植物のディフェンシンは、病原体に対する植物の防衛のために重要な役割を果たします。アクション (MOA) の彼らのモードについての抗真菌剤としてこれらの抗真菌ペプチドの有効利用は重要なです。ここでは、これらのペプチドの MOA の重要な側面を研究する生細胞イメージング法を説明します。
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この記事について
サマリー
要約
小さなシステイン豊富なディフェンシンは、ホストの防衛ペプチドすべて植物で、現在の最大のグループの一つです。多くの植物のディフェンシンは、病原糸状菌の広域スペクトルに対する抗真菌活性が強力な体外を展示し、したがって作物の抗真菌剤として使用される可能性があります。植物のディフェンシンの疾病の可能性を活用するために、アクション (MOA) のメカニズムを解明することが重要です。高度の顕微鏡検査の技術の出現で、住セルイメージ投射は植物のディフェンシンの抗真菌の MOA のダイナミクスを理解するための強力なツールになりました。ここでは、共焦点顕微鏡を用いた生細胞イメージング法は生体の蛍光染料との組み合わせで 2 つの蛍光に分類された植物のディフェンシン (MtDef4 と MtDef5) を使用して説明します。このテクニックは、リアルタイムで可視化および真菌細胞に MtDef4 と MtDef5 の内面化の動的イベントの分析に使用できます。重要なは、この試金は内面化動力学、エントリのモードとこれらのペプチドの細胞内局在性を含む情報の富を生成します。他の細胞生物学的ツールと一緒にこれらのメソッドは、ダイナミクスとこれらのペプチドの MOA の複雑さに重要な洞察力を提供しています。これらのツールは、別の菌に対するこれらのペプチドの MOA を比較する使用できます。
概要
植物は微生物植物病原体1に対する防衛のための洗練された自然免疫系進化してきました。彼らは多数の遺伝子でエンコードされたホスト防衛ペプチド推定抗菌2の表現します。確かに、これらのペプチドの多くは抗菌活性の in vitro3を表示します。ディフェンシンは、植物王国4のホストの防衛ペプチドの最も大きいグループの 1 つを構成します。これらのシステインに富む、カチオン性ペプチド真菌に対して強力な成長抑制活性を示す、マイクロモル濃度でこれら病原体5,6に対する防御の最初の行の 1 つを表す oomycete の病原体。彼らの強力な抗真菌活性のためディフェンシンを agribiotechnological 耐病性作物を生成するアプリケーションで利用できます。いくつかの植物のディフェンシンの構成過剰発現トランスジェニック作物6温室効果とフィールド テストでの耐病性を強化する示されています。作物保護のための効果的なツールとしての可能性を完全に活用するためにこれらの抗真菌ペプチドの作用 (MOA) のメカニズムを解明することが重要です。しかし、これらの植物のディフェンシンの M....
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プロトコル
1. fluorophores が付いているディフェンシンのラベリング
- 生きている細胞の中の抗菌特性吸収、ディフェンシンの局在に最小限の影響を持つ蛍光体を選択します。
注: 最適な蛍光を選択する特定の実験的な目的によって異なります。スペクトル的性質、光安定性、サイズ、蛍光体の充電も考慮する必要があります。 - ラベルは、ラベリング キット商用ベンダーから利用できる適切なペプチドを使用して選択した蛍光のディフェンシン。また、蛍光標識ディフェンシンを化学合成します。本研究では DyLight550 と MtDef5 がディフェンシン ラベル製造元のプロトコルとテトラメチル ローダミン (タムラ) によるとキット商業ラベリングを使用-商業的化学的に合成されたラベル付き MtDef4 ディフェンシンします。
注: お勧め (特に短いペプチド アミノ酸 50 以下) の化学的合成蛍光タグ付きペプチドを使用し、それらが蛍光体に最小限の影響をようにペプチドの N 末端または C 末端残基に付けることができるので、抗菌作用。以上の 3 つのジスルフィド結合を持つ長鎖ペプチドの合成は困難です。この場合、そのペプチド ラベリング キット適切な市販ペプチドを用いた最適な蛍光でラベルを付けることをお勧めします。 - ラベル付きのディフェンシンの抗菌活性の in vitroテストし、調査する菌類に対する最小発育阻止濃度 (MIC) を決定します。
注: 本研究では、....
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結果
ライブを追跡および比較インターナライゼーションと 2 つのディフェンシン、MtDef4、MtDef5、ウマゴヤシ分子; からの細胞内局在細胞イメージングを行った真菌の細胞。一方、MtDef5 は、Dylight550 が付いていた TMR MtDef4 化学的に合成した (Dylight550-MtDef5)。分生胞子膜の選択的色素 FM4 64 との組み合わせでいずれかのディフェンシンを添加されました。図 1は、TMR MtDef4 では、 n. の crassaのF. 麦類と比較しての様々 な輸送経路を示しています。N. の crassaの FM4 64 共同、ディフェンシンとローカライズされていないが、むしろ液胞内に隔離されます、ディフェンシンの膜の汚れ。F. 麦類で、他の一方で、TMR MtDef4 任意のバインドされている特定の膜細胞小器官内でローカライズされていないが (.......
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ディスカッション
この研究では、信頼性の高い蛍光に分類された真菌ディフェンシンを使って生細胞イメージング方法論は、真菌細胞にこれらのペプチドの内面化の動力学を調査し、その細胞内ターゲットを決定する記述されていた。このメソッドは、時間的、空間的にディフェンシンと真菌細胞の相互作用のダイナミクスを可視化する強力なツールです。
様々 な方法は、内面化と植物のディフェンシン真菌細胞の細胞内局在性に関する研究に使用されています。これらのメソッドでは、ディフェンシン処理細胞が通常固定し、タバコプロトプ、電子顕微鏡や x 線トモグラフィー15,24,25処理します。さらに、これらの技術のほとんどは細胞ディフェンシンの挑戦への応答で行われる動的な変更を監視する同じ生体細胞タイムラプス イメージングを使用してリアルタイムではなく、特定の時点でのイメージングに制限されています。視覚化、分析および動的イベント ディフェンシンの抗真菌作用.......
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開示事項
著者が明らかに何もありません。
謝辞
我々 は博士 r. ハワード ベルク、ドナルド ・ ダンフォース植物科学研究センター、彼の指導のための統合された顕微鏡施設の監督に感謝し、共焦点顕微鏡に役立ちます。著者は宣言する利害の対立があります。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| FM4-64 Dye | Life Technologies | T13320 | |
| DyLight 550 抗体ラベリングキット | Thermo Scientific | 84530 | |
| ガラス底 マイクロウェルディッシュ | マット TeK | P35G-1.5-10-C | |
| Mira 布 | EMD Millipore Corp | 475855-1R | |
| SP8-X 共焦点顕微鏡 | Leica | ||
| ImageJ software | 画像分析のための | FiJi | |
| マリスソフトウェア | Bitplane | 画像分析用 |
参考文献
- Jones, J. D. G., Dangl, J. L. The plant immune system. Nature. 444 (7117), 323-329 (2006).
- Tavormina, P., De Coninck, B., Nikonorova, N., De Smet, I., Cammue, B. P. A. The Plant Peptidome: An expanding repertoire of structural features and biological functions. Plant cell. 27 (8), 2095-2118 (2015).
- Van Der ....
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再版と許可
