microcryogels の 1 つのクラスターの重量を量る。凍結乾燥 microcryogels のクラスターに 60 μ L の脱イオン水を追加し、30 を待つ完全に膨張水を吸収し microcryogels の s。腫れの microcryogels の重量を量る。
      1. を決定する平衡膨潤率と乾燥ゼラチン microcryogels と水和物 microcryogels の microcryogels で開催された水の重量の比率に腫れ microcryogels の重量の比率として、microcryogels の気孔率それぞれ ¹³.
   3. Microcryogels デジタルの力と統合されたプログラム可能なシリンジ ポンプを使用しての測定 injectability ゲージ ¹⁴。 トリパンによって microcryogels の
      1. 染色 600 個セット青し、600 μ L 15% のゼラチン溶液を均一に分布を達成するための中断します。1 mL の注射器 1 mL microcryogel サスペンションをロードします。1 mL 注射器 1 mL/分の流量でプログラム可能なシリンジ ポンプを使用してに接続されている 27 ゲージの針を通して混合物を注入
      デジタル力によって
      2. モニター リアルタイム注入強制的にテストをゲージし、力-時間曲線をプロットします。注入後、顕微鏡下で microcryogels の整合性を確認します
         。 注: 15% (重量/巻) ゼラチン溶液中に浮遊 GMs スムーズに注入でき注射後がそのまま残っています
      。
   4. Microcryogels の分解性を特徴付けます。
      1. は、まず、乾燥重量として 35 mm のペトリ皿に 600 の凍結乾燥 microcryogels の 1 つのクラスターの体重を測定します。没頭する 600 の凍結乾燥 microcryogels 2 mL 0.025% (巻/巻)/トリプシン EDTA
      。 異なる時点でのセルのストレーナーを使用してソリューションから
      2. 収集 microcryogels (すなわち 10、20、30、40、50、60、70 分)。芯ティッシュで離れて余分なソリューションです。異なる時点で microcryogels の重量を測定し、劣化度を一定時間 0 で microcryogel の時点で microcryogel の重量の比率として計算します
      。
3. Microcryogels フォーム 3 D への放射能にセルのオートローディング
   1. vac 下で脱ガス 12 h に続いて 12 h ガス暴露エチレン酸化殺菌システムによるステップ 2.1.8 から microcryogels を滅菌サウナがあります
   。
   2. は、マウス虚血性後肢の治療のためのひと脂肪由来間葉系間質細胞 (hMSCs) を選択します。手順に従って、特定のセルが以前に ¹⁸ を報告します
   。
   3. 成長における文化 hMSCs 培 ^-8 M のデキサメタゾンを 10、10、10 ng/mL 血小板由来成長因子 bb (PDGF bb)、インシュリン ・ トランスフェリン ・ セレニウム (ITS) × 1、10 ng/mL 上皮成長因子 (EGF) 2% ウシ胎児血清 (FBS) ^-4 M アスコルビン酸 2-リン酸、100 の U/mL ペニシリン、DMEM/f12 キーで 100 μ g/mL ストレプトマイシン。合流時の 1:3 の割合で細胞を通路します。次の実験で通路 3 に 5 のセルを使用します
   。
   4. トリプシン hMSCs を収穫しフックス-ローゼン タール カウント チャンバーを用いて細胞数を定量化し、hMSCs 培地に 8 x 10 ⁶ セル/ml の密度に再懸濁します
   。 セクション 2.1 から 35 mm ディッシュ
   5. 600 microcryogels の直径 400 の単分子膜にピペット 60 μ L hMSCs サスペンション μ m。セルは、microcryogels のマイクロ構造の多孔質体に吸収されて自動的にします
   。
   6. 加湿チャンバーに維持し, セルを付けるように 2 h の 37 ° C で。2 時間後、2 mL 培養液を追加します。2 日ごとに媒体を変更します。文化の 3 D への放射能を形成する 2 日の hMSCs ロード microcryogels.
   7. 後 2 日間培養、ピペットの 96 ウェル プレートのウェルあたり 100 hMSCs ロード microcryogels、メーカーによればレサズリン作業溶液の 120 μ L を追加 ' を各ウェルに s 命令。37 ° C で 2 時間インキュベートします。
      1. 検出蛍光レサズリン 590 の 560 nm、発光波長の励起光の波長をマイクロ プレート リーダーで実行可能な細胞代謝の nm。キットのプロトコル ¹³ によると今後の実験のための蛍光強度からの携帯番号を補間する hMSCs を使用して蛍光セル数の標準曲線を確立します
      。
   8. 日レサズリンを使用して 4 に従ってステップ 0 日目から 4 日目に 2.3.7 に 0 日目から microcryogels で hMSCs の数を把握します
   。
   9. カルセイン AM 1: 500 希釈とリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) で Propidium ヨウ化 (ライブ/デッド染色として知られている) の 1: 250 希釈 microcryogels で細胞を染色し、蛍光顕微鏡や共焦点レーザー蛍光顕微鏡下で観察します
   。
4. 3 D への放射能 体内 マウス モデルにおける CLI の治療のための注射
   1. として報告された ^{11 ,} 雌性 balb/c ヌードマウスの重要な後肢虚血を確立 ¹⁹ 3 D 微少基づかせていた療法の治療効果を判定します
   。
   2. 手順 2.3.6 セル ストレーナーに 5 mL のピペットを使用してへの放射能を転送し、離れて培養液中にフィルターを適用します
   。
   3. 100 microcryogels 100 μ L ソリューションごとの密度で、15% のゼラチン液で、hMSCs ロード 3 D への放射能を再懸濁します
   。
   4. 術前にオートクレーブで手術器具を滅菌、動物施設センターで動物の手術室で手術を実行します
   。
   5. は、乾燥を防止するのには、マウスの目に適用エリスロマイシンを 1 L/分の流量で酸素を 100% で 1-3% イソフルランを含む麻酔誘導の商工会議所にマウスを配置します。長さ 1 cm の皮膚切開を通して大腿動脈とその枝 5 10 シルク縫合糸で縛るし、消費税 ¹⁹.
   血流を監視する
   6. 注入インドシアニン グリーン (ICG) (100 μ g/mL の 0.1 mL) 尾静脈注射。蛍光イメージング システムを用いた ICG 蛍光イメージングを実行します (ここでは、自家製のシステム) 反射ジオメトリ ¹¹
   。
   7. 筋肉内への放射能を 23 g 針、1 mL の注射器を使用して動脈切開周り薄筋の 3 つのサイトに注入します
   。
   8. 手術後マウスを暖かく保つ加熱パッドで回復檻の中。痛みを和らげるために、目を覚ましまで継続的に監視メロキシカムを皮下注入します
   。
   9. 後 28 日 ¹¹ 蛍光による 3 D 微少治療肢の治療の効果を監視します
      。 注: 挿入皮下マウスは自発の肢切断を示したときに、痛みを和らげるためにメロキシカム
   。
   10. 安楽死マウス実験が完了した後の二酸化炭素と
       。 注: ここでは、炭酸ガスで安楽死を行った 清華大学バイオメディカル分析センターの動物倫理委員会によって承認された厳密なプロトコルに従ってします
   。

3。高スループット薬物をスクリーニングするための微少アレイ チップの組立

1. オンチップ細胞培養のための microcryogel 配列のアセンブリ
   1. 従来のウェル プレート寸法に従ってセクション 1.1 でデザインを編集すなわち、マルチ 384 ウェル フォーマット、16 × 24 の井戸 (列によって行) の配列をデザイン各 2 mm 径・ 4.5 mm センター-センターの間隔
   。
   2. 1.1 節で説明したようにレーザーが 500 μ m 厚の PMMA シートに刻むです
   。
   3. 作製 microcryogels 前述のセクション 1.2 を使用してから得られるマルチ 384 ウェル アレイ チップは、3.1.2 をステップ実行します。Microcryogel アレイ チップとしてこの microcryogel を含む配列を指定します
   。
   4. Microcryogel アレイ チップを洗う 50 mL 0.1 M NaBH ₄ と uncross-リンク任意の残留アルデヒドを癒やすため、各時間を 3 回、2 h の 50 mL の脱イオン水で繰り返しすすぎします
   。
   5. 水を捨てて、1.2.7 のステップによると lyophilizing の前に 4 に 16 時間-20 ° C で microcryogel アレイ チップを凍結します
   。
   6. 16 × 24 を含むステップ 3.1.1 の変更 384 マルチよく配列設計井戸、3 mm 径・ 4.5 mm センター - 間隔の各します
   。
   7. 極薄 (10 μ m) 生体適合性両面粘着テープのシートから、バッキングの片側を削除、3 mm 厚のアクリル シートの部分の 1 つの側面に貼り付けます。レーザーは、1.1 節によるとこの 3 mm 厚のアクリルにステップ 3.1.4 からデザインを刻みます。この配列は、貯留層配列として指定されます
   。
   8. Microcryogel 配列整列貯水池アレイ チップとチップし、一緒に準拠 3 D microcryogel アレイ チップのオンチップ細胞培養のための組み立てに密に。1 h. の紫外放射による殺菌
   9. ストア 3 D microcryogel アレイ チップをさらに実験のための部屋の温度で真空
   。
2. 3 D 微少配列に薬物のスクリーニング
   1. 細胞培養のための湿度チャンバーとして 25 mL 滅菌脱イオン水と湿式ボックスを埋めます。予熱で加湿 5% CO ₂ インキュベーター 37 ° C
   2. は、非小細胞肺癌細胞 (NCI H460) と標準プロトコルに従って組織培養皿から肝細胞癌細胞 (HepG2) を収穫し、再最終濃度 10 ⁶ セル/mL x 1.0 に培地にサスペンドします。ミックス徹底的
      。 注: 10 %fbs、100 U/mL ペニシリン ストレプトマイシン 100 μ g/mL と RPM1640 は、NCI H460 に使用されます。Hepg2 細胞の 10 %fbs、100 U/mL ペニシリン ストレプトマイシン 100 μ g/mL と DMEM を使用します
   。
   3. は、インキュベーターから湿度チャンバーを削除します。3.1.9 湿度チャンバー内のステップから慎重に組み立てられた 3 D の場所 microcryogel アレイ チップをピンセットを使用します。商工会議所で水を microcryogels を濡らさないように注意してください
   。
   4. 混合細胞懸濁液、分注 3 μ を徹底的に、細胞懸濁液を各ウェルに microcryogel に直接します
      。 注: ピペット チップは軽く、細胞懸濁液を追放する前に、microcryogel の表面を触れる必要があります。セルは吸収によって microcryogel に自動ロードです。周辺の井戸のセルをシードしないようにします
   。
   5. 96 ch 液体ハンドラーなどのマルチ チャンネル ピペットを使用して microcryogel 細胞が播種後もメディアの追加 10 μ L。中は、周辺の井戸にも追加されます
      。 注: 使用 RPM1640 メディア 10 %fbs、100 U/mL ペニシリン 100 μ g/mL streptomycin H460 細胞。HepaG2 細胞 10 %fbs、100 U/mL ペニシリン ストレプトマイシン 100 μ g/mL と DMEM メディアを使用します
   。
   6. 文化セル ロード microcryogel アレイ チップ加湿 5% で 24 時間湿度チャンバー フォーム 3 D 微少配列に 37 ° C で CO ₂ インキュベーター
   。
   7. 溶解ドキソルビシンと IMMLG 8439 ⁹ ジメチルスルホキシド (DMSO) 10 mM のストック溶液を形成します。2 から 10 倍希釈濃度勾配を形成するための培養培地で薬を希釈 200 μ M に nM
   。
   8. 追加 10 μ L 各薬液の井戸。コントロールとして 0.1 %dmso (培地で希釈) を使用します。5% の加湿で薬物読み込まれた 3D 微少配列を孵化させなさい 37 ° C で 24 時間のための CO ₂ インキュベーター
   9. 追加 4 μ L を各ウェル レサズリン原液の。マイクロ プレート リーダーの 2 場所 3 D 微少アレイの 37 ° C で、590 の 560 nm、発光波長の励起光の波長で実行可能な細胞代謝レサズリンの蛍光を検出 nm
   。
   10. は、さらにデータ処理の前にすべての井戸からレサズリン基準信号を減算します。その蛍光信号制御井戸の平均蛍光信号を分割して各ウェルの細胞生存率を計算します
   。
   11. は、印刷ソフトウェア y 軸と x 軸として薬物濃度の 10 を底とする対数として細胞生存率の用量-反応曲線をプロットします。0.5 の細胞生存率で 50% 阻害濃度 (IC50) を補間します
   。

結果

作製と 3 D の微少の形成のための microcryogels の評価。

このプロトコルによれば microcryogels はフォーム 3 D への放射能と個々 の microcryogels または microcryogel アレイを作製し、再生治療や創薬スクリーニング、それぞれ (図 1) に適用されました。PMMA から作製した Microstencil アレイ チップは、microcryogel アレイ チップの micromolds として適用されました。可変の幾何学的なデザインは、microstencil アレイ チップの準備でした。我々 は (すなわち円、楕円、三角形、およびクローバー) 様々 な形やサイズの異なる円形の microstencil アレイ チップを含んだ例として代表的な 45 mm × 14 mm micro...

ディスカッション

薬剤スクリーニングのための再生医学との in vitroモデルは、組織工学^5,6,7,8,9の 2 つの重要なアプリケーションです。これらの 2 つのアプリケーションは、非常に異なるニーズを持って、それらの間の共通点ある培養条件詳細バイオミメティックのセル関数¹⁹を強化する必要があります。研究で改良されたセル関数のみを我々 は病気より^20,21, を扱うことができるし、我々 が薬物探索^6,7を加速することが培養細胞は薬...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ゼラチン	sigma	G7041	他のすべての試薬は、特に明記されていない限り、Sigma-Aldrich(ミズーリ州セントルイス)から購入しました。
グルタルアルデヒド	J&K	902042	材料調製の架橋剤として使用されます。
ガラスカバースリップ(24 x 50 mm)	CITOGLASS、中国	10212450C	マイクロステンシルアレイチップにprcursor溶液をこすり落とします。
ナトリウム 水素化ホウ素、NaBH4	北京化学工場	116-8	化後に残っているグルタルアルデヒドを洗い流すため。
真空ジャー	アスペルト、中国	VC8130	下でマイクロゲルを保存するため。
ポリメチルメタクリレート(PMMA)シート	Sunjin Electronics Co.、Ltd、中国		普通PMMAシート。
レイジェットレーザーシステム	レイジェット、オーストラリア	レイジェット50 C30	PMMAシートを彫刻してウェルを形成します。
プラズマ	クリーナーMycro Technologies、米国	PDC-32GPMMA	を好温性にするため。
凍結乾燥機	ボイカン、中国	SC21CL	材料を凍結乾燥します。
トリパンブルー溶液(0.4%)	Zhongkekeao、中国	DA0065	ゲルを染色する。
ドキソルビシン塩酸塩	ENERGY CHEMICAL, China	A01E0801360010	2Dまたは3Dマイクロゲル中の細胞の薬剤耐性をテストします。
Live/Dead Assay	同人堂モレキュラーテクノロジーズ(熊本県熊本市)	CS01-10	生きた細胞と死んだ細胞を区別するために。
Cell Titer-Blue	Promega(米国ウィスコンシン州)。	G8080	細胞の生存率をテストするため。
セルストレーナー	BD Biosciences, USA	352360	マイクロゲルを採取します。
D-ルシフェリン	SYNCHEM(ドイツ)	s039	を粘着する。
走査型電子顕微鏡	FEI, USA	Quanta 200	マイクロゲルの形態を特徴づけるため。
機械試験機	Bose, USA	3230	機械的特徴の測定に。
プログラマブルシリンジポンプ	World Precision Instruments, USA	ALADINI 1000	試験用。
デジタルフォースゲージ	HBO、Yueqing Haibao Instrument Co.、Ltd.、中国	H-50	injactabiliyをテストするため。
エチレンオキシド滅菌システム	Anprolene, Anderson Sterilization, Inc., Haw River, NC	AN74i	マイクロゲルをエチレンオキシドガスで滅菌します。
マイクロプレートリーダー	Molecular Devices,USA	M5	マイクロアレイの蛍光強度を測定するため。
共焦点顕微鏡	ニコン、日本	A1Rsi	細胞の分布を3Dで観察します。
Xenogen ルミナIIイメージングシステム	キャリパーライフサイエンス社(米国)	IVIS	動物の細胞を追跡します。
液体作業統計	コットデザイン、米国	Sピペット	媒体または細胞懸濁液を高スループットでロードします。