方法論記事

植物のプロトプラストからのmRNAインターアクチベント捕獲

DOI：

10.3791/56011

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2017年7月28日

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1Department of Biology, KU Leuven

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ここでは、 シロイヌナズナの葉の葉の葉のプロトプラストに適用されるインタラクトームキャプチャプロトコールを紹介する 。この方法は生体内での UV架橋に批判的に依存し、生理学的環境からの植物mRNA結合タンパク質の単離および同定を可能にする。

要約

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RNA結合タンパク質（RBP）はRNAの運命を決定する。それらはすべてのRNA生合成経路に関与し、特にメッセンジャーRNA（mRNA）の転写後遺伝子調節（PTGR）に寄与する。ここ数年、酵母および哺乳動物細胞株由来の多数のmRNA結合プロテオームが、mRNA結合タンパク質（mRBP）の同定を可能にする「mRNAインタラクトーム捕捉」と呼ばれる新規な方法の使用によって首尾よく単離された。生理学的環境から直接的に得ることができる。この方法は、オリゴ（dT）ビーズによるメッセンジャーリボ核タンパク質複合体（mRNP）のin vivo紫外線（UV）架橋、プルダウンおよび精製、およびその後の質量分析（MS）による架橋タンパク質の同定からなる。非常に最近、同じ方法を適用することによって、いくつかの植物のmRNA結合プロテオームが異なるシロイヌナズナ組織源から同時に報告されている：幼植物、葉組織、葉の葉肉プロトプラスト、および培養された根細胞を含む。ここでは、 シロイヌナズナ葉の葉の葉の葉のプロトプラストの最適化されたmRNAインタラクトムキャプチャー法を紹介します。このプロトプラストは、様々な細胞アッセイを含む実験の汎用ツールとして機能する細胞タイプです。最適タンパク質収量の条件は、出発組織の量およびUV照射の持続時間を含む。中規模実験（10 7細胞）から得られたmRNA結合プロテオームにおいて、RNA結合能を有することが示されたRBPが過剰発現され、多くの新規なRBPが同定された。実験はスケールアップ（10 9細胞）することができ、最適化された方法は、植物のmRNA結合プロテオームを広く単離し、カタログ化し、比較するために、他の植物細胞型および種に適用することができる。

概要

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真核生物は、細胞の生物学的プロセスを維持するために複数のRNA生合成調節経路を使用する。 RNAの既知のタイプのうち、mRNAが非常に多様であり、タンパク質のコード容量を運び、それらのアイソフォーム1つの選択図PTGR経路は、プレmRNA 2,3の運命を指示します。異なる遺伝子ファミリーからのRBPがRNAの調節を制御し、PTGRにおいて、特定のmRBPは機能的なmRNPを形成する直接的な物理的相互作用を介してmRNAを誘導する。したがって、mRBPsおよびそれらmRNPsを同定および特徴づけることは過去30年間.Over細胞mRNA代謝2の調節を理解するために重要であり、種々のインビトロ法- RNA電気泳動移動度シフト（REMSA）アッセイ、指数関数的濃縮アッセイによるリガンドの系統的進化含みますライブラリー由来の構築物、RNA Bind-n-Seq（RBNS）、放射性標識または定量的標識蛍光RNA結合アッセイ、X線結晶学、及びNMR分光法は、4、5、6、7、8、9 -広く主に哺乳動物細胞から、RBPsの研究に適用されています。哺乳動物RBPのこれらの研究の結果は、公開された観察を収集するRNA結合タンパク質データベース（RBPDB）を介して検索することができる10 。

これらのインビトロアプローチは強力なツールであるが、所定のRNAプールからの結合RNAモチーフを決定するため、新しい標的RNAを発見する能力には限界がある。タンパク質配列および構造の保存に基づくゲノム全体のRBPを予測するための計算戦略についても同様である15 。これを克服するために、新しい実験方法ha目的のRBPが相互作用するRNAモチーフの同定を可能にし、結合の正確な位置の決定を可能にする。 「架橋および免疫沈降」（CLIP）と呼ばれるこの方法は、インビボ UV架橋およびその後の免疫沈降11からなる 。初期の研究では、DNAおよびRNAヌクレオチドの光活性化は、245nmを超える励起UV波長で起こり得ることが示されている。チミジンを介した反応が好ましいと思われる（光反応性の減少の順にランク：dT≧dC> rU> rC、dA、dG） 12 。波長254nm（UV-C）のUV光を用いて、数オングストローム（Å）の範囲でRNAヌクレオチドとタンパク質残基との間の共有結合が形成されることが観察された。したがって、この現象は、RNAおよびRBPの「ゼロ長」架橋と呼ばれている。これに続いて、厳格な精製手順少し背景13、14とdure。

CLIPに相補的な戦略は、インビボ UV架橋とタンパク質同定とを組み合わせて RBPの景観を記述することである。そのようなゲノムワイドなmRNAの結合プロテオームの数は、「のmRNAインタラクトームキャプチャ」18と呼ばれるこの新規な実験的アプローチを用いて、酵母細胞、胚性幹細胞（ESC）、およびヒト細胞株（ 例えば、HEK293及びHeLa細胞）から単離されています19、20、21。この方法は、インビボ UV架橋、続いてmRNP精製およびMSに基づくプロテオミクスからなる。この戦略を適用することによって、非カノニカルRBDを含む多くの新規の「月明かり」RBPが発見されており、以前よりも多くのタンパク質がRNA結合能力を有することが明らかになった「> 15、16、17は 、この方法を使用することは、新しいアプリケーションやRBPsを調査する際、新たな生物学的な質問に答える能力が可能になります。例えば、最近の研究では、mRNA結合プロテオーム（コアRBPの保全を検討していますプロテオーム） 22 。

プラントRBPsはすでに成長と開発に関与することが見出されている（ 例えば 、ミトコンドリアと葉緑体における開花時期の転写後調節、概日時計、および遺伝子発現に）24、25、26、27、28、29 。さらに、それらは、非生物的ストレス（ 例えば、寒さ、干ばつ、sa）に応答する細胞プロセスにおいて機能を果たすと考えられているlinity、およびアブシジン酸（ABA））31、32、33、34。 RNA認識モチーフ（RRM）およびKホモロジー（KH）ドメイン配列モチーフに基づいて、 シロイヌナズナゲノム中に200を超える予測されたRBP遺伝子が存在する。イネにおいて、約250 35、36を注目されています。多くの予測されたRBPが、植物に独特であるようである（ 例えば、 RRMドメインを含む予測シロイヌナズナ RBPの約50％に対するメタアゾーンオーソログはない） 35 、これは多くが新しい機能を果たし得ることを示唆している。最も予測されたRBPの機能は特徴付けされていない23 。

シロイヌナズナ由来のmRNA結合プロテオームの単離は、苗木、葉組織、培養根細胞、および葉の葉肉プロトプラストを、mRNAインタラクトームキャプチャは最近、38、39に報告されています。これらの研究は、近い将来植物における機能的RBPを体系的に分類する強力な可能性を実証している。ここで、我々は、植物プロトプラスト（ すなわち、細胞壁を有さない細胞）からのmRNA相互作用の捕獲のためのプロトコールを提示する。 シロイヌナズナの葉の葉の葉のプロトプラストは、葉の細胞の主要なタイプである。単離されたプロトプラストは、細胞へのUV光の最適なアクセスを可能にする。この細胞型は一過機能的特徴40、41タンパク質を発現アッセイにおいて使用され得ます。また、プロトプラストは、いくつかの他の植物細胞型および種42、43、44に印加されている（ 例えば、ピーターソンら 、2009; Bargmannとバーンバウム2010;および香港ら 、2012）。

このメソッドには合計11のステップが含まれています（ 図1A ）。 シロイヌナズナの葉の葉の葉のプロトプラストを最初に単離し（ステップ1）、次にUV照射して架橋したmRNPを形成する（ステップ2）。プロトプラストを変性条件下で溶解すると（ステップ3）、架橋されたmRNPは溶解/結合緩衝液中に放出され、オリゴd（T） 25ビーズによって引き下げられる（ステップ4）。数回のストリンジェントな洗浄の後、mRNPを精製し、さらに分析する。 mRBPの変性ペプチドをプロテイナーゼKで消化してから、架橋したmRNAを精製し、RNA品質をqRT-PCR（ステップ5および6）によって確認する。 RNase処理およびタンパク質濃度（ステップ7）の後、タンパク質の品質はSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）および銀染色（ステップ8）によって制御される。タンパク質バンドパターンの違いは、架橋サンプル（CL）と非架橋サンプル（非CL;非架橋サンプル）との間で容易に視覚化することができる。UV照射を受けていないプロトプラストからの陰性対照試料）。タンパク質の同定は、MSに基づくプロテオミクスによって達成される。可能性のあるバックグラウンド汚染を除去するために、1次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動（1D-PAGE）によってCLサンプルからのタンパク質を分離し、トリプシンを用いて短いペプチドに「ゲル内消化」し、精製する（工程9）。質量分析（ナノLC-MS）に結合されたナノ逆相液体クロマトグラフィーは、mRNA結合プロテオームにおける決定的なタンパク質の量の決定を可能にする（工程10）。最後に、同定されたmRBPを特徴付け、バイオインフォマティクス分析を用いてカタログ化する（ステップ11）。

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プロトコル

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1. シロイヌナズナ葉メゾフィルスプロトプラストの単離

注： シロイヌナズナの葉の葉の葉のプロトプラストは、Yoo et al 。、2007に記載されているように、いくつかの改変40を伴って本質的に単離される。

  1. 植物の成長
    1. シロイヌナズナ Col-0種子の種子を約200個滅菌水に4℃で2日間浸漬して層別します。
      注：この種子の数は、1つの非CLサンプルと1つのCLサンプルで十分です（ステップ1.3参照）。
    2. 50％（ v / v ）の土壌とバーミキュライトの混合物で鍋を準備し、鍋を蒸留水で浸して土を濡らします。
    3. 播種し、層状の種子を濡れた土壌に分配する。 シロイヌナズナ種子は発芽のために光を必要とするので、種子を土壌で覆わないでください。
      注：植物の生育条件は23℃で12時間明/ 12時間暗サイクルであり、開花前の5週間、成長室内で100μmolm -2 s -1の光強度で培養した。 4週齢の植物も使用することができます40 。
      注記：ステップ1.2.1からステップ3.2.3までのすべての材料および試薬は、2つのサンプル（ すなわち、 1つの非CLサンプル（UV-C照射を受けていない対照サンプル）および1つのCLサンプル（研究UV-C照射を受ける試料））。
  2. 等張性酵素溶液の調製
    1. 一次等張酵素溶液（400mMマンニトール、20mM KCl、および20mM MES緩衝液（pH5.7））80mLを調製し、直ちに溶液を60℃のインキュベーターで10分間加熱する。
    2. 暖かい一次等張酵素溶液に1.2gのセルラーゼR10（ w / v 1.5％）および0.32gのMacerozyme R10（ w / v 0.4％）粉末を加える。
    3. 穏やかに撹拌して酵素粉末を慎重に溶液に入れる。ラップ酵素溶液が透明な淡褐色になるまで、溶液を60℃のインキュベーターで10分間加熱する。
    4. 溶液を氷上で3分間冷却し、800μLの1M CaCl 2および800μLの10％（ w / v ）BSAを溶液に加える。
    5. ピペットでろ過し、0.22μmフィルターでろ過して溶液をホモジナイズする。この最後の等張性酵素溶液を2つの大規模ペトリ皿（150mm×20mm）に等分する。
  3. シロイヌナズナのロゼット葉片の調製
    注：各ペトリ皿の150枚の葉は、1つの非CLサンプルまたは1つのCLサンプルに推奨されます。
    1. 選択及び300の合計が完全に展開第2カット-または葉（平均：3 -ロゼット当たり4）-pair 第3 0.5〜1 mmの葉片には、新たな鋭いカミソリの刃を使用します。
    2. ストリンジェントを直ちに等張性酵素溶液に移し、浸漬する。
      注：光との接触を避けるため、常にt彼はアルミニウム箔でペトリ皿を作る。葉を粉砕しないでください。すべてのストリップが溶液に浸され、表面に浮いていないことを確認します。
  4. シロイヌナズナ葉の葉肉プロトプラストの単離
    1. アルミホイルで覆われたペトリ皿を真空デシケーターに入れ、30分真空下でリーフストリップに浸潤させる。その後、暗所でペトリ皿を室温で2.5時間振盪せずにインキュベートする。
    2. プロトプラストを完全に酵素溶液に放出させようと、手で静かに軽く皿を水平に振る。
  5. プロトプラストの収穫と計数
    1. プロトプラスト懸濁液を35〜75μmのナイロンメッシュで濾過する。各サンプルの濾液を2つの50mL丸底管（各管の約20mLの濾液）に分割する。
    2. 各ペトリ皿を10mLのW5緩衝液（154mM NaCl、125mM CaCl
    3. 4つのチューブすべてを100 xgで5分間遠心して、プロトプラストをペレット化します。上清を捨て、各チューブのプロトプラストペレットを10mLのW5緩衝液で静かに再懸濁する。
      注：プロトプラストペレットを再懸濁するときは、チューブをひっくり返して逆さにし、ペレットが消えるまで手でチューブを静かに回転させます。ペレットを直接ピペットして細胞を損傷させないようにしてください。
    4. ステップ1.5.3を1回繰り返し、各サンプルの2つのチューブからのプロトプラスト懸濁液を1つの50mL丸底チューブに合わせる。チューブを氷上に置いてください。
    5. 血球計数器を用いてプロトプラストを数える。
      注：25キューブ内の各20個の細胞は、2×10 5プロトプラスト/ mLに等しい。 150枚の葉が約1×10 7個の細胞を産生するはずである。非CLおよびCLサンプル中のプロトプラストの総数が同じであるように調節する。
    6. プロトプラストを氷上に30分間放置する。その後、チューブを100 x gで5分間回転させます。上清を捨て、MMg溶液（400mMマンニトール、15mM MgCl 2 、および4mM MES緩衝液（pH5.7））20mLで各チューブのプロトプラストを再懸濁する。

2. インビボでの UV照射によるmRNA-タンパク質架橋

注：非CLサンプルチューブは氷上に置いてください。 CLサンプルは直ちにUV照射されなければならない。

  1. CLサンプルチューブからの1×10 7個の細胞を含むプロトプラスト懸濁液を新しい大規模ペトリ皿（150mm×20mm）に移し、プレート表面を覆うように氷冷したMMg溶液30mLを添加する。穏やかにピペッティングすることにより、MMgバッファー全体に細胞を広げる。すぐにUV架橋装置にトップカバーなしでペトリ皿を置きます。
    注：UVランプの間の高さペトリ皿は8cmです。
  2. 1分、3分、または5分、254nmの波長のUV光および0.00875 W / cm 2のUV強度で試料を照射します。照射後、プロトプラスト懸濁液を迅速に2つの新しい50mL丸底チューブに分注する。皿の底をプロトコールの残りを集めるために氷冷したMMg溶液5mLでさらに洗浄し、この細胞懸濁液をこれらの2本のチューブに加える。
    注：最適条件として1分を選択した。説明は、 代表的な結果に記載されています。

3.変性条件下でのプロトプラスト溶解

  1. 溶解のためのプロトプラストペレットの調製
    1. 非CLサンプルチューブをステップ2の2つのCLサンプルチューブとともに100xgで5分間スピンし、上清を捨てる。非CLサンプルプロトプラストペレットのチューブを氷上に戻す。
    2. 10mLの氷冷したMMg溶液を各CLサンプルチューブgenペレットを再懸濁し、50mLの丸底チューブに戻します。チューブを100 xgで5分間回転させます。上清を除去した後、CLサンプルチューブプロトプラストペレットを氷上に保ちます。
  2. プロトプラスト溶解およびホモジナイズプロトプラスト溶解物
    1. 氷冷溶解/結合緩衝液（500mM LiCl、0.5％（ w / v ）ドデシル硫酸リチウム（LiDS）、5mMジチオスレイトール（DTT）、20mMトリス-HCl（pH7.5）、および1mM EDTA（pH8.0））を各サンプルの細胞ペレットに添加した。懸濁液が均質に薄緑色になるまで約20回上下にピペッティングすることによってプロトプラストを大まかに溶解する。
    2. 均質化のために、プロトプラスト溶解物を狭い針（0.9×25mm 2 ）を備えた50mLガラスシリンジに2回通す。ライセートを氷上で10分間インキュベートする。ライセートを液体窒素中で凍結し、-80℃で最大3週間保存する。

4. mRNPプルダウンおよび精製Oligo-d（T） 25ビーズ

注記：ステップ4.1からステップ4.4までの以下のすべての材料および試薬は、1つのサンプル（ すなわち、 1つの非CLサンプルまたは1つのCLサンプル）に対してのみ使用されます。ビーズ上清の溶解/結合バッファーを捨てた後、ビーズを含むチューブにプロトプラスト溶解物を直ちに添加しなければならない。

  1. オリゴ（dT）捕捉のためのオリゴd（T） 25磁気ビーズの調製
    1. 凍結プロトプラスト溶解物を室温で解凍する。ライセートが完全に解凍されたら、ライゼートのチューブを氷上に保ちます。
    2. 氷上で6つの新しい2mL丸底マイクロ遠心管にオリゴ-d（T） 25磁性ビーズ（5mg / mL）のアリコート1.8mLを入れる。各チューブで、ビーズ懸濁液を600μLの溶解/結合バッファーで均一に上下にピペッティングし、4℃で2分間静かに回転させて洗浄します。ビーズを氷上に置いておきます。
  2. バインディング
    1. 場所すべての6本のチューブは4℃で3分間磁気ラックにビーズを入れたもので、ビーズの磁気捕捉と懸濁液の除去が行われます。
      注：チューブを磁気ラックに入れたら、ビーズが完全に捕捉されるまで、少なくとも3分間待つ。
    2. 上清を捨て、すぐにこれらの6本のチューブにプロトプラスト溶解液9mLを分注する。均一な茶色の懸濁液が現れるまでピペットでよく混合し、プロトプラスト溶解液中でビーズを4℃で1時間穏やかに回転させてインキュベートする。
      注：30分から1時間のインキュベーション時間が推奨されます。
  3. 洗浄
    1. 4℃で3分間磁気ラックにチューブを戻します。すべてのビーズがチューブの側面に捕捉されたら、プロトプラスト溶解物を6個の新しい2 mL丸底マイクロ遠心チューブに集め、一時的に4℃で保存します。プロトプラスト溶解物をすぐに廃棄しないでください。ライセートを保つ4℃で保存した。
    2. ビーズに1.5mLの氷冷洗浄緩衝液1（500mM LiCl、0.1％（ w / v ）LiDS、5mM DTT、20mM Tris-HCl（pH7.5）、および1mM EDTA（pH8.0））を添加する。各チューブに入れます。ビーズを再懸濁し、1分間穏やかに回転させる。 4℃で3分間磁気ラックにチューブを戻し、上清を捨てる。洗浄液でこの洗浄工程を1回繰り返す。
    3. 1.5mLの氷冷洗浄緩衝液2（500mM LiCl、5mM DTT、20mM Tris-HCl（pH7.5）、および1mM EDTA（pH8.0））を用いてこの洗浄工程の同じ手順を2回繰り返し、氷冷低塩緩衝液（200mM LiCl、20mMトリス-HCl（pH7.5）、および1mM EDTA（pH8.0））1.5mLを添加した。
      注：mRNPがプロトプラスト溶解物から効率的に単離されている場合、洗浄バッファー2（ 図1B ）での洗浄ステップ中にCLサンプル中のビーズペレットの周りに「ハロー」が見えるはずです。
  4. 溶出
    1. 500μLを加える溶出緩衝液（20mM Tris-HCl（pH7.5）および1mM EDTA（pH8.0））を各チューブのビーズに添加した。ビーズを静かに再懸濁し、50℃で3分間インキュベートしてポリ（A） - テールRNAを放出させる。穏やかにピペットでビーズを再懸濁する。 4℃で5分間磁気ラックにチューブを戻します。
    2. すべての溶出液（全部で約3 mL）を氷上で清潔な無菌RNaseフリー15 mLコニカルボトムチューブに移して混合する。
      注：RNAの品質および量は、分光光度計装置を用いて直ちに決定することができる。
      注：各サンプルのRNA濃度は約10ng /μLで、 A 260 / A 280比は1.9です。 A 260 / A 280比は、単離されたポリ（A）短縮RNAが通常70％よりも純粋であるため、1.6と2.0の間でなければならない。 RNA濃度が低すぎる場合、開始プロトプラストの数を最大10 9まで増加させます。サンプル液体窒素中で凍結させ、長期保存のために80℃に保つことができる。
    3. 追加の2ラウンドについてステップ4.2からステップ4.4を繰り返し、oligo-d（T） 25ビーズを再使用して、プロトプラスト溶解物からポリ（A）テールRNAを枯渇させる。
      注：3回のプルダウン手順の後、各非CLサンプルまたはCLサンプルに対して合計9 mLの溶離液が存在するはずです。 4℃ですべての作業を行い、RNAの分解を避けます。ビーズを再使用または再生するには、ステップ4.5またはステップ4.6に従います。
  5. 再使用したオリゴd（T） 25ビーズの調製
    1. ビーズを氷冷溶出緩衝液1mLで2回、氷冷溶解/結合緩衝液1mLで1回洗浄して、塩LiCl濃度を500mMに戻す。
    2. ステップ4.1に従い、上清を捨て、保存したプロトプラスト溶解液を各チューブに移し、ステップ4.2からステップ4.4までの全手順をさらに2回繰り返す。
  6. オリゴd（T） 25ビーズの再生
    注：ビーズは別の実験用に保存して使用することができます（最大再使用回数は3回です）。
    1. ステップ4.4にしたがって、1mLの0.1M NaOHをビーズに加え、室温で5分間回転させてインキュベートする。各チューブについて、1mLの洗浄バッファー1で2回、0.1％Tween-20を含む1×PBS（pH 7.4）で3回平衡化する。 4℃で0.1％Tween-20を含む無菌RNaseフリー1×PBS（pH 7.4）300μLで各チューブのビーズを長期間保存してください。
      注：この実験でシロイヌナズナ CLサンプルに使用されるビーズは、次回に同じ植物サンプルにのみ使用できます。

5.プロテイナーゼK処理およびmRNA精製

  1. プロテイナーゼK処理
    1. UV-架橋タンパク質を消化するために、プロテイナーゼK溶液（2μg/μL）8μLを各サンプルの溶離液1mLに加えます。 Br扇状の渦。
  2. mRNAの精製
    1. 溶離液を37℃で1時間インキュベートする。 RNA精製キットを使用してRNAを精製し、残留する汚染物質を除去する。
      注：精製後、RNAはqRT-PCRアッセイを使用してRNA品質試験の準備ができています。
      注：RNAミニキットやTRIzol試薬などの他のキットも使用できます14 。

6. qRT-PCRアッセイ

  1. 逆転写
    1. 鋳型として1μgのRNAを含む逆転写系を用いて、第1鎖cDNAの効率的な合成を達成する。サンプルをヌクレアーゼフリーの水で5 ng /μLに希釈する。
  2. qRT-PCRを用いたcDNA定量
    1. テンプレートとして10ngのcDNAを含むqPCRマスターミックスおよびリアルタイムPCRサイクラーを使用して、cDNAを増幅および定量する。次のPCRプログラムを使用してください：95℃10分間（ステージ1、1サイクル）、15秒間95℃、1分間60℃（ステージ2,40サイクル）であった。
      注：ここで使用した参照遺伝子は、内因性内部制御遺伝子、 UBQ10 （AT4G05320）であった。 UBQ10および18S rRNAのためのqRT-PCRプライマーは、Li ら 、2014年Durut ら 、2014年それぞれ45、46に記載されました。プライマー配列は、 材料表に記載されています。

7. RNase処理およびmRBP濃度

  1. RNase処理
    1. RNase AおよびRNase T1を含む約100 UのRNaseカクテルを8 mLの溶離液に加えます。溶出液をヌクレアーゼフリーの水で置き換えたRNaseカクテルを含むネガティブコントロールのサンプルを含める。短時間ボルテックスし、37℃で1時間インキュベートする。
  2. mRBP濃度
    1. RNase消化後、溶出液を濃縮してくださいg遠心フィルターユニット。最終容量は75μLであり、総タンパク質収量は濃縮後の各サンプル約2μgである。長期保存のためにサンプルを-80℃に置きます。

SDS-PAGEおよび銀染色

  1. SDS-PAGE
    1. 25μLの濃縮溶出液（CLサンプル）または対照サンプル（非CLサンプル）を15μLの2倍負荷色素と混合する。試料を95℃で5分間加熱し、タンパク質マーカーを含む5％スタッキングゲルおよび12％分離ゲルを含むSDS-PAGEゲルに負荷する。
    2. タンパク質を60Vで40分間凝縮させ、ローディング色素が分解ゲルの終点に達するまで160Vで約1時間分離する。
  2. 銀染色アッセイ
    1. SDS-PAGEゲルを超純水で2回、各回5分間洗浄する。市販の銀染色キットを使用してタンパク質の銀染色を行います。
      注：タンパク質バンドは5分以内に表示する必要があります。バンドが非常に明るい色で5分を超えて見える場合は、開始プロトプラストの数を最大10 9まで増加させることが推奨される。

9.タンパク質バンドのトリプシン消化およびペプチド精製

  1. トリプシン消化物
    注：mRBP同定のために、各サンプルからさらに25μLの濃縮mRBP溶液を採取することにより、第2の1D-PAGEゲルを実行する;銀染色ゲルは、MS分析に適合しないので使用できない。
    1. 1D-PAGEゲルを実行した後、ゲルを固定溶液（50％（ v / v ）メタノールおよび10％（ v / v ）酢酸）中に1時間固定する。穏やかに振とうしながら、染色溶液（0.1％（ w / v ）クーマシーブリリアントブルーR-250,50％（ v / v ）メタノールおよび10％（ v / v ）酢酸）で20分間染色する。デステン溶液（40％（ v / v ）メタノールおよび10％（ v / v ）/ v）酢酸）で1時間処理した。脱染後、ゲルを5％（ v / v ）酢酸で保存する。
      注記：デステイニング中、バックグラウンドが完全に消滅するまで、新しいデスティネーションソリューションを置き換えることができます。
    2. 関心のあるバンドをゲルから切り取ってください。続いて最適なトリプシン消化およびペプチドの抽出のためにバンドをさらに約1mm 3の断片に切断する。ゲル断片を100mM重炭酸アンモニウム（NH 4 HCO 3 ）50μLで10分間水和する。ゲル片を完全に覆う。
      1. 水和溶液を注意深く除去し、ゲル片をアセトニトリル（CH 3 CN）で10分間脱水する。注意深くアセトニトリル溶液を除去する。
      2. 水和から脱水まで2回繰り返す。最後に、アセトニトリル溶液を除去する。
        注：ゲルの実行時間は、実験の目的によって異なります。長い実行時間は、タンパク質の良好な分離を可能にするので、染色された特定のゲル禁止dsは、さらなる分析のために切り取ることができる。タンパク質を保持して汚染物質を除去することが目的であれば、短い実行時間で十分である。
    3. 500μLの6.6mM DTT溶液を添加し、ゲル片を10分間インキュベートする。 DTT溶液を除去し、500μLの95％（ v / v ）アセトニトリル溶液でゲル片を2回洗浄する。
      1. 洗浄後、アセトニトリル溶液を除去し、暗所で10分間、ゲル断片を55mMヨード酢酸（IAA）溶液500μLと共にインキュベートする。
      2. インキュベーション後、溶液を除去し、500μLの95％（ v / v ）アセトニトリル溶液で再度ゲル片を洗浄する。ゲル片を乾燥させる。
    4. 消化緩衝液25μL（50mMのNH 4 HCO 3、5mMのCaCl 2を、及び6 NG /μLトリプシン）で完全にゲル片を埋め込み、トリプシンゲルに浸透させるために45分間氷上に保ちます。 37℃で一晩、ゲル片をインキュベートする。酵素消化。
  2. ペプチド精製
    1. 80μLの50mM NH 4 HCO 3を消化緩衝液中のゲル片に添加し、繰り返しボルテックスしてトリプシンペプチドを抽出する。抽出物を集める。 50％（ v / v ）CH 3 CNおよび5％（ v / v ）ギ酸（FA）80μLでこの抽出工程を2回繰り返す。
      注：合計最終抽出物は約240μLでなければなりません。
    2. 減圧濃縮または凍結乾燥により約10μLに抽出液をプールし、濃縮し、0.1％（ v / v ）トリフルオロ酢酸水溶液（TFA）25μLを加える。製造者のプロトコールに従って、サンプルをμ-C18カラムで脱塩する。
    3. 4〜10μLの60％（ w / v ）CH 3 CNおよび0.1％（ v / v ）FAでペプチドを溶出する。ペプチドを凍結乾燥（凍結乾燥）し、分析まで-20℃で保存する。
Nano-LC-MS

  1. ナノ逆相液体クロマトグラフィー
    注：液体クロマトグラフィー装置とオンラインで結合された質量分析計を使用してLC-MS分析を行います。この機器には、C18カラム（2μmの粒子、100Åのポアサイズ、50μm×15cmの寸法）が装備されている必要があります。
    1. 凍結乾燥したペプチドを16μLの溶液（2％（ v / v ）CH 3 CNおよび0.1％（ v / v ）FA）に再懸濁する。 C18プレカラム（3μmの粒子サイズ、100Åのポアサイズ、ナノバイペ、および75μm×2cmの寸法）上に、5μL/分の流速で5μLのペプチド溶液を注入し、ロードする。
    2. 10.1.2。 300nL /分の流速で95分の勾配を用いてペプチドを分離する。この分離勾配の間、移動相Bをそれぞれ5分、50分および18分で4％から10％、10％から25％および25％から45％増加させる。最後に、急速に移動相Bを1分で95％まで増加させる。後各95分の分離勾配は、5分で4％から95％までの10分の勾配を含む固有のすすぎ工程を適用する。
      注：移動相Aは99.9％H 2 Oおよび0.1％（ v / v ）FAであり、移動相Bは19.92％H 2 O、80％（ w / v ）CH 3 CNおよび0.08％（ v / v） ）FA。
  2. 質量分析アッセイ
    1. 400〜1,600 m / zの質量範囲を持つデータ依存モードで質量分析計を操作します。
    2. 断片化スペクトルを生成するために、MS1中の最も強いイオンを10個まで選択します。 MS1の場合、70,000の半値全幅（FWHM）と、MS2の場合は17,000に設定し、自動利得制御（AGC）の目標は300,000,000,000、MS1の最大イオン注入時間（IT）は256,64msとしますおよびMS2と呼ぶ。
    3. 最も豊富なイオンの繰り返し分解を避けるために、動的除外を10秒に設定します。
      注：ここでは、1つまたは6つ以上の電荷を有するイオンは、eMS2のxcluded。
  3. 定性的プロテオミクス：ペプチドとタンパク質の同定
    1. このようなピークのスタジオソフトウェア47、48、49などのソフトウェアを使用して断片化スペクトルを分析します。
      注：NovoHMM 30およびPepNovo 37 （ de novoシーケンシング用）およびSEQUEST 54およびMascot 55 （データベース検索用）など、他のソフトウェアパッケージもペプチド同定に利用できます。
    2. 同じ質量（<2ppmの差）および保持時間（<2分）でスペクトルを結合し、0.65より高い品質閾値を有するスペクトルのみを保持して、モデル化されたタクソノミのSwiss-Protデータベース（バージョン：2013年12月）植物シロイヌナズナ 。次の検索パラメータを使用します：月の使用による10 ppmの前駆体質量許容誤差同位体質量;フラグメント質量耐性20mmu;消化酵素としてのトリプシン、最大2回の切断切断。固定された修飾としてのシステインカルバミドメチル化;可変修飾としてのメチオニン酸化;およびペプチド当たり最大3つの可変の翻訳後修飾が含まれる。同定後、誤った発見率（FDR）<5％が得られるように、信頼できるペプチドおよびタンパク質同定のスコア閾値を手作業で設定する。
  4. 定量的プロテオミクス：質量分析データの統計解析
    1. プロテオミクスデータのラベルフリー定量には、LC-MS（ 例： Progenesis）を使用してください。
      注：MS1ペプチドのピーク面積（または強度）は、質量に応じてスタジオソフトウェアによって同定されたペプチドにリンクされ、許容誤差は最大10ppmです。
      注：このソフトウェアは、ペプチドの存在量を、すべての電荷状態のピーク面積を2 <+および8 + 。定量的データは、社内スクリプト（最大許容誤差10ppmでの質量マッチング）によってPEAKSペプチド同定と関連する。
    2. 各ペプチドの平均log2倍変化（CL /非CL）を計算する。特有のペプチドの折りたたみ変化をタンパク質によってグループ化する。
      注記：各グループにおいて、タンパク質の最終倍数変化は、そのペプチドの平均倍数変化に等しい。
    3. 統計的有意性を評価するために各群についてスチューデントのt検定を使用してp値を計算する。 Benjamini-Hochberg（BH）メソッドを使用して、すべてのグループのFDRのp値を修正するには、Rソフトウェアパッケージ（バージョン3.3.0）を適用します。
    4. Rソフトウェアパッケージ（バージョン3.3.0）と互換性のある "calibrate"機能パッケージ（バージョン1.7.2）を使用して、火山プロットを描画します。
      注：ここでは、-log10調整p値（-log10（adj。p値））は、同定されたすべてのタンパク質のlog2倍の変化の関数です。タンパク質は有意な有無にかかわらず、log2倍の変化が2より大きい場合、mRNA結合プロテオームにおいて陽性ヒットとして処理される。

同定されたmRNA結合プロテオームのカタログ

  1. Gene Ontology（GO）データベースとInterProデータベースを介した「家族とドメイン」を介して、「分子機能と生物学的プロセス」の項目に基づいて、ステップ10の同定されたタンパク質を3つのカテゴリに分類する。
  2. カテゴリI、すなわち「リボソームタンパク質」は検出されたすべてのリボソームタンパク質を含み、カテゴリーIIのタンパク質、またはRNA生物学においてRNAと相互作用する注釈付きタンパク質ドメインまたはRNA結合に既知または未知の機能を有する。
  3. 注釈付きRNA結合ドメインのないRNA生物学における既知または未知の機能を有するタンパク質がカテゴリーIIIまたは「候補RBP」に置かれると、I由来の注釈に基づいてカテゴリーIIIの酵素を定義するntEnzデータベース。

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結果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我々は、洗浄緩衝液2（ 図1B ）を用いた洗浄工程4.3において、CL試料中のビーズペレットを囲む特徴的なハローを観察した。それは調査されていないが、この現象は、磁気捕獲中に架橋したmRNP複合体がビーズ凝集と干渉し、より拡散した凝集体を形成することによって、おそらく説明できる。これは、オリゴ-d（T） 25ビーズ捕捉が有効であることを示している14 。

非CLコントロールおよびCLサンプルの両方における18S rRNAよりも有意に高いUBQ10参照mRNAレベルを図1Cに示す。これは、poly（A）-tailed mRNAにのみ結合できるoligo-d（T） 25ビーズによる捕捉のために、溶出液にmRNAが濃縮されていること...

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ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我々は、酵母およびヒト細胞のために開発されたmRNA相互作用捕獲を植物葉の葉の葉のプロトプラストに首尾よく適用した。リーフ葉肉細胞は、植物の葉における地上組織の主要なタイプである。この方法の主な利点は、生理学的環境からタンパク質を発見するためにインビボ架橋を使用することである。

このプロトコルでは、我々は、主に最適化された実験条件（ 例えば、出発材料として使用するプロトプラストの数及びUV照射の期間）50の数を提示します。最小10 7個のプロトプラスト（中規模）を使用する場合（ステップ1.5.5）、CLサンプル中の捕捉タンパク質は、SDS-PAGEおよび銀染色によってのみ検出することができる。より低い濃度は、SDS-PAGE上で観察可能なmRBPパターンを生じさせず、プロテオミクスによるさらなる分析にはおそらく使用すべきではない。実際に、10 7を超える細胞（ 例えば、 10 9 in大規模実験も可...

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開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者は何も開示することはない。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我々は、従来のUVランプを備えたUV架橋装置を提供したJoris Winderickx教授の研究室を認めている。 KGはKUルーベン研究基金の支援を受けており、FWOグラントG065713Nの支援を受けています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
試薬
0.8 M MannitolSigmaM1902-500G一次等張酵素溶液 &
MMg solution
2 M KClMERCKArt. 4935一次等張酵素溶液 &
W5 バッファー
0.2 M MES (pH 5.7)
(4-モルホリンエタンスルホン酸)		Sigma-aldrichM2933一次等張酵素溶液,
W5 バッファー &
MMg溶液,
ろ過滅菌
セルラーゼR10ヤクルト製薬工業株式会社セルラーゼ
"オノヅカ」
R-10 最終		等張酵素液
10 g マセロザイム R10ヤクルト製薬工業株式会社マセロザイム R-10、10g最終等張酵素溶液
10% (w/v) BSA
(ウシ血清アルブミン)		Sigma-aldrichA7906-100G最終等張酵素溶液 &
ろ過滅菌
1 M CaCl2Chem-Lab NVCL00.0317.1000最終等張酵素溶液,
W5 バッファー &
消化緩衝液
1 M NaClFisher ChemicalS/3160/60W5 緩衝液
2 M MgCl2SigmaM8266-100GMMg 溶液
1 M LiCl
(塩化リチウム)		Acros199885000Lysis/binding buffer,
Wash buffer 1,
Wash buffer 2 &
低塩緩衝液
5% (w/v) LiDS
(硫酸ドデシルリチウム)		Sigma-aldrichL4632-25G溶解/結合緩衝液,
洗浄緩衝液 1 &
ろ過滅菌
1 M DTT
(ジチオスレイトール)		Thermo Fisher Scientific
Wash buffer 1 &
洗浄バッファー 2		307866溶解/結合バッファー、
1 M Tris-HCl (pH 7.5) (Tris(hydroxymethyl)aminomethane, Hydrochloric acid S.G. (HCl))Acros &
フィッシャーケミカル		167620010 &
H/1200/PB15		溶解/結合バッファー,
洗浄バッファー 1,
洗浄バッファー 2,
低塩バッファー &
溶出バッファー
0.5 M EDTA (pH 8.0) (エチレンジアミン四酢酸)Sigma-aldrichED-500G溶解/結合バッファー,
洗浄バッファー 1,
洗浄バッファー 2,
低塩バッファー &
溶出緩衝液
Tween 20MERCK8.22184.0500オリゴ-d(T)25ビーズの再生
0.1 M NaOHVWR PROLABO CHEMICALS28244.295オリゴ-d(T)25ビーズの再生
1x PBS (pH 7.4)
(リン酸緩衝生理食塩水)
containing
(NaCl;KCl;Na2HPO4;KH2PO4)		Fisher Chemical, MERCK,
Sigma-aldrich &SAFC		S / 3160 / 60、
アート4935、
71640-250G&
60230		Regeneration of oligo-d(T)25 ビーズ
プロテイナーゼ K 溶液 (2 μg/μL)サーモフィッシャーサイエンティフィック11789020タンパク質消化
ローディング色素InvitrogenLC5925SDS-PAGE
qPCR マスターミックスPromegaA6001qRT-PCR assay
RNase カクテルサーモフィッシャーサイエンティフィックAM2286RNA消化
メタノールSigma-aldrich322415ゲル固定およびゲル脱染色
酢酸Sigma-aldrich537020ゲル固定およびゲル脱染
Coomassie Brilliant Blue R-250Thermo Fisher Scientific20278ゲル染色
1 M NH4HCO3
(重炭酸アンモニウム)
 		Sigma-aldrich09830-500Gジェルハイドレーション &
消化バッファー
CH3CN
(アセトニトリル)		Sigma-aldrich34851-100MLゲル脱水 &
ペプチド溶解液
IAA
(ヨード酢酸)		Sigma-aldrichI4386-10Gアルキル化剤
TFA
(トリフルオロ酢酸)		Sigma-aldrich302031-10X1MLペプチド溶解液
FA
(ギ酸)		Sigma-aldrich06554-5Gペプチド抽出
トリプシン溶液 (6 ng/μL)PromegaV5280消化バッファー
Name会社カタログ番号コメント
EQUIPMENT
SoilPeltracomLP2D植物成長
バーミキュライト 3SibliAS05VERMICULIET植物成長
ペトリ皿 (150 x 20 mm)Sarstedt82.1184.500プロトプラスト懸濁液用キャリア
0.22 μmフィルターミリポアSE2M229104最終的な等張酵素溶液の均質化
Razorblade寒天培地T585ロゼットリーフストリップ
35-75 μm ナイロンメッシュSEFAR NITEX74010プロトプラスト懸濁液ろ過
50 mL 丸底チューブSigma-aldrichT1918-10EAプロトプラスト懸濁液用キャリア
血球計算盤
(Bü		MARIENFELD650030プロトプラスト細胞計数
紫外線架橋装置
(HL-2000 HybriLinker)		UVP, LLCUVP95003101in vivo UV架橋
紫外線ランプ
(三共電機 G8T5)		SANKYO
電		機SD G8T5in vivo UV架橋
50mLガラスシリンジFORTUNA OptimaZ314560Homogenization of protoplast lysate
Narrow needle (0.9 x 25 mm)Becton Dickinson microlance 32021-04Homogenization of protoplast lysate
Rotator Model L26Labinco BV26110912
Oligo-d(T)25 magnetic beads
(5 mg/mL)		New England BioLabsS1419SmRNPs and mRNRs binding andプルダウン
マグネティックラックInvitrogenCS15000mRNPs and mRNAs binding and pull-down
遠心フィルターユニット
(Amicon Ultra-4 遠心フィルターユニット)		EMD ミリポアUFC800308mRBP 濃度
Pierce Silver Stain Kitサーモフィッシャーサイエンティフィック24612銀染色アッセイ
RNA 精製キット
(InviTrap Spin Plant RNAMini Kit)		STRATEC Molecular1064100300RNA 精製
分光光度計装置 (NanoDrop 1000 Spectrophotometer)Thermo Fisher ScientificND-1000RNA quality and quantity
Real-Time PCR cycler
(StepOne Real-Time PCR cycler)		Thermo Fisher Scientific4376600cDNA quantification
µ-C18 columns
(Millipore Zip Tip µ);-C18 カラム)		Sigma-aldrich720046-960EAペプチド精製
質量分析計
(Q Exactive Hybrid 四重極-Orbitrap 質量分析計)		サーモフィッシャーサイエンティフィIQLAAEGAAPFALGMAZR質量分析ベースのプロテオミクス
液体クロマトグラフィー装置 (Ultimate 3000 超高速液体クロマトグラフィー (UHPLC) 装置)サーモフィッシャーサイエンティフィックULTIM3000RSLCNANOMass spectrometry-based proteomics
C18 column
(Easy Spray Pepmap RSLC C18 column)		Thermo Fisher ScientificES800Mass spectrometry-based proteomics
C18 precolumn
(Acclaim Pepmap 100 C18 precolumn)		Thermo Fisher Scientific160321Mass spectrometry-based proteomics
名前会社名カタログ番号コメント
Primers for qRT-PCR assaySequences
UBQ10 mRNA
(Li et al., 2014)		Fw: AACTTTGGTGGTTTGTGTTTTGG
Rv: TCGACTTGTCATTAGAAAGAAAGAGATAA
18S rRNA
(Durut et al., 2014)		Fw: CGTAGTTGAACCTTGGGATG
Rv: CACGACCCGGCCAATTA
ック

参考文献

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