方法論記事

メソッドおよびアデノ随伴ウイルス ラットの静脈内投与と中枢神経系の伝達の評価のためのヒント

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DOI：

10.3791/55994

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2017年8月25日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pharmacology, Toxicology, and Neuroscience, Louisiana State University Health Sciences Center, 2Department of Molecular & Integrative Physiology, University of Kansas Medical Center

この記事について

サマリー

ラットにおける広域中枢神経系遺伝子導入法を説明します。この例では目的は脊髄全体に影響を与える疾患を模倣するためです。広範な伝達は一時、周辺の管理からして中枢神経系治療用タンパク質を提供する使用できます。

要約

アデノ随伴ウイルス (AAV) ベクターでは、定期的に空間の短い回文繰り返し (CRISPR)、オプトジェネティクス、cre lox ターゲットなどをクラスター化、神経科学の主試薬です。本稿の目的は、AAV の尾静脈注射を介してラットにおける広大な中枢神経系 (CNS) 遺伝子導入を試みている調査官を支援するためにです。広範な病理学の条件に関連する大規模な式をその大きいサイズとマウスと比較された人間に生理学的な類似性のため重要なラット モデル。この例のアプリケーションでは、大規模な神経伝達を使用して、筋萎縮性側索硬化症 (ALS)、脊髄全体に影響を与える神経変性疾患を模倣します。効率的な大規模な中枢神経系の情報伝達は、前臨床試験で治療上の蛋白質の要因を提供する使用できます。数週間の後注入式間隔の後、伝達の効果が評価されます。緑色蛍光タンパク質 (GFP) の制御ベクトルの小脳の GFP の量は基本的なイメージング プログラムによって、迅速かつ確実に推定されます。ALS によって誘導される運動疾患表現型関連タンパク質 transactive 応答 43 kDa (TDP-43) の DNA 結合タンパク質は、赤字脱出反射と rotarod で獲得しています。疾患モデル作製、遺伝子治療以外に、ここで説明した大規模な遺伝子ターゲットの潜在的な用途があります。このメソッドの利用拡大は、神経科学と川和で仮説を迅速に役立ちます。

概要

組換えアデノ随伴ウイルス (AAV) ベクターでは、あまり生体内でのニューロンの伝達効率がよく、中枢神経系研究のための不可欠なツールです。AAV のベクトルが異なる遺伝子とタンパク質アイソ フォーム、さまざまな組織、別のホスト種、および管理の別の路線を勉強のため非常に汎用性。周辺は、比較的非侵襲、ニューロン中枢神経系全体を最初に変換する静脈注射の記載・ フォウストらとドゥケらによってマウスに AAV を管理ことができますたとえば、(を参照してくださいゼウス紙 Gombash et al.(2014 年))。1,2,3この遺伝子配信アプローチをどちらかの緑色蛍光タンパク質 (GFP) を効率的に表現するラットの使用または ALS 関連タンパク, transactive 応答 43 kDa (TDP-43) 中枢神経系の DNA 結合タンパク質。4,5,6,7,8,9ラットでの作業は、ラットの代謝および生理学的パラメーターはマウスと比べて人間に近い、行動および毒性学的試金のラットのために特別に設計されていますので重要です。さらより多くの遺伝子組み換えラット線が可能になっている AAV 遺伝子伝達研究で利用可能します。

メソッドは、ラットと成果の迅速で信頼性の高い定量広大な中枢神経系遺伝子伝達の詳細です。大規模な中枢神経系の情報伝達は、TDP 43 脊髄全体に表現することによってラットの ALS の症状を模倣する使用されます。メソッドが使用されるジャクソンら若いラットに TDP 43 ベクトルの尾静脈注射6,8,2 つの方法で獲得した TDP 43 による運動障害が数週間後、 9 : 反射と rotarod と、デイトンら・ ジャクソンらとエスケープ5,6,7,9制御 GFP ベクトル、事後分析での小脳の蛍光の面積はジャクソンらにおいて伝達効率の指標として計算は6,8小脳の解析周辺遺伝子デリバリー後中枢神経系伝達性の迅速かつ信頼性の高いインデックスをあると証明したし、さまざまな周辺機器、中央へ遺伝子導入を試みるアプローチを適用する必要があります。

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プロトコル

すべてのプロシージャ適切な NIH ガイドラインに従った。すべてのプロシージャは続く動物愛護とシュリーブ ポートにルイジアナ州立大学健康科学センターで使用の委員会によって承認された動物のプロトコルです。この手順で使用された 6 週齢の雌ラット

。

1 です。 必要なベクトルの用量/ボリュームを決定する

  1. ラットに注入すると、各動物に必要なウイルスのベクトルの量を決定するベクトル準備の力価 (集中) に基づく計量。以前ラット中枢神経系における効率的な表現に成功しているベクトルの用量を使用 (ジャクソン ら を参照してください 。6).
    注: AAV9 TDP-43 または AAV9 GFP、典型的な線量は 3 x 10 13 - 1 x 10 14 ベクトル ゲノム/kg の間。6 週齢の若いラットの重さ約 150 g.
  2. は、体系的な比較のためのすべての動物の 1 kg あたり等価線量です。ボリュームは標準的なお勧めの注入量 (250 グラムのラットの 250-500 μ L) を超えないことを確認します。典型的な注入量は若いラットに 200 μ l.

2。作業ステーションを準備する

  1. すべての必要な消耗品を収集: ピペット先端およびマイクロ ピペット動物、動物、ガーゼ (1 頭につき 2-3) あたり 1 つのアルコール準備パッドあたり正方形 (約 5 x 5 cm) の 1 つのパラフィン フィルム
    2. 。
  2. は、70% エタノールで表面をクリーニングして作業面を準備します。ダウン (~ 37 ° C) の低に設定温度に加熱パッドを配置します。加熱パッドの上にベンチのパッドを配置します
    3. 。
  3. は、ガス麻酔 (イソフルラン) を準備します。十分な酸素とガス麻酔の手順を確認します。70% エタノール誘導商工会議所と麻酔マスクをきれいにし、ベンチのパッドに麻酔マスクを配置します
    4. 。

3。ベクターの準備

  1. 室温でベクトルを解凍し、各動物のための 1 つの滅菌遠心チューブのラベルします
    2. 。
  2. ピペット AAV のボリュームで決定適切なチューブに 1.1 をステップし、必要な注入量 (ここでは、200 μ l) までボリュームを持って一日リンガー ' s ソリューションまたは生理食塩水
    3. 。
  3. パルス渦 1 〜 2 秒のためのサンプルとしてパルス 5 遠心管の底に、サンプルを持参して s
    4. 。
  4. チューブとパラフィン膜の角にラットの総注入量をピペットで移しなさい
    5. 。
  5. 1 mL シリンジに 30 ゲージ針を配置します
    6. 。
  6. パラフィン フィルムのベクターに下向き傾斜面と針の場所。すべてのウイルスは、針と注射器までシリンジのプランジャーを戻るに引き抜きます。練習すれば簡単になる針の中に空気の泡を描画を避けるために注意してください
    7. 。

4。ラットを準備

  1. 1 L/min まで酸素を切りイソフルラン麻酔を 5% に設定します。すべての接続ホースとバルブの向きを確認して誘導室にガス麻酔が流れることを確認します
    2. 。
  2. ラットが応答するまで、ガス麻酔誘導室約 3 分でラットを配置します
    3. 。
  3. は、つま先をつまんで麻酔の十分な深さを確保します。つま先ピンチ後足または脚の運動ができません
    4. 。
  4. イソフルラン麻酔を麻酔の維持のための 2% に削減し、麻酔は麻酔マスクに流れているので、活栓を調整します
    5. 。
  5. ラットの場所 ' s 麻酔マスクの鼻、それがその側に横たわっているラットを調整します
    6. 。
  6. 外側尾静脈を識別します
    。 注: 外側尾静脈約 10 と 2 o にある ' 12 尾の背の上部に時計 o ' 時計。その側に横たわっているラット、外側尾静脈中に直面する必要があります
  7. は、アルコール パッドで準備注入領域を拭いてください。注射部位は尾の長さを 3 分の 2 です
    8. 。

5。ベクトルを注入

  1. をしっかり尾わずか 1 本指による注入領域の上外側尾静脈経由で直接; これは静脈を拡張します
    2. 。
  2. ベベル上向き、同じ方向に見える尾静脈針を合わせます
    3. 。
  3. しっぽを押さえて尾静脈を押すと他の手を避けるために偉大な世話ながら尾静脈を皮膚を突き刺し
    4. 。
  4. 通常血流を許可するように尾静脈からの圧力を解放します
    5. 。
  5. は、静脈に針を移動します。針は尾静脈を穿刺するように、少し引きプランジャー。針が静脈の血液が針に流れます。
    1. 針必要に応じて位置を変更します。その後、針を安定させるために注射部位の下に注射部位の上で手を動かすし、尾に対して注射器の端を保持します
      2. 。
  6. 尾 (約 20 μ L/s) にベクトルをゆっくり挿入します
    。 注: 静脈は、ベクトルの流れるとして色を失う可能性があります。ソリューションが外静脈注入された標識は、ブレブ、ベクトルを注入すると、皮膚、または抵抗のブランチングします。練習では、余分な血管の露出を最小限に抑えることができます
    7. 。
  7. ベクターを投与されている後、ラットから針を除去し 30-60 の出血を止めるために注射部位に対してガーゼのパッドを押す

6。クリーンアップ

  1. オフ、イソフルレン麻酔と酸素。それが意識を取り戻すまでにラットを監視し、そのケージに戻します
    2. 。
  2. は、シャープス コンテナーのすべての針を慎重に配置します。可能性のある適切なバイオハザード容器に AAV で汚染されている他のすべてのディスポーザブル材料の処分します。70% エタノール ワーキング ステーションをきれいします
    3. 。

7。後肢エスケープ反射を評価

注: 後肢欠損が生じますベクター投与量に応じて、TDP 43 遺伝子導入後 2 ~ 6 週間

。
  1. の破片の平らな面クリアで 2 本の指でつかむラット ' s 本体から約 2 cm の尾します。前肢は、ラットの腹部の下側を見ながらぶら下がっているまでにラットをそっと持ち上げます。
    1. 遺伝子導入後の実験経過を通じて毎週プロシージャを実行 (例えば、遺伝子導入後 12 週間まで).
      注: もこの方法で前肢の赤字をスコアが、後肢欠損は使用されるベクトル量によっては、このモデルで発生する可能性が高いです
      2. 。
  2. 、10 時に正中線に向かって 1 つまたは両方の後肢を握り締める場合 10 s. メモのため、後肢を観察 s.
  3. 繰り返しこのテストは 30 で 3 回の合計 s トライアルの間。1 つまたは両方の後肢は、3 つの試験のそれぞれの clenched は、ラットは、運動機能障害を示しています。一貫性のあるすべての 3 つの試験で食いしばりがある場合、現在どちらかの片側または両側の後肢の赤字 (ノート) で手動でデータを記録します
    4. 。

8。Rotarod の運動機能を評価

  1. 、rotarod を設定する、rotarod の下にあるベンチのパッドを配置し、(~0.3 回転/秒で速度増加) が 2 分間かけて 4 40 回転/分 (rpm) に加速度を設定します。12 週間の時間コース 2、4、8、被験者を実行し、遺伝子の後 12 週間転送します
    2. 。
  2. を許可します。20 分テスト部屋に順応するラット
    3. 最初に、rotarod を使用して、まず 4 rpm のスピードで rotarod を起動し、rotarod のラットを配置するラットを訓練するには、
  3. 。徒歩で 4 回転、1 回転してから加速を開始ラットとそれが落ちるまで、rotarod の上を歩くラットを許可します。ラット 40 少なくとも一貫して歩くことができるまでトレーニングを続ける s。この方法で健康な若いラットに容易に訓練されます。
    1. 顕著な運動障害があるラットの場合、40 の落下にベースライン遅延を達成するからラットを防ぐことができますを s、ラット rotarod 得点を開始する前に 3-5 トレーニングの試みを提供します
      2. 。
  4. Rotarod テストを開始する、rotarod のラットを配置し、rotarod の加速を開始。ラットが rotarod; から落ちる時間に注意してください。これは、秋に待ち時間です。ラットは、120 の後、rotarod に残っている場合 s、この時点でのセッションをキャップ、rotarod からラットを削除、120 の秋の遅延時間を記録 s.
  5. は、3 つの試験の合計 2 回のテストを繰り返します。疲労の影響を最小限に抑えるために離れて試験、少なくとも 5 分をスペースします。3 つの試験の点数の平均値します。健常者のラットは典型的にはの落下に平均待機時間 > 40 s.
  6. ケージに戻ってラットを置き、rotarod と周辺地域の 70% エタノールをきれいします
    7. 。

9。小脳における GFP 発現定量化

  1. ラットを麻酔し、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) とし、4% パラホルムアルデヒドを灌流します。脳と脊髄の解剖し、組織を固定液に一晩浸して、30% ショ糖液に移動します。平衡後、カット ステージ 4 , 5 , 6 を凍結との滑走式ミクロトームで 50 μ m のコロナ セクション
    2. 。
  2. は、小脳虫部、小脳の中央の葉には等間隔に配置する小脳の 3-6 セクションを選択します。信号を最大化する GFP の蛍光ラベルします。1: 500 で GFP の一次抗体を使用し、1: 300 4 , 5 , 6 の希釈でアレクサ 488 共役二次抗体を使用します
    。 注: を参照してください 4 , 5 , 6 サンプリングの詳細についてを参照、ステイニングします
    3. 。
  3. は、顕微鏡を用いた低倍率レンズで興味の定義された領域内の各セクションを photomicrograph します。使用 2.5 × 対物 (エヌ 0.12) とフィルター設定 10、450-490/515-565 励起/蛍光)。カメラの設定のまま (露出時間、例えば、2 s) 分析するサンプルを横切って同じです。として保存します。TIF ファイル
    4. 。
  4. は、広く利用可能なサイオン イメージ プログラムで顕微鏡写真を開く; 2 つのウィンドウが開きます。閉じるウィンドウとして示される " インデック スカラー ".
  5. 選択 " オプション "、その後 " 密度 SliceŔ 色合いの範囲はルックアップ テーブル (LUT) ウィンドウで赤色に表示されます。ウィンドウで特定 GFP ラベルのみを入力するカーソルを使用し、非固有の背景画像でピックアップを開始したときを停止します
    。 注: これを定量化する顕微鏡に蛍光の領域を強調表示します。設定は、具体的にはのすべての目に見えない蛍光セルをキャプチャする最適化必要があります。練習では、このメソッドは正確に特定の蛍光を強調します
    6. 。
  6. 蛍光領域を測定する前にまず正しい単位 (ピクセル) でテストの測定がされるように。これを行うには、クリックして " 分析 "、その後 " セット ScaleŔ4 行目が言う必要があります " 単位 "。ドロップ ダウン リストから選択をクリックしてピクセル単位で測定するためのピクセル " [ok] "。解析オプションを切り替える " 含めるインテリア穴 " 分析のセルの体全体を含めることを確保するためです
    7. 。 蛍光の面積を測定する
  7. をクリックして " 分析 " し " メジャー "。この値を表示するをクリックして " 分析 " をクリックして " ショー ResultsŔ結果ウィンドウが表示されます。というラベルの見出しの下での蛍光の面積測定になります " エリア ".
  8. の測定の間で標準化するように、LUT の] ウィンドウで強調表示されている値を変更しないでください
    9. 。
  9. すべての測定値が記録されている、かつては平均各動物 (動物あたり 3-6 節) からの値です。適切な統計テストを使用すると、グループ間導入されたエリアを比較します。 6

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結果

TDP 43 誘導運動障害が生じれば、AAV tdp-43 使用 (図 1) 投与量に応じて 2-6 週間以内。部分的にまたはない障害; 失敗した尾静脈注射になりますAAV の効果血流に到達する必要があります。AAV GFP の成功した射出脳と脊髄を通じて GFP 発現ベクター投与量依存的になります。ドライブ式に、サイトメガロ ウイルスの鶏 β アクチン ハイブリッド プロモーター CAG プロモーターとしても知られている強力な組換えプロモーターを用いた中枢神経系だけでなく、肝臓や心臓などの他のいくつかの組織での効率的な表現があります。4,5,10内ラット中枢神経系、AAV9 や AAV の PHP を使用する場合。B ベクトル、パターンは主に神経伝達とだけ疎、散発的なグリア伝達です。4

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ディスカッション

AAV ベクターの様々 な配送ルートをテストされている: イントラ実質、内 cerebroventricular、内莢膜、静脈内、鼻腔内、筋肉内、等。各ルートは、特定の利点と欠点があります。成人ラット AAV の尾静脈投与は中枢神経系の一貫性のある情報伝達を実現するための信頼性の高い方法です。末梢注入方法注入カニューレの中枢神経組織への導入を回避、低侵襲。このメソッドによって達成することができます効率的な中枢神経系式は、テクニックの最大の利点です。他の実用的な利点は注入法は非常に高速 (開始から終了までの動物につき約 10 分) と、尾静脈注射は高度な技術ではなく、したがってすぐにマスターすることができます。確かに、主な欠点は高価ベクトルの多くが必要ですか、AAV の準備が 1 x 1013ベクトル ゲノム/ml 以下なら可能性の問題となります。ターゲット設定機能ベクトル化と有利な将来は、遺伝子治療臨床研究に与えられた遺伝子デリバリーは、末梢ルートおよびこうして比較的非侵襲的、このアプローチ可能性があります。一方、もっと直接内脳脊髄液注射が有利前臨床および臨床的アプローチの 2 つの理由: より限られたベクトルの広...

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開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

この作品は、ALS 協会、Karyopharm ・ セラピューティクス社、Meira GTx、感謝しております、トーマス ・ ローソンから ALS 研究慈善寄付によって賄われていた。アドバイスやトレーニング、エリスの果樹園とドナ バーニーに感謝します。JAS が嘘をついた財団によって支えられたし、健康の国民の協会は GM103418 を付与します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
スケールPelouzeSP5
Nalgene バケツThermo Scientific120140004000 mL
微量遠心チューブUSA Scientific1615-5500
乳酸リンガー液Baxter Healthcare0338-0114-04
ミニボルテクサーフィッシャーサイエンティフィック128101
遠心分離機エッペンドルフ22624415
ラボラトリーフィルムBemisPM996
1 mL シリンジBD30962625g 針が付属 attached.
注射用 27-30g 針と交換
30g 針BD305106
イソフルランPiramal Healthcare66794-013-25イソフルラン USP 250 mL
麻酔マスクKopf Instruments906
ガーゼヘンリー・シャイン100-25242インチ x 2インチ (5cm x 5cm)
ピペットチップUSA Scientific1111-0816
マイクロピペットギルソン4642080
ガス麻酔気化器SurgiVet4214322クラシック T3
ガス麻酔スカベンジャーSurgiVet32373B10Enviro-PURE
ヒーティングパッドシアーズ17280
ベンチパッドVWR56617-006
ロタロッドPanlab/ハーバード 装置76-0772ラット 4匹/マウス
70% エタノールデコンラボラトリーズ社2401140プルーフ
70% イソプロパノールVWR89108-160
サイオンイメージサイオンコーポレーション
GFP タグ ポリクローナル抗体InvitrogenA11122一次抗体 - 1:500 希釈
AlexaFluor 488InvitrogenA11070二次抗体 - 1:300 希釈
Axioskop 40 顕微鏡ツァイス

参考文献

  1. Foust, K., Nurre, E., Montgomery, C., Hernandez, A., Chan, C., Kaspar, B. Intravascular AAV9 preferentially targets neonatal neurons and adult astrocytes. Nat. Biotechnol. 27 (1), 59-65 (2009).
  2. Duque, S., et al. Intravenous administration of self-complementary AAV9 enables transgene delivery to adult motor neurons. Mol. Ther. 17 (7), 1187-1196 (2009).
  3. Gombash Lampe, S., Kaspar, B., Foust, K. Intravenous injections in neonatal mice. J. Vis. Exp. (93), e52037(2014).
  4. Wang, D., et al. Expansive gene transfer in the rat CNS rapidly produces amyotrophic lateral sclerosis relevant sequelae when TDP-43 is overexpressed. Mol. Ther. 18 (12), 2064-2074 (2010).
  5. Dayton, R., et al. Selective forelimb impairment in rats expressing a pathological TDP-43 25 kDa C-terminal fragment to mimic amyotrophic lateral sclerosis. Mol. Ther. 21 (7), 1324-1334 (2013).
  6. Jackson, K., Dayton, R., Klein, R. AAV9 supports wide-scale transduction of the CNS and TDP-43 disease modeling in adult rats. Mol. Ther. Methods Clin. Dev. 2, 15036(2015).
  7. Jackson, K., et al. Preservation of forelimb function by UPF1 gene therapy in a rat model of TDP-43-induced paralysis. Gene Therapy. 22 (1), 20-28 (2015).
  8. Jackson, K., Dayton, R., Deverman, B., Klein, R. Better targeting, better efficiency for wide-scale neuronal transduction with the synapsin promoter and AAV-PHP.B. Front. Mol. Neurosci. 9, 116(2016).
  9. Jackson, K., et al. Severe respiratory changes at end stage in a FUS-induced disease state in adult rats. BMC Neuroscience. 17 (1), 69(2016).
  10. Xu, L., et al. CMV-beta-actin promoter directs higher expression from an adeno-associated viral vector in the liver than the cytomegalovirus or elongation factor 1 alpha promoter and results in therapeutic levels of human factor X in mice. Hum Gene Ther. 12 (5), 563-573 (2001).
  11. Jackson, K., Dayton, R., Klein, R. Gene vector "magic bullet": targeted expression in the central nervous system after peripheral delivery using the synapsin promoter. Expert Opin Ther Targets. 20 (10), 1153-1154 (2016).
  12. van Hulst, R., Klein, J., Lachmann, B. Gas embolism: pathophysiology and treatment. Clin. Physiol. Funct. Imaging. 23 (5), 237-246 (2003).

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