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方法論記事

人間マントル細胞リンパ腫の異種移植マウス モデルにおける腫瘍生着

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DOI:

10.3791/56023

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2018年3月30日

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1Department of Pathology and Immunology, University of Geneva, 2Hematology Service, University Hospital, Geneva

この記事について

サマリー

マントル細胞リンパ腫 (MCL) は B 細胞の障害を治療することは困難と同様に研究および治療法を開発するプライマリ MCL の異種移植マウス モデルを確立することは困難です。ここでは、その基盤となる生物学を理解するためにマウスの MCL を異種移植片の成功確立について述べる。

要約

B リンパ球は主に家に免疫細胞の循環と彼らのキー ・ プレイヤー、リンパ器官に存在します。正常 B 細胞は、T リンパ球が刺激されるときのみ増殖、発癌性 B 細胞生き残るため、未定義のオルガンのニッチの自律的展開します。マントル細胞リンパ腫 (MCL) はそのような 1 つの B 細胞障害患者の生存率が 4-5 年。これは効果的なメカニズムが、ホーミングとこれらの細胞の生着は生存率を高めるためにブロックの必要性と患者の長寿のために呼び出します。したがって、体内ホーミング機構ブロックによる MCL 治療の有効性を検討する異種移植マウス モデルを開発するための努力は非常に重要です。ひと細胞の異種移植の初期段階の薬をテストするための受信者動物の開発は長い間、関連するマウスの前臨床モデルに欠かせない画面の新しい治療薬として追求されています。この動物モデルの開発人間の移植片拒絶反応を回避し、ひと疾患モデルの確立し、の候補薬の臨床テストを実行する別のリンパ腫型の病気の進行を研究する非常に便利なツールがあります。造血器腫瘍、MCL のよう。私たちは研究し、MCL の新規治療法を開発するための優秀な資源となる異種移植マウス モデルを確立しました。

概要

自然にリンパ球が免疫監視に大きな役割を果たすし、抗原特異免疫1,2をマウントの重要なステップは、リンパ球が人身売買します。このプロセスには、血流に胸腺から、二次リンパ器官、リンパ節、パイエル板、脾臓など同種抗原を満たす彼らそこからナイーブ T リンパ球の移行が含まれます。B リンパ球は骨髄で分化し、二次リンパ器官3包にナイーブ細胞として移行します。これらの B 細胞の一部は受容器の抗原をバインドし、特定の T 細胞によってアクティブ化されます。これらの B 細胞の増殖と分化は、卵胞のマントル層に非活性化、ナイーブ B 細胞をプッシュします。活性化細胞が、パトロール、体や免疫グロブリン分泌形質細胞骨髄4に移行するに成熟細胞のメモリ B に分化します。

MCL は、マントル層でナイーブ B リンパ球が腫瘍に変換するときに発生します。これらのリンパ腫細胞は、リンパ器官の微小環境に存在し、特定の T リンパ球のコントロールとは独立して増殖します。ただし、密度のある特定の段階で彼らはこのニッチから脱出し、他の臓器でのニッチを求めて血流に循環させます。接着分子の複雑さとケモカインとその受容体の混乱を考えるこの細胞人身売買体内のメカニズムはよくわかっていない、したがって治療を妨げます。新しい微小に達することからリンパ腫 B 細胞を防ぐためには、この移行プロセスを効果的にブロックする手法が必要です。

MCL は、B 細胞の悪性腫瘍を治療するために最も困難の一つです。MCL の腫瘍の表現型の開発は、ユニークな生物学的特性の獲得によって特徴付けられる多段カスケードの結果です。診断時に、ほとんどの患者 (70%) 既に存在脾臓、骨髄、および/または消化管5,6舌癌の関与を示す場合の大半の播種性疾患。にもかかわらず、従来の化学療法短期7,8で高い寛解率を誘導する治療を受けた患者の耐性腫瘍によって数年以内の再発は、一般的です。MCL の普及とその基盤となる生物学の理解を助けることができる新しい疾患モデルの紹介: 我々 は患者の腫瘍細胞に由来するひと MCL 異種移植マウス モデルを確立します。我々 は、このモデルは MCL 普及に対する治療戦略を開発し、おそらく再発患者の最適な診断と治療の新しい臨床的視点を提供を助けることを望みます。

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プロトコル

ヒトの血液サンプルは、ローカル倫理とジュネーブ大学病院の人体実験委員会によって承認された手続きに従って使用されました。

動物の手術は、機関倫理委員会動物ケアのジュネーブ、スイス連邦共和国のカントンの獣医のオフィスに従って (承認番号: GE/26/15)。

1. 主な末梢血単核球 (PBMCs) 密度勾配分離の準備

注: 3-5 mL 末梢血は白血病段階で MCL を呈する患者から得られました。診断は、染色体転座 t(11;14) の存在とサイクリン D1 の発現によってその後確認およびフローサイトメトリー (CD5 +、CD23−、CD200 +、単クローン性 B 細胞人口) の標準的な診断基準によると設立されました。すべてのケースで単クローン性 B 細胞を構成する > 合計 B 細胞の人口の 90%。残りのセルは、単球および T 細胞に主にいた。

  1. ロズウェル パーク記念研究所メディア 1640 (RPMI) (図 1 a) の 5 mL と MCL 血液サンプルの (1:1) 5 mL を希釈します。
  2. 徹底的な混合を使用する前に数回の密度勾配メディア (資材表) を反転します。
  3. ピペット吸引を使用して 15 mL 遠心管に 5 mL の密度勾配のメディアを追加します。
  4. 軽くアスピレーター (血液密度勾配メディア比を 2:1、例えば、10 mL を密度勾配メディアの 5 mL の血液のはず) を使用して 15 mL 遠心管の密度勾配メディアの希釈血液サンプルをレイヤーします。(図 1 b、C) 2 つのレイヤーを混在させるに注意をすべき。
  5. 室温で 40 分間 400 x g でサンプルを遠心分離機、遠心ブレーキがオフになっています。
  6. 中間層 (白っぽい、薄いリング (図 1, E) の矢印でマーク) を優しく吸引滅菌パスツール ピペットを使用して単核細胞を含む、クリーン チューブにそれらを転送します。
  7. 単核細胞の洗浄
    1. 転送細胞懸濁液の容積を推定し、それに追加 1% ウシ血清アルブミン (BSA) とリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) x 滅菌 1 の 3 つの容積。
    2. 上下に数回ピペッティングによる懸濁液を混ぜます。
    3. 室温で 10-15 分のための 400-500 × g の懸濁液を遠心します。
    4. 細胞ペレットを取得、洗浄ステップを繰り返しますして上澄みを廃棄します。
    5. 上澄みを除去し、希望の音量、例えば、1 または 2 mL の PBS で細胞を再懸濁します。
    6. 自動化された細胞カウンターまたは検定 (商工会議所 · ノイバウアー) を使用して手動でセルの数をカウントします。

2. B 細胞の負の淘汰による B 細胞の濃縮

  1. 最終濃度 50 x 106セル/mL の PBS のセルを希釈します。
  2. セルを下部ポリスチレン チューブ ラウンド 5 mL に転送します。細胞懸濁液 2 mL に B 細胞濃縮キットから抗体カクテルの 100 μ L を追加し、(図 2-1) 上下ピペットで穏やかに混合します。
  3. 10 分間室温でセルを孵化させなさい。
  4. 簡単に渦磁性粒子を提供 B 細胞濃縮キット 30 s (図 2-2)。サンプル 2 mL に磁性粒子の 150 μ L を追加します。
  5. 室温で 5 分間別サンプルをインキュベートします。
  6. 1x PBS 2% 牛胎児血清 (FCS) と 1 mM エチレンジアミン四酢酸 (EDTA) を含むと、2.5 mL にサンプル ボリュームをもたらします。磁石でチューブを置き、別の 3-5 分 (図 2-3) のチューブを孵化させなさい。
  7. 管場所で、1 つの連続的な動きとマグネット ピックアップ、チューブをデカントした新鮮な管 (図 2-4) で濃縮細胞懸濁液を収集します。自動化された細胞カウンターまたは B 細胞の総収率を取得する診断を使用して手動でのセルをカウントします。
    注: 通常、利回りは通常 B 細胞と MCL の 10 の6セル/mL x 5-50 〜 105 B 細胞/ml です。
  8. 豊かな B 細胞の純度を確認します。
    1. 取る ~ 50,000 細胞 CD19/抗 CD20 抗体で細胞をインキュベートし、(1:20 希釈) 異なる蛍光色素と結合した抗 CD45 抗体と (1:10 希釈) 15-30 分の室温で。
    2. 1 × PBS + 1 %bsa の 1 mL で洗い、400-500 × g で 5 分で細胞を遠心し、〜 200 μ L の PBS で細胞を再懸濁します。
    3. フローサイトメトリーによる細胞サンプルを取得し、B 細胞の純度の分析します。純度はほとんど > 90% このメソッド (図 3)。

3. 異種移植腫瘍モデルマウスの開発

  1. 1 × PBS (マウスあたりを注入するために必要なボリューム) の 150-200 μ L の 10 の6セル × 40 〜 60 を中断します。
  2. 細胞懸濁液の 150 μ L を静脈内注射 (静注) 6-7 週齢 (図 4 a) 性別に関わらずうなずいて scid ガンマ (NSG) マウスのそれぞれの尾静脈に。
  3. 〜 10 週間の人間のリンパ腫を開発するマウスを許可します。
    注: プライマリ ヒトリンパ腫細胞人間のリンパ腫細胞株 (~ 3 週間) と比較して腫瘍を開発する時間がかかります。
  4. 動物は、減量のような致命的な病気の症状を表示する開始、波立たせられた髪、活性低下、後肢麻痺、等、犠牲によって CO2窒息心臓心臓穿刺血を取得に続いてにマウス。
  5. 収集さまざまな器官マウスの解剖によって骨髄、脾臓と肝臓のように、腫瘍生着分析のための犠牲の時に心臓から血液を描画することによって末梢血を収集 (図 4 b -F)。

4. 腫瘍細胞がさまざまな臓器の中にしみ込んでキメリズム解析

  1. さまざまな器官を収集した後、次の赤血球 (RBC) 換散血、骨髄、脾臓の 500 μ L と肝臓の 2 mL の塩化アンモニウム カリウム バッファー x 1 の 200 μ L を使用して単一細胞懸濁液を生成する機械の破壊によってそれらを処理します。.
  2. カウントし、ヒト B 細胞抗体すなわち抗 CD19、抗 CD20、抗 CD45 の細胞を染色します。
    注: NSG マウスの B 細胞を欠いている、したがって分析のため細胞はヒトの特定の B 細胞マーカーとステンド グラスします。
  3. フローサイトメトリーによる各器官由来 B 細胞 (cd19、cd20、CD45 +) のゲートによって細胞を分析します。
  4. 4.3 (図 4) の手順で示されているように、ゲートのセルに基づいて MCL 注入マウスから派生したさまざまな器官に明らかな移植腫瘍細胞を定量化します。
    注: 詳細については材料の表を参照してください。

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結果

原稿では、MCL 細胞の生着の異種移植腫瘍モデルマウスの開発に成功のための最適化されたプロトコルについて説明します。(このケース MCL 細胞で)、純粋な細胞集団の準備は成功した MCL 異種移植片を開発する非常に重要です。図 1は、密度勾配分離法による MCL 患者の血液から単核のセル隔離のため分取の手順を表します。単核細胞は、さらに否定的な B 細胞濃縮キットを使用して、マウスへの異種移植注入のために純粋なセル人口を取得する純粋な B 細胞を取得する処理します。成功した MCL 生着するために最大純度を取得するには、注意が必要です。このメソッドを使用して得られる純度は通常 > 90%。残りのセルは、単球および T 細胞 (データは示されていない) に多かった。

図 2は、メソッドのセクションで説明したように B 細胞の浄化のプロト...

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ディスカッション

臨床試験、医薬品開発の先進的な段階で、創には使用できません。初期段階の薬をテストするためにひと細胞の異種移植の受信者を動物を開発する努力を追求されている長い間。人間拒絶反応を回避し、MCL など、人間の病気のためのモデルを確立することができます動物のモデルをご紹介します。これは現時点ではひと腫瘍生着と腫瘍成長のメカニズムを研究する最先端の異種移植モデルです。ここで我々 は NSG マウス リンパ腫の移植のより大きい成功を達成するためにこれまで最も免疫欠損マウス モデルの 1 つを使用します。NSG のマウスは、成熟 T 細胞、B 細胞、NK 細胞に欠けています。また、サイトカイン シグナル伝達に障害がある、先天性免疫不全であります。

密度勾配によってプライマリ MCL サンプルからのリンパ球の準備は、赤色の血液細胞と血小板のような他の細胞型を削除する重要なステップです。伝統的に、密度勾配遠心法では、リンパ球の分離を成功させることができます。これらリンパ球 B 細胞集団を豊かにするためのさらなる処理は、本稿に記載されているプロトコルに従う B 細胞濃縮キットの使用によって達成されます...

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開示事項

著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。

謝辞

この作品はリーグ Genevoise contre le 癌によって支えられた財団博士デュボワ Ferriere ディヌ ・ リパッティ、OCS-02260-08-2008、2914-02-2012 KPS OCS Oncosuisse スイス国立科学財団・ グラント 31003A_156760 および 310030 153456。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
Ficoll-paque 培地GE Healthcare17-1440-02単核細胞の分離用
RPMI 培地 1640Gibco-Life technologies61870-010血液サンプルの希釈用
リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)Sigma-AldrichD8537細胞の洗浄
牛血清アルブミン (BSA)Sigma-AldrichA8412単離中の細胞洗浄に使用される1% BSAを含むPBSの調製用
CD19-APC700ベックマン・コールターB49212ヒトpan-B細胞マーカー
CD20-APCベックマン・コールターA21693ヒトpan-B細胞マーカー
CD20-ECDベックマン・コールターIM3607ヒトpan-B細胞マーカー
CD5-PC 5.5ベックマン・コールターPNA70203ヒトT細胞マーカー
CD23-PEPharmingen555711細胞表面タンパク質 MCL
CD45 KOBeckman CoulterB36294汎白血球マーカー
CD200-PEPharmingen552475細胞表面タンパク質 MCL
NOD scid γ (NSG) マウスCharles River Laboratories5557この研究では
MCL 異種移植片の開発に使用Easy sep ヒトB細胞濃縮キット幹細胞技術19054B細胞を濃縮し、マウスに注入するための純粋な細胞を得る
FACSベックマン・コールター・ナビオスMCLサンプルの特性評価とMCL生着のための臓器の研究に使用
1X塩化アンモニウムカリウム緩衝液赤血球溶解緩衝液(NH4Cl 8,024 mg/l;KHCO3 1,001 mg/l;EDTAです。Na2·2H2O 3.722 mg/l )
には典型的には存在しない

参考文献

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