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方法論記事

臍帯血由来誘導多能性幹細胞からの軟骨形成ペレット形成

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DOI:

10.3791/55988

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2017年6月19日

 ,  , 
1CiSTEM Laboratory, Convergent Research Consortium for Immunologic Disease, Division of Rheumatology, Seoul St. Mary's Hospital, College of Medicine, The Catholic University of Korea, 2Division of Rheumatology, Department of Internal Medicine, Seoul St. Mary's Hospital, Institute of Medical Science, College of Medicine, The Catholic University of Korea

この記事について

サマリー

ここでは、臍帯血単核球由来ヒト由来多能性幹細胞からの軟骨分化のプロトコールを提案する。

要約

人間の関節軟骨は、それ自体を修復する能力が欠けている。従って、軟骨変性は治癒的ではなく、保存的治療によって治療される。現在、 エクスビボで増殖した軟骨細胞または骨髄由来間葉系幹細胞（BMSC）を用いて損傷軟骨を再生する努力がなされている。しかしながら、これらの細胞の制限された生存能力および不安定性は、軟骨再建におけるそれらの適用を制限する。ヒトに誘導された多能性幹細胞（hiPSC）は、再生的応用のための新しい選択肢として科学的な注目を集めている。無制限の自己複製能力と多能性を有することにより、hiPSCは、軟骨修復のための新しい置換細胞源として注目されている。しかし、高品質の軟骨形成性のペレットを大量に得ることは、臨床応用への大きな課題です。この研究では、胚様体（EB）由来の外胚葉細胞を軟骨分化のために使用した。成功した軟骨形成は、PCRおよびアルシアンブルー、トルイジンブルー、およびコラーゲンI型およびII型（それぞれCOL1A1およびCOL2A1）に対する抗体で染色した。我々は、臍帯血単核細胞由来iPSC（CBMC-hiPSC）の軟骨形成性ペレットへの分化のための詳細な方法を提供する。

概要

hiPSCsの使用は、薬物スクリーニングおよび種々の疾患の機械的研究のための新しい戦略を表す。再生的な観点から、hiPSCsはまた、関節軟骨1,2などの治癒能力が限定された損傷組織の置換のための潜在的な供給源でもある。

天然の関節軟骨の再生は、数十年にわたり挑戦されてきた。関節軟骨は柔らかく白い組織で、骨の端を覆い、摩擦から保護します。しかし、損傷したときの再生能力は限られており、自己修復はほとんど不可能である。したがって、数十年にわたって軟骨の再生に焦点を当てた研究が進行中である。

従来、軟骨形成系統へのインビトロ分化は、通常、膝関節から単離したBMSCまたは天然軟骨細胞を用いて行った3 。原因それらの軟骨形成能、BMSCおよび天然軟骨細胞は、軟骨形成におけるそれらの使用を支持する多くのメリットを有する。しかし、それらの限定された拡大および不安定な表現型のため、これらの細胞は、関節軟骨欠損の再構築にいくつかの限界に直面する。 インビトロ培養条件下では、これらの細胞は3-4継代後にそれら自身の特徴を失う傾向があり、最終的にそれらの分化能力に影響を及ぼす4 。また、天然軟骨細胞の場合、これらの細胞を得る際には、膝関節へのさらなる損傷が不可避である。

BMSCまたは天然軟骨細胞とは異なり、hiPSCはインビトロで無期限に増殖することができる。適切な培養条件では、hiPSCは軟骨分化の代替源として大きな可能性を秘めています。しかし、hiPSCの本質的な特性を変えることは難しい5 。さらに、それはいくつかの複雑なin vitro ste特定の細胞型にhiPSCsの運命を導くps。これらの合併症にもかかわらず、hiPSCsの使用は、自己複製能力が高く、軟骨細胞を含む標的細胞に分化する能力があるため、依然として推奨されている6 。

軟骨形成分化は、通常、MSC様前駆細胞を用いて、ペレット培養またはマイクロマス培養などの三次元培養系で行われる。 hiPSCを使用する場合、MSC様前駆細胞を生成するプロトコルは、既存のプロトコルとは異なる。いくつかのグループは、表現型をMSC様細胞に直接変換するために、hiPSCの単層培養を用いる。しかし、ほとんどの研究では、EBを用いてMSC8,9,10,11に似た外殖細胞を生成しています。

様々なタイプの成長因子を用いてコンドロゲを誘導するnesis。通常、BMPおよびTGFβファミリータンパク質は、単独でまたは組み合わせて使用​​される。分化は、GDF5、FGF2、およびIGF1などの他の因子によっても誘導されている12,13,14,15。 TGFβ1は、MSCs 16において用量依存的に軟骨形成を刺激することが示されている。他のアイソタイプであるTGFβ3と比較して、TGFβ1は、軟骨前軟骨間細胞の凝縮を増加させることによって軟骨形成を誘導する.TGFβ3は、間葉細胞増殖を有意に増加させることにより軟骨形成を誘導する17 。しかし、TGFβ3は、TGFβ1より研究者により頻繁に用いられる7,10,18,19。 BMP2は、ヒトにおける軟骨形成性マトリックス成分に関連する遺伝子の発現を増強するインビトロ条件下での関節軟骨細胞20 。 BMP2は、TGFβタンパク質21と組み合わせてMSCにおける軟骨形成に重要な遺伝子の発現を増加させる21 。 BMP2は、SmadおよびMAPK経路22を介してTGFβ3の効果を相乗的に増強することも示されている22 。

この研究では、CBMC-hiPSCを、低付着ペトリ皿中でEB培地を用いてEBに凝集させた。伸長細胞は、EBをゼラチンコートディッシュに付着させることによって誘導された。外胚葉細胞を用いた軟骨形成分化をペレット培養により行った。 BMP2およびTGFβ3の両方による処理は、細胞を首尾よく凝縮させ、軟骨形成ペレット形成のための細胞外マトリックス（ECM）タンパク質蓄積を誘導した。この研究は、CBMC-hiPSCを用いた単純で効率的な軟骨形成分化プロトコルを示唆している。

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プロトコル

このプロトコルは、カトリック大学（KC12TISI0861）の制度審査委員会によって承認された。再プログラミングに使用したCBMCは、ソウル・セント・メアリー病院の臍帯血バンクから直接入手した。

1. iPSCとの軟骨形成分化

  1. CBMC-iPSC生成
    1. 先の研究23に示されたプロトコルを用いてCBMC-hiPSCを生成する。
    2. 血球を15 mLコニカルチューブに集め、血球計数器を使用して数えます。
    3. 3×10 5細胞を調製し、515×gおよびRTで5分間遠心分離する。吸引によって上清を捨て、血球培地0.5mLに細胞を再懸濁する。
    4. 細胞をコーティングされていない24ウェルプレートのウェルに移し、製造者の推奨に従って、センダイウイルス混合物を添加する。
    5. 1,150 xgおよび30℃で30分間プレートを遠心分離する。
    6. 後部37℃、5％CO 2で一晩（O / N）インキュベートする。
    7. 翌日、形質導入された細胞をマトリックス被覆ウェルに移す。 30℃で30分間1,150 xgでプレートを遠心分離する。
    8. 遠心分離後、上清を除去し、1mLのiPSC培地を添加し、37℃、5％CO 2で細胞O / Nを維持する。
    9. 37℃および5％CO 2で付着細胞を維持する。毎日培地を交換し、新鮮なiPSC培地に交換してください。
      注：コロニーは、形質導入後14日目〜21日に出現する。
  2. EB生成
    1. 37℃および5％CO 2で hiPSCを維持する。新鮮なEssential 8（E8）培地と交換して、培地を毎日交換してください。
    2. E8培地でビトロネクチンでコーティングした100 mmディッシュで2 x 10 6個の hiPSCを調製します。
    3. 培養ディッシュからE8培地を除去し、滅菌リン酸緩衝食塩水（PBS）で洗浄する。
    4. 1を加えるmLの1mMエチレンジアミン四酢酸（EDTA）を添加し、37℃および5％CO 2で2分間インキュベートする。
    5. 3mLのE8培地で細胞を採取し、新しい15mLコニカルチューブに移す。室温（RT）で2分間250xgで細胞を遠心分離する。
    6. 細胞ペレットを乱すことなく上清を吸引し、E8培地5 mLに細胞を再懸濁する。
    7. 血球計数器を用いて細胞を計数し、100mmペトリ皿ごとに2×10 6個の細胞を調製する。調製した細胞を、10μMのρ-関連キナーゼ（ROCK）阻害剤を含むE8およびEB培地（1：1）の10mL混合物中に再懸濁する。
    8. 37℃、5％CO 2で細胞をO / Nでインキュベートする。
    9. 翌日、ピペットで集めたEBを採取する。細胞を250xgで1分間遠心分離する。上清を除去し、10mLの新鮮なE8培地にEBを再懸濁する。
    10. 生成されたEBを5日間拡大し、毎日の変更をfresで行うh E8培地。さらに成熟するために、培養培地をE7培地に交換する。 37℃、5％CO 2でさらに5日間EBを維持し、新鮮なE7培地で毎日培地を交換する。
      注：E7培地は、FGF2を含まないE8培地である。
  3. EBからの伸長細胞誘導
    1. 1％ゼラチン6mLを100mmディッシュに加え、37℃および5％CO 2で30分間インキュベートする。
    2. 使用前にゼラチンを取り出し、2〜3時間完全に乾燥させます。
    3. EBを50 mLコニカルチューブに移す。 EBがコニカルチューブの底に落ち着くようにします。 EBを乱すことなく上清を除去する。
    4. EBを20％ウシ胎児血清（FBS）を含む10mLのダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）に再懸濁する。 EBをゼラチンコートされた100mmディッシュに移す。 10μMのROCK阻害剤を添加する。
    5. 細胞を37℃、5％CO 2で7日間インキュベートし、維持する。私を変えるROCK阻害剤を添加することなく1日おきに投与する。
  4. 軟骨形成のペレット形成
    1. 皿から培地を吸引し、細胞をPBSで3回洗浄する。
    2. 1 mM EDTA 1 mLを加え、37℃、5％CO 2で2分間インキュベートする。
    3. 20％FBSを含む5mLのDMEMを用いて細胞を採取し、新しい15mLコニカルチューブに移す。
    4. 細胞を250 xgおよび室温で2分間遠心分離する。上清を捨て、20％FBSを含む10mLのDMEMにペレットを再懸濁する。
    5. 濾過し、40μmの細胞ストレーナーを用いて細胞塊を捨て、単一の細胞を回収する。血球計数器を用いて単一細胞を計数する。
    6. 細胞を250 xgおよび室温で2分間遠心分離する。 100μLの軟骨形成分化培地（CDM）を含む15mLコニカルチューブ中にペレットあたり上清および種子3×10 5細胞を除去する。
    7. ペレット形成のために、細胞を5分間、680×gおよびRT。
      注：ペレットは、軟骨形成性のペレットの分化の間、15mLの円錐管中に維持される。
    8. 37℃および5％CO 2で一晩細胞をインキュベートする。
    9. 2〜3日ごとにCDMを変更してください。 3日以内に、ペレットは平らで回転楕円体の形態を示す。 37℃および5％CO 2で21日間ペレットを維持する。

2.染色による軟骨形成ペレットのキャラクタリゼーション

  1. 軟骨形成包埋
    1. 包埋する前に、58℃でパラフィンを調製し、溶解する。
    2. ペレットを1 mLの4％パラホルムアルデヒドに1.5 mLチューブで室温で2時間固定する。
      注意：パラホルムアルデヒドは非常に有毒である。眼、皮膚、粘膜との接触を避ける。暴露を最小限にし、吸入を避ける。
    3. ガセットの1つの層をカセットに置き、ピペットを使用して固定ペレットを移す。折りたたむことでペレットを覆うカセット蓋を閉じます。
    4. 100mLの70％エタノール（EtOH）中で10分間ずつ2回脱水を開始する。 80％および95％EtOH中で連続的に10分間洗浄することによりペレットを脱水する。
    5. ペレットを10分間100％EtOHに移す。新鮮なEtOHで3回繰り返します。
    6. 「清澄化」するために、溶液をEtOHとキシレンの100mL、1：1混合物と交換し、続いてEtOHとキシレンの1：2混合物をそれぞれ10分間交換する。ペレットを100％キシレンで2回、それぞれ10分間インキュベートすることによって残りのEtOHを除去する。
    7. パラフィン浸透のために、ペレットを連続キシレンおよびパラフィン混合物中でインキュベートする。パラフィン浸透プロセス全体を58℃で実施する。ペレットを100mLのキシレンとパラフィンの2：1混合物に30分間インキュベートする。
    8. 溶液をキシレンとパラフィンの1：1混合物100mLと交換し、30分間インキュベートする。
    9. この溶液をキシレンとパラフィンの1：2混合物100mLに交換し、30分。
    10. 最終的な浸潤のために、ペレットを100％パラフィンの最初の浴に移し、2時間インキュベートする。
    11. ペレットを100％パラフィンの第2の浴に移し、58℃でO / Nをインキュベートする。
    12. 翌日、ピンセットを使ってペレットを金型に静かに移す。パラフィンディスペンサーからモールドにパラフィンを加えます。パラフィンを4℃で30分間固めます。
    13. 切片を7μmでスライスし、切片をスライド上に移す。スライドを一晩乾燥させ、使用準備が整うまでRTで保存します。
  2. スライドの準備
    1. 100％、90％、80％、および70％EtOHの各100mLを順次5分間ずつ移動させることにより、スライドを脱パラフィンする。
    2. スライドガラスをガラス瓶に入れ、水道水で5分間すすぎます。
  3. アルシアンブルー染色
    1. スライドを1％アルシアンブルー溶液50 mLに30分間インキュベートする。
      NOTE：アルシアンブルーを3％酢酸溶液で希釈する。酢酸を用いてpHを2.5に調整する。
    2. スライドガラスをガラス瓶に入れ、水道水で2分間すすいでください。
    3. スライドを脱イオン水（DW）ですすぎ、核高速赤色溶液で2分間対比染色する。
    4. スライドをガラス瓶に入れ、水道水で1分間すすいでください。
    5. 2.3.5）手順2.6でスライドを脱水してマウントします。
  4. トルイジンブルー染色
    1. スライドを50mLのトルイジンブルー溶液で4分間インキュベートする。
    2. スライドガラスをガラス瓶に入れ、水道水で5分間すすぎます。
    3. 手順2.6でスライドを脱水してマウントします。
  5. 免疫組織化学的染色
    1. 内因性ペルオキシダーゼをブロックするために、スライドを3％H 2 O 2中で15分間インキュベートする。
    2. 1：100に希釈した一次抗体（抗COL1A1および-COL2A1）200μLをトリスバスライドに1％ウシ血清アルブミン（BSA）と5％正常ヤギ血清（NGS）を含む生理食塩水（TBS）を加え、4℃でO / Nをインキュベートする。
    3. 翌日、スライドをガラス瓶に入れ、0.1％ポリソルベート20（TBST）を含む50mLのTBSでそれぞれ5分間3回洗浄する。
    4. スライドに2次抗体（ヤギ抗ウサギIgG抗体、1％BSAおよび5％NGSを含有するTBS中に1：200希釈）200μLを適用し、RTで40分間インキュベートする。
    5. ガラス瓶にスライドを置き、それぞれ5分間50 mLで3回洗浄する。
    6. シグナル増幅のために、HRP結合ストレプトアビジン溶液をスライドにアプライし、10分間インキュベートする。
    7. ガラス瓶にスライドを置き、それぞれ5分間50 mLで3回洗浄する。
    8. DAB-ペルオキシダーゼ基質溶液を混合し、各スライドに200μLの溶液を適用し、1分間インキュベートする。
    9. スライドガラスをガラス瓶に入れ、水道水で5分間すすぎます。
    10. 対比染色Mayerのヘマトキシリンで1分間処理した。
    11. DWでスライドを洗う。
    12. 手順2.6でスライドを脱水してマウントします。
  6. 脱水とマウント
    1. 70％、80％、90％、および100％EtOHの各100mLを順番に移動させてスライドを脱水する。
    2. スライドを1分間、キシレンの2回の変更に浸漬する。
    3. カバースリップに50μLのマウント溶液を加え、スライドを上に置きます。

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結果

この研究では、EB細胞から伸長細胞を誘導することにより、CBMC-hiPSCから軟骨形成性ペレットを作製した。多分化能が高いことが確認されたCBMC-hiPSCを用いて軟骨形成分化を誘導した11 。我々のプロトコルの簡単なスキームを図1Aに示す 。分化の前に、iPSCコロニーを拡大した（ 図1B ）。拡大されたiPSCをEBとして組み立て、分化を開始した（ 図1C ）。生成したEBをゼラチンコートディッシュに付着させて、伸長細胞を誘導した（ 図1D ）。次いで、伸長細胞を回収し、軟骨形成性のペレットを生成するために使用した。 21日の分化後、小さなビーズ様軟骨形成性のペレットを得て、さらなる特徴付けに使用した（ 図1E ）。

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ディスカッション

このプロトコルは、CBMCからhiPSCを首尾よく生成した。ヤマナカ因子24を含むセンダイウイルスベクターを用いて、CBMCをhiPSCに再プログラミングした24 。分化には3例を用い、すべての実験でこのプロトコールを用いて軟骨原性ペレットを作製した。多くの研究により、hiPSCの軟骨細胞への分化に関するプロトコールが報告されている25,26,27,28。しかし、CBMC-hiPSCsの軟骨の再生および回復の候補の使用を確認するためには、さらなる研究が必要である。

軟骨形成は、様々な体細胞型11,25,26,27,29から生成されたhiPSCを用いて確認された。多くのレポート再プログラムに使用される体細胞の起源がhiPSC30,31,32,33の分化結果に影響を及ぼし得ることを示す。臍帯血は、HSCおよびMSCが豊富な源である。血液細胞やMSCのような臍帯血由来の細胞の違いに関する報告はない。しかし、以前の研究では、関節軟骨細胞由来hiPSCは、臍帯血または皮膚線維芽細胞から産生されたh...

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開示事項

著者は何も開示することはない。

謝辞

この作業は、韓国保健医療技術研究開発プロジェクト（HI16C2177）の助成を受けて行われました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
プラスチック製品
100 mm ディッシュTPP93100
6 ウェルプレートTPP92006
50 mL コーニカルチューブSPL50050
15 mL コーニカルチューブSPL50015
10 mL ディスポーザブルピペットファルコン7551
5 mL使い捨てピペットファルコン7543
12 ウェル プレートTPP92012
名前会社カタログ番号Description
E8 Medium Materials
DMEM/F12, HEPESLife Technologies11330-057E8 Medium (500 mL)
重炭酸ナトリウムLife Technologies25080-094E8 Medium (Conc.: 543 μg/mL)
亜セレン酸ナトリウムΣ AldrichS5261E8 Medium (濃度:14 ng/mL)
ヒトトランスフェリンΣ アルドリッチT3705E8 ミディアム (Conc.: 10.7 μg/mL)
ベーシック FGF2ペプロテック100-18BE8 ミディアム (濃度:100 ng/mL)
Human InsulinLife Technologies12585-014E8 Medium (濃度: 20 μg / mL)
ヒトTGF&β;1Peprotech100-21E8 Medium (Conc.: 2 ng/mL)
アスコルビン酸Sigma AldrichA8960E8 Medium (濃度:64 μg/mL)
DPBSLife Technologies14190-144
ビトロネクチンLife TechnologiesA14700
ROCK 阻害剤Sigma AldrichY0503
NameCompanystrongカタログ番号Description
品質管理材料
18 mmカバーガラス優れたHSU-0111580
4%パラホルムアルジヒド技術&イノベーションBPP-9004
Triton X-100BIOSESANG9002-93-1
ウシ血清アルブミンベクターラボSP-5050
抗 SSEA4 抗体ミリポアMAB4304
アンチ Oct4 抗体サンタクルスSC9081
抗 TRA-1-60 抗体ミリポアMAB4360
抗 Sox2 抗体Biolegend630801
抗 TRA-1-81 抗体ミリポアMAB4381
抗 Klf4 抗体Abcamab151733
Alexa Fluor 488 ヤギ抗マウス IgG (H+L) 抗体モレキュラープローブA11029
Alexa Fluor 594 ヤギ抗ウサギ IgG (H+L) 抗体モレキュラープローブA11037
DAPI分子プローブD1306
Prolong gold退色防止試薬InvitrogenP36934
4% パラホルムアルジヒドTech &イノベーションBPP-9004
Tween 20BIOSESANGT1027
ウシ血清アルブミンベクターラボSP-5050
抗コラーゲンII抗体abcam ab347121:100
アルシアン ブルーシグマ アルドリッチA3157-10G
ファスト グリーン FCFシグマ アルドリッチF7252-25G
サフラニン Oシグマ アルドリッチ090m0039v
核 ファスト レッドAmericanmastertechSTNFR100 
キシレン・デュクサン115 
エタノールデュクサン64-17-5
メイヤーのヘマトキシリン溶液和光純薬工業LAK7534
DAPVECTOR LABORATORIESSK-4100
スライドガラス コーティングヒョンイル Lab-MateHMA-S9914
TrizolInvitrogen15596-018
クロロホルムシグマAldrich366919
イソプリピルアルコールミリポア109634
エタノールDuksan64-17-5
RevertAid First Strand cDNA Synthesis kitThermo ScientficK1622
NameCompanyカタログ番号説明
strong<>軟骨原性分化材料
DMEMLife Technologies11885軟骨原性培地成分(500 mL)
ペニシリンストレプトマイシンLife TechnologiesP4333軟骨原性培地成分(濃度:1%)
アスコルビン酸シグマアルドリッチA8960軟骨形成培地成分(Conc.: 64 μg/mL) 
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)Life Technologies11140-050軟骨形成培地成分 (Conc.: 100 mM)
rhBMP-2R&D355-BM-050軟骨形成培地成分(濃度:100 ng/ml)
組換えHman TGF-β3R&D243-B3-002軟骨原性培地成分 (濃度:10 ng/ml)
KnockOut Serum ReplacementLife Technologies10828-028軟骨原性培地成分 (濃度: 1%)
ITS+ PremixBD354352軟骨原性培地成分 (濃度: 1%)
デキサメタゾン-水溶性 Sigma AldrichD2915-100MG軟骨原性培地成分 (濃度:10-7 M)
GlutaMAX SupplementLife Technologies35050-061軟骨原性培地成分 (濃度: 1%)
ピルビン酸ナトリウム溶液Sigma AldrichS8636軟骨原性培地成分 (Conc.: 1%)
L-プロリンSigma AldrichP5607-25G軟骨原性培地コンポーネント (40 μg/ml)

参考文献

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