人間マントル細胞リンパ腫の異種移植マウス モデルにおける腫瘍生着

自然にリンパ球が免疫監視に大きな役割を果たすし、抗原特異免疫^1,2をマウントの重要なステップは、リンパ球が人身売買します。このプロセスには、血流に胸腺から、二次リンパ器官、リンパ節、パイエル板、脾臓など同種抗原を満たす彼らそこからナイーブ T リンパ球の移行が含まれます。B リンパ球は骨髄で分化し、二次リンパ器官³包にナイーブ細胞として移行します。これらの B 細胞の一部は受容器の抗原をバインドし、特定の T 細胞によってアクティブ化されます。これらの B 細胞の増殖と分化は、卵胞のマントル層に非活性化、ナイーブ B 細胞をプッシュします。活性化細胞が、パトロール、体や免疫グロブリン分泌形質細胞骨髄⁴に移行するに成熟細胞のメモリ B に分化します。

MCL は、マントル層でナイーブ B リンパ球が腫瘍に変換するときに発生します。これらのリンパ腫細胞は、リンパ器官の微小環境に存在し、特定の T リンパ球のコントロールとは独立して増殖します。ただし、密度のある特定の段階で彼らはこのニッチから脱出し、他の臓器でのニッチを求めて血流に循環させます。接着分子の複雑さとケモカインとその受容体の混乱を考えるこの細胞人身売買体内のメカニズムはよくわかっていない、したがって治療を妨げます。新しい微小に達することからリンパ腫 B 細胞を防ぐためには、この移行プロセスを効果的にブロックする手法が必要です。

MCL は、B 細胞の悪性腫瘍を治療するために最も困難の一つです。MCL の腫瘍の表現型の開発は、ユニークな生物学的特性の獲得によって特徴付けられる多段カスケードの結果です。診断時に、ほとんどの患者 (70%) 既に存在脾臓、骨髄、および/または消化管^5,6舌癌の関与を示す場合の大半の播種性疾患。にもかかわらず、従来の化学療法短期^7,8で高い寛解率を誘導する治療を受けた患者の耐性腫瘍によって数年以内の再発は、一般的です。MCL の普及とその基盤となる生物学の理解を助けることができる新しい疾患モデルの紹介: 我々 は患者の腫瘍細胞に由来するひと MCL 異種移植マウス モデルを確立します。我々 は、このモデルは MCL 普及に対する治療戦略を開発し、おそらく再発患者の最適な診断と治療の新しい臨床的視点を提供を助けることを望みます。

ヒトの血液サンプルは、ローカル倫理とジュネーブ大学病院の人体実験委員会によって承認された手続きに従って使用されました。

動物の手術は、機関倫理委員会動物ケアのジュネーブ、スイス連邦共和国のカントンの獣医のオフィスに従って (承認番号: GE/26/15)。

1. 主な末梢血単核球 (PBMCs) 密度勾配分離の準備

注: 3-5 mL 末梢血は白血病段階で MCL を呈する患者から得られました。診断は、染色体転座 t(11;14) の存在とサイクリン D1 の発現によってその後確認およびフローサイトメトリー (CD5 +、CD23−、CD200 +、単クローン性 B 細胞人口) の標準的な診断基準によると設立されました。すべてのケースで単クローン性 B 細胞を構成する > 合計 B 細胞の人口の 90%。残りのセルは、単球および T 細胞に主にいた。

1. ロズウェル パーク記念研究所メディア 1640 (RPMI) (図 1 a) の 5 mL と MCL 血液サンプルの (1:1) 5 mL を希釈します。
2. 徹底的な混合を使用する前に数回の密度勾配メディア (資材表) を反転します。
3. ピペット吸引を使用して 15 mL 遠心管に 5 mL の密度勾配のメディアを追加します。
4. 軽くアスピレーター (血液密度勾配メディア比を 2:1、例えば、10 mL を密度勾配メディアの 5 mL の血液のはず) を使用して 15 mL 遠心管の密度勾配メディアの希釈血液サンプルをレイヤーします。(図 1 b、C) 2 つのレイヤーを混在させるに注意をすべき。
5. 室温で 40 分間 400 x g でサンプルを遠心分離機、遠心ブレーキがオフになっています。
6. 中間層 (白っぽい、薄いリング (図 1, E) の矢印でマーク) を優しく吸引滅菌パスツール ピペットを使用して単核細胞を含む、クリーン チューブにそれらを転送します。
7. 単核細胞の洗浄
   1. 転送細胞懸濁液の容積を推定し、それに追加 1% ウシ血清アルブミン (BSA) とリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) x 滅菌 1 の 3 つの容積。
   2. 上下に数回ピペッティングによる懸濁液を混ぜます。
   3. 室温で 10-15 分のための 400-500 × g の懸濁液を遠心します。
   4. 細胞ペレットを取得、洗浄ステップを繰り返しますして上澄みを廃棄します。
   5. 上澄みを除去し、希望の音量、例えば、1 または 2 mL の PBS で細胞を再懸濁します。
   6. 自動化された細胞カウンターまたは検定 (商工会議所 · ノイバウアー) を使用して手動でセルの数をカウントします。

2. B 細胞の負の淘汰による B 細胞の濃縮

1. 最終濃度 50 x 10⁶セル/mL の PBS のセルを希釈します。
2. セルを下部ポリスチレン チューブ ラウンド 5 mL に転送します。細胞懸濁液 2 mL に B 細胞濃縮キットから抗体カクテルの 100 μ L を追加し、(図 2-1) 上下ピペットで穏やかに混合します。
3. 10 分間室温でセルを孵化させなさい。
4. 簡単に渦磁性粒子を提供 B 細胞濃縮キット 30 s (図 2-2)。サンプル 2 mL に磁性粒子の 150 μ L を追加します。
5. 室温で 5 分間別サンプルをインキュベートします。
6. 1x PBS 2% 牛胎児血清 (FCS) と 1 mM エチレンジアミン四酢酸 (EDTA) を含むと、2.5 mL にサンプル ボリュームをもたらします。磁石でチューブを置き、別の 3-5 分 (図 2-3) のチューブを孵化させなさい。
7. 管場所で、1 つの連続的な動きとマグネット ピックアップ、チューブをデカントした新鮮な管 (図 2-4) で濃縮細胞懸濁液を収集します。自動化された細胞カウンターまたは B 細胞の総収率を取得する診断を使用して手動でのセルをカウントします。
   注: 通常、利回りは通常 B 細胞と MCL の 10 の⁶セル/mL x 5-50 〜 10⁵ B 細胞/ml です。
8. 豊かな B 細胞の純度を確認します。
   1. 取る ~ 50,000 細胞 CD19/抗 CD20 抗体で細胞をインキュベートし、(1:20 希釈) 異なる蛍光色素と結合した抗 CD45 抗体と (1:10 希釈) 15-30 分の室温で。
   2. 1 × PBS + 1 %bsa の 1 mL で洗い、400-500 × g で 5 分で細胞を遠心し、〜 200 μ L の PBS で細胞を再懸濁します。
   3. フローサイトメトリーによる細胞サンプルを取得し、B 細胞の純度の分析します。純度はほとんど > 90% このメソッド (図 3)。

3. 異種移植腫瘍モデルマウスの開発

1. 1 × PBS (マウスあたりを注入するために必要なボリューム) の 150-200 μ L の 10 の⁶セル × 40 〜 60 を中断します。
2. 細胞懸濁液の 150 μ L を静脈内注射 (静注) 6-7 週齢 (図 4 a) 性別に関わらずうなずいて scid ガンマ (NSG) マウスのそれぞれの尾静脈に。
3. 〜 10 週間の人間のリンパ腫を開発するマウスを許可します。
   注: プライマリ ヒトリンパ腫細胞人間のリンパ腫細胞株 (~ 3 週間) と比較して腫瘍を開発する時間がかかります。
4. 動物は、減量のような致命的な病気の症状を表示する開始、波立たせられた髪、活性低下、後肢麻痺、等、犠牲によって CO₂窒息心臓心臓穿刺血を取得に続いてにマウス。
5. 収集さまざまな器官マウスの解剖によって骨髄、脾臓と肝臓のように、腫瘍生着分析のための犠牲の時に心臓から血液を描画することによって末梢血を収集 (図 4 b -F)。

4. 腫瘍細胞がさまざまな臓器の中にしみ込んでキメリズム解析

1. さまざまな器官を収集した後、次の赤血球 (RBC) 換散血、骨髄、脾臓の 500 μ L と肝臓の 2 mL の塩化アンモニウム カリウム バッファー x 1 の 200 μ L を使用して単一細胞懸濁液を生成する機械の破壊によってそれらを処理します。.
2. カウントし、ヒト B 細胞抗体すなわち抗 CD19、抗 CD20、抗 CD45 の細胞を染色します。
   注: NSG マウスの B 細胞を欠いている、したがって分析のため細胞はヒトの特定の B 細胞マーカーとステンド グラスします。
3. フローサイトメトリーによる各器官由来 B 細胞 (cd19、cd20、CD45 +) のゲートによって細胞を分析します。
4. 4.3 (図 4) の手順で示されているように、ゲートのセルに基づいて MCL 注入マウスから派生したさまざまな器官に明らかな移植腫瘍細胞を定量化します。
   注: 詳細については材料の表を参照してください。

原稿では、MCL 細胞の生着の異種移植腫瘍モデルマウスの開発に成功のための最適化されたプロトコルについて説明します。(このケース MCL 細胞で)、純粋な細胞集団の準備は成功した MCL 異種移植片を開発する非常に重要です。図 1は、密度勾配分離法による MCL 患者の血液から単核のセル隔離のため分取の手順を表します。単核細胞は、さらに否定的な B 細胞濃縮キットを使用して、マウスへの異種移植注入のために純粋なセル人口を取得する純粋な B 細胞を取得する処理します。成功した MCL 生着するために最大純度を取得するには、注意が必要です。このメソッドを使用して得られる純度は通常 > 90%。残りのセルは、単球および T 細胞 (データは示されていない) に多かった。

図 2は、メソッドのセクションで説明したように B 細胞の浄化のプロトコルの異なるステップを表します。濃縮細胞はその純度の異なるマーカー (CD45、CD19、CD20、CD23、CD200、CD5、カッパ、ラムダ) を用いたフローサイト メーターによるさらに分析されます。MCL セルの特性により、図 3に示すように、シーケンシャル ゲート: CD45 +、cd19、cd20、CD5 +、CD23−、および CD200− を選択します。多色染色補正は各標準フローサイトメトリー設定に従って使用螢の単一の染色コントロールを使用して行った。

図 3EGは、濃縮の前後に B 細胞の典型的なドット プロットを表します。この場合、> このキットを使用して濃縮細胞の 95% は B 細胞です。セルは、前述のプロトコルで 150-200 μ L の PBS の 40-60 × 106セルの濃度で PBS で中断されます。彼らはすぐに NSG マウスに静脈を注入しました。10 週間後 > 開発した注入された動物のリンパ腫の 90% が末期症状(体重減少、波立たせられた髪、減らされた活動等)の兆候を示しています。犠牲、脾臓や肝臓が削除、機械的破壊 (図 4F); 単一細胞懸濁液を取得する処理後血液は心臓心臓穿刺によって慎重に引かれると大腿骨の両端を切断することによって骨髄が処理され、満ちて 2 mL 注射器を使用してフラッシュ RPMI 培地または PBS (図 4)。セルは、ヒト B 細胞 CD19/CD20 と CD45 のような特定のマーカーを用いたフローサイトメトリーによってさらに処理されます。我々 は、受信者マウス緊張 (NSG) B 細胞がないためここでヒト B 細胞特定のマーカーを使用しました。図 4B-Fは、犠牲の後器官のコレクションとさらに処理の手順を表します。2 人の患者から派生した MCL 細胞の生着の程度は、図 4で表されます。この手法を次の患者と異なる臓器の生着のパターンを比較できます。

図 1: 全血から PBMCs の分離します。MCL 患者からの採血は、RPMI 培地 (A) で 1:1 希釈で密度勾配媒体 (C) 血を混合せず密度勾配メディア層 (B) の上に慎重に配置。45 分の 400 × g で遠心分離のような白っぽいリング単核細胞 (矢印の単核細胞層) (D)。このレイヤーが他のレイヤーのさらなる処理 (E) クリーン チューブに混合することがなく優しく戻します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 2: B の濃縮細胞 PBMCs 。密度勾配遠心法で分離した PBMCs は PBS で 2 回洗浄しました。負を使用した B 細胞濃縮キット、製造元のプロトコルに従うことによって B 細胞の純粋な人口 (1-4) を得られます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 3: MCL 細胞の FACS 解析と B の純度細胞濃縮前後。マクロファージの MCL は CD45、CD19、CD20、CD23、CD200、CD5、カッパ、ラムダのような異なるマーカーを用いた FACS 解析によって特徴付けられます。CD23 と CD200 の CD45、CD19、CD20、CD5、負の肯定的なセルは選択 (A-F) です。Gは、濃縮E濃縮前に、に比べて負の淘汰のキットを使用してセル人口を表します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 4: MCL 細胞の生着の異種移植モデルとして NSG マウスします。MCL 患者由来 B 細胞は、NSG マウス (A) の外側尾静脈から点滴を注入しました。接が腫瘍のいくつかの日を可能にした後、マウスが犠牲になったし、骨髄 (C), (D) 脾臓, 末梢血 (E) のような別の臓器 (心臓心臓穿刺下ろし) を収集するために (B) を解剖し、肝臓 (F)。これらの器官は、さらに処理され、B 細胞の存在のためのフローサイトメトリーで分析しました。Gが MCL MCL から派生したさまざまな臓器の細胞の生着のパターンを表す NSG マウスを注入します。2 人の患者の結果が表示されます。± Sem データが表示されます n = 3。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。