このコンテンツを表示するには、JoVEへの購読が必要です。 または、無料トライアルをお申し込みください。

方法論記事

マウス モデルにおける心肺バイパス: 新しいアプローチ

10.6K 回視聴

⸱

DOI:

10.3791/56017

⸱

2017年9月22日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cardiothoracic, Transplantation, and Vascular Surgery, Hannover Medical School, 2Department of Hematology, Oncology, Immunology, Rheumatology, and Pulmonology, University Hospital Tuebingen, 3Department of Pneumology, Hannover Medical School

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

本稿では、マウスで人工心肺を実行する方法について説明します。この小説のモデルは臓器の損傷に関与する分子メカニズムの調査を促進します。

要約

心臓介入中に長時間心肺がますます不可欠になると手順の最適化のため、長時間体外循環に起因する臓器障害を最小限に抑えるため臨床需要の増加が発生します。このホワイト ペーパーの目的は、マウスで人工心肺の完全に機能と臨床的に関連するモデルを実証することでした。デバイス設計、灌流回路の最適化、および顕微鏡技術について報告する.このモデルは、複数の血の図面の必要性のための生存と互換性がない急性モデルです。マウス (例えばマーカー、ノックアウトのなど) に利用できるツールの範囲のための器官の損傷との関係において人工心肺の影響の分子機構に調査容易になりますこのモデル併存疾患。

概要

心肺のバイパス (CPB) のクリニックへの導入、以来それは心臓手術1で重要な役割を果たしてきました。現代の心臓外科で長時間の体外循環時間豊富な大動脈再建と結合された手順を実行することが欠かせません。技術の進歩は、途方もないされていますが、体外循環の使用が関連付けられている術中と術後全身と地方機関損傷2,3。

大動物モデルは生理的過程4,5CPB の役割を調査するために開発されています。ただし、これらのモデルは、合併症、CPB のいくつかの洞察を提供している、彼らは非常に高価と分子ツール (抗体など) は非常に限られます。小動物でコスト効率的な代替物を開発しました。その開発以来複数の研究はラットおよびウサギ5,6,7,8,9で体外循環モデルを最適化するために行われています。これらのモデルは、疾患の病態生理学的プロセスの測定の良い基盤を提供します。しかし、彼らは関連抗体・試薬の不足のため携帯電話や体液の免疫学を調査するためにまだ十分ではありません。これは、研究のこの分野での役割を損ないます。

最近 CPB のマウス ・ モデルを開発しました。さまざまなマウス固有試薬、遺伝子組み換えマウスによるマウス モデルは一般的には生理学的、分子、および免疫学的研究10,11の選択のモデル.したがって、我々 のモデルは臨床的に関連する疾患12,13で利用できる多くのマウス系統があるので、さまざまな合併症に関連して体外循環の研究を促進します。したがって、本稿で、具体的には、マウスで体外循環を実行する方法。酸素と血行動態的パラメーターは、深い呼吸・循環の逮捕後密接に監視されます。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

プロトコル

すべての動物実験と動物愛護委員会 (低いザクセン州オフィス プロトコル食の安全と消費者保護のための承認されたドイツ動物保護法 (TierSchG) に準拠して行ったTSA 14/1556)。このモデルに適したマウスの最小限の重量が 25 g.

1 術前準備

注: すべての手続は、きれいな、非無菌条件下でオートクレーブ楽器。

。
  1. 場所 50 60 8 cm 長いプロピレン中空管の並行ファイバー両側 T-アダプターを接続してください。接着剤と中空繊維と T-アダプターの外部のブランチの間のスペースを埋める。
    1. 許可少なくとも 24 h 硬化する接着剤。標準ミクロトームを使用して T-アダプターから広がっている中空繊維をカットし、シリコン チューブを接続サイトにプルします
      2. 。
  2. (26 G branule) から 27 G の金属針を 2 Fr ポリウレタン カニューレに挿入します。外科ブレードを使用し、マイクロ剪刀、約 0.15 cm 各確保するためカニューレの遠位 3 分の 1 以内の 3 ~ 4 ピンホール最適な静脈を顕微鏡 (8-12 倍の倍率) で元に戻る流量。
    1. 削除完了時のワイヤ。鈍的切離と構造の撤回に綿棒を使用します。組織の脱水を防ぐために余分な水分を吸収するガーゼ綿棒 (5 × 5 cm 2) を使用します
      2. 。
  3. プライミング ボリュームを準備します。完了すると、30 mL ソリューション 2.5% v v/バッファリング NaHCO 3 の 8.4% 溶液をプライミングあたりヘパリン IU を追加します。4 ° C まで使用でこのソリューションを保存します
    4. 。
  4. を埋める CPB 回路 (すなわち、ポンプ、空気のわな猟師、チューブ、両方カニューレ) 静脈カニューレを介して 850 μ L プライミング溶液で。一度いっぱい、動物穿刺の準備が整うまで、体外循環の循環を維持します
    5. 。

2。動物の麻酔

、麻酔を管理する誘導商工会議所 2.5% 未満に動物を配置する
  1. v/イソフルラン/酸素混合物。ペダル逃避反射、尾ピンチ反射、目の瞬目反射を評価することによって、適切な麻酔を確認します。目の乾燥を避けるために獣医の目軟膏を適用します
    2. 。
  2. は、温度調節機能を持つ地球温暖化パッドに動物を配置します。プローブを直腸に挿入し、データ集録システムに接続されている体温を測定します
    3. 。
  3. による麻酔が達成された後は、動物 orotracheally 20 G プラスチック製 braunule を使用して、口頭でそれを挿入してビジュアル制御の下で気管にプッシュを挿管します。マウスの人工呼吸器に接続されているイソフルラン気化器を使用して換気を開始します。動物の重量に応じて 250 350 μ L の一回換気量を達成、換気を調整する。
    4. 。 完全無痛を保証するために
  4. 5 mg/kg の動物体重カルプロフェンを皮下注入します。イソフルラン麻酔濃度を酸素では 1.3 2.5% の間維持することをお勧めします。イソフルラン濃度は、手続の段階に応じて手動で調整すること
    5. 。

3。手術

  1. における麻酔・気管挿管が達成された後シャープ罰金ハサミ首に正中皮膚切開を実行、ぶっきらぼうな方法で筋肉を分離、右の内頚静脈と左頚動脈を公開します。準備中、最小限の失血を確保するためバイポーラ鉗子に接続されている獣医凝固装置を用いた血管を凝固します
    2. 。
  2. 頚静脈血管の準備の後 8-0 絹糸を使用してその分岐する左総頚動脈の遠位のセグメントを縛る頭側
    3. 。
  3. シリコン コネクタ (ID 0.5 mm、1 mm 外径)、場所 8-0 絹糸スリップを使用して動脈流入管に 27 G カニューレの先端節動脈と内頚動脈にカニューレの先端を挿入の近位のセグメントに接続します
    4. 。
  4. カニューレ先端部の適切な配置後、カニューレ先端が事前に、それは 3-4 mm 近位大動脈弓を産みます。8-0 絹の結び目を確保することでカニューレ先端を修正します
    5. 。
  5. による顕微鏡下鉗子、はさみ、鈍とシャープな郭清を実行、胸鎖乳突筋の鎖骨の近くに、横に組織の鈍的準備によって右の内頚静脈を公開、遠位端で 8 0 8-0 絹結び目を配置近位端でループします
    6. 。
  6. 頚静脈の遠位端の血管を結紮後右頚静脈と右心房方向への進行状況に静脈カニューレの先端を置き、絹の結び目を使用してセキュリティで保護します。最適な静脈還流には右心室に入る静脈のヒントを事前に必要がある場合があります
    7. 。
  7. 正しいカニューレの位置を達成すると後で 2.5 頚静脈に直接静脈注射を介して動物の体重の 1 グラムあたりヘパリン IU を追加することによって全身パリン投与群を実行します
    8. 。
  8. リアルタイム侵襲的圧監視、左大腿動脈を cannulate。鼠径部を公開し、25 倍の倍率の下で大腿神経大腿静脈から総大腿動脈でそっと分ける。
    1. Ligate 大腿動脈の遠位部。一時的にスリップ ノットの近位部分を閉塞し、マイクロ鉗子を用いた前壁に小切開を作る
      2. 。
    2. はその後、大腿動脈に 1 Fr ポリウレタン カニューレを挿入、シルク 10-0 縫合糸で固定します。このカニューレは血液ガス分析血液サンプルを抽出するために使用します
      3. 。
  9. 動脈と静脈カニューレの成功後、ポンプを回して人工心肺を開始。挿管から体外循環の開始までの時間は約 45 分ポンプの速度を増やすことによって全身の圧力測定とは完全に流れ (4-6 mL/分) 2 分以内の増加血流によって、0.5 mL/分の流量を使用して起動します
    10. 。
  10. 完全監視下胸骨から始まって、尾側方向に 5 mm の鋭いはさみを使用して上部胸骨を実行します。出血を避けるためにすぐに胸骨端を凝固します。右頚動脈を頭蓋の方向に引いて大動脈弓を公開します
    11. 。
  11. 最適制御のため無料胸腺とクランプを容易にする周囲の組織から大動脈弓の円周。上行大動脈の周りに 8-0 シルク ループを配置します。心術のクロスのクランプを配置するプルより良い公開する頭蓋方向にシルクのループ上行大動脈
    12. 。

4。人工心肺や血液ガス分析

  1. 血液ガス分析 (BGA)、大腿動脈カテーテル経由で 60-90 μ L 動脈血を収集するガラス毛細管を使用します。
    1. は、シリコーン チューブに小さなクランプを使用して、カテーテルからチューブを切り離します。キャピラリー チューブの制御充填できるようにクランプのゆっくりと圧力を解放します
      2. 。
    2. では、カテーテルにシリコン チューブを接続し直します。キャピラリー チューブを挿入次の時点で測定用血液ガス分析器:
      (BGA1) の換気と体外循環の開始後 10 分
      体外循環と呼吸の阻止 (BGA2) 15 分 25 分後
      40 分の体外循環、呼吸の阻止 (BGA3) の 30 分後
      CPB の 55 分、呼吸器、45 分、心不全 (BGA4) の 20 分後
  2. 安定した消保院流、コスモスイニシアテ ・換気を停止することによって呼吸停止します
    3. 。
  3. 換気が終了した後地球温暖化パッドを 28 ° C に設定して、冷たい生理食塩水に浸したガーゼを使用して呼吸停止の最初の 20 分以内の 28 ° C の体温に動物を局所的に冷却を開始します
    4. 。
  4. 28 ° C の体温が達成されれば、呼吸停止の 30 分の合計後、心術を開始する体外循環回路に 7.45 %kcl 溶液 0.3 mL を管理します
    5. 。
  5. の大動脈のクランプをクロスより露出するため頭蓋方向に引いて、以前に配置したシルク ループ (ステップ 3.10)、大動脈の上行する部分にマイクロ serrefine クランプを配置します
    6. 。
  6. は、合計 60 分の呼吸停止と心停止の 30 分を実行します。心の再灌流を開始する上行大動脈からマイクロ serrefine クランプを削除します。同時に再換気温かく、動物を 37 ° C
  7. 再灌流が完了し、動物に常温療法、達した後ポンプをオフにする体外循環を終了して 20 分における生理的な測定 (例えば 体温、心電図、観血的血圧) の監視を継続
  8. 実験の終わりには、exsanguinate 完全麻酔 (5% イソフルラン) 動物と血と 14 のさらなる分析のための器官を収集します
    9. 。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

結果

このプロトコルを記述する灌流回路、外科的処置、およびマウスの CPB 中の生理的パラメーターの監視します。十分に熟練した微小血管によって実行されるとき、一貫性と再現性をもって結果が。

適切な組織灌流を維持するために平均動脈圧は常に体外循環血流を調整し、余分なボリュームを追加することによって 40 と 60 の mmHg の間保持されます。動物、そのボリュームのステータスと体温の重量に応じて 2.3 6.5 mL/分回路へのプライミング溶液 0.1 mL の添加による実験中にボリュームの損失の補正を達成間体外血流は維持されます。CPB 中。全身 pH 安定化は NaHCO28.4 ミリ モル/L を追加することによって実現されます。すべての流体は、空気塞栓のリスクを軽減する空気トラッピング貯留層を介して管理されます。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

ディスカッション

完全に機能している臨床的に関連するモデル CPB のマウスを開発しました。心血管疾患を持つマウスの以上 30 系統は、私たちモデルは CPB に関連する新しい将来のプロトコルの開発の開始点を使用できます。また、マウス固有試薬およびノックアウト マウスの茄多、ためこのモデルは CPB の現在のラットのモデルを置き換えることはできません、体外循環関連臓器の損傷に関与する分子メカニズムの解剖を容易に。までに、CPB がマウスのカニュレーション法で顕微鏡下の課題としてマイクロ人工の十分に小さいプライミング容積の開発など技術的な課題に適用されていません。約 90 のコース、経験豊富な微小血管の勤勉な仕事が安定したモデルを達成するために必要でした。異なるローラー ポンプ、チューブ、および多様な貯水池を有する CPB マシンの以上 15 プロトタイプおよびテストされたが、常に改善します。以上 10 のバージョンの異なる人工肺は構築され、現在の結果を達成するためにテストします。私たちの新しいモデルは体外循環の既存のラットのモデル設定の完全な再設計を必要です。まず、我々 は最小の可能なマイクロ人工の可能なプライミング ボリュームを構築 < 0.3...

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

著者の謝辞があります。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
SterofundinB.Braun Petzold GmbHPZN:8609189プライミング量、1:1 with Tetraspan
Tetraspan 6% HES SolutionB. Braun Melsungen AGPZN:05565416プライミング量、1:1 with Sterofundin
Heparin Natrium 25.000Ratiopharm GmbHPZN: 30298432.5 IU/mL のプライミング溶液
NaHCO3 8,4% SolutionB. Braun MelsungenAGPZN:プライミング溶液
KCL 7.45%溶液B.ブラウンメルサンゲンAGPZN:心臓麻痺のための2418577 0.1 mL
CarprofenZoetis Inc.、米国PZN:00289615 088591535 mg / kg / BW
1 Fr PUカテーテルInstechlabs INC.、米国C10PU-MCA1301頸動脈
2 Fr PUカテーテルInstechlabs INC.、米国C20PU-MJV1302頸静脈
Vasofix安全カテーテル20GB.Braun Medical4268113S-01口腔気管挿管
8-0シルク縫合編組アシャウェイライン&Twine Mfg. Co., USA75290結紮糸
イソフルランPiramal Critical Care Deutschland GmbHPZN:9714675narcosis
CLINITUBES 血液毛細血管Radiomed GmbH51750132採血 60 - 95 マイクロリットル
スプリングハサミ - 6mm ブレードファイン サイエンス ツール GmbH15020-15機器
スプリング ハサミ - 2mm ブレードファイン サイエンス ツールGmbH15000-03instruments
Halsted-Mosquito HemostatFine Science Tools GmbH13009-12instruments
Dumont #55 ForcepsFine Science Tools GmbH11295-51instruments
Castroviejo Micro Needle Holder - 9cmFine Science Tools GmbH12060-02instruments
Micro SerrefinesFine Science Tools GmbH18555-01楽器
Bulldog SerrefineFine Science Tools GmbH18050-28instruments
MiniVent Ventilator for Mice (Model 845)Harvard Apparatus73-0044mechanical ventilation
Isoflurane Vaporizer Drager 19.1DräガーヴェルクAG &Co. KGaA麻酔 1.3 - 2.5%
PowerLab データ収集装置 4/35ADInstruments Ltd, New ZealandPL3504侵襲的圧力、ECG、温度
ABL 800 FlexRadiometer GmbH血液ガス分析
NMRIマウスチャールズリバー研究所Crl:NMRI(漢)オス、30 - 35 g、12週齢、実験の少なくとも1週間前に収容
中に1579775 3% 溶液

参考文献

  1. Edmunds, L. Cardiopulmonary Bypass after 50 Years. N. Engl. J. Med. 351 (16), 1601-1603 (2004).
  2. Goto, T., Maekawa, K. Cerebral dysfunction after coronary artery bypass surgery. J. Anesth. 28 (2), 242-248 (2014).
  3. Uysal, S., Reich, D. L. Neurocognitive outcomes of cardiac surgery. J. Cardiothorac. Vasc. Anesth. 27 (5), 958-971 (2013).
  4. Ballaux, P. K., Gourlay, T., Ratnatunga, C. P., Taylor, K. M. A literature review of cardiopulmonary bypass models for rats. Perfusion. 14 (6), 411-417 (1999).
  5. Jungwirth, B., de Lange, F. Animal models of cardiopulmonary bypass: development, applications, and impact. Semin. Cardiothorac. Vasc. Anesth. 14 (2), 136-140 (2010).
  6. Günzinger, R., et al. A rat model of cardiopulmonary bypass with cardioplegic arrest and hemodynamic assessment by conductance catheter technique. Basic Res Cardiol. 102 (6), 508-517 (2007).
  7. Waterbury, T., Clark, T. J., Niles, S., Farivar, R. S. Rat model of cardiopulmonary bypass for deep hypothermic circulatory arrest. J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 141 (6), 1549-1551 (2011).
  8. Schnoering, H., et al. A newly developed miniaturized heart-lung machine-expression of inflammation in a small animal model. Artif. Organs. 34 (11), 911-917 (2010).
  9. Kim, J., et al. The responses of tissues from the brain, heart, kidney, and liver to resuscitation following prolonged cardiac arrest by examining mitochondrial respiration in rats. Oxid. Med. Cell. Longev. 2016, (2016).
  10. Shappell, S. B., Gurpinar, T., Lechago, J., Suki, W. N., Truong, L. D. Chronic obstructive uropathy in severe combined immunodeficient (SCID) mice: lymphocyte infiltration is not required for progressive tubulointerstitial injury. J. Am. Soc. Nephrol. 9 (6), 1008-1017 (1998).
  11. Majzoub, J. A., Muglia, L. J. Knockout mice. N. Engl. J. Med. , 904-907 (1996).
  12. Houser, S. R., et al. Animal Models of Heart Failure A Scientific Statement From the American Heart Association. Circ. Res. 111 (1), 131-150 (2012).
  13. Russell, J. C., Proctor, S. D. Small animal models of cardiovascular disease: tools for the study of the roles of metabolic syndrome, dyslipidemia, and atherosclerosis. Cardiovasc. Pathol. 15 (6), 318-330 (2006).
  14. Iurascu-Gagea, M., Craig, S. Euthanasia and necropsy. The laboratory rabbit, guinea pig, hamster, and other rodents. Suckow, M. A., Stevens, K. A., Wilson, R. P. , Academic Press (Elsevier). 117-141 (2012).

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

再版と許可

タグ

CPB
マウス モデルにおける心肺バイパス: 新しいアプローチ
お問い合わせ
図書館に推薦する

プライバシー

利用規約

ポリシー

著作権 © 2026 MyJoVE Corporation. 無断転載を禁じます。