患者の膠芽細胞腫切除における細胞微小環境の定量的免疫組織化学

サマリー

このプロトコールは、発色免疫組織化学およびImageJを用いたグリア芽腫患者切除における腫瘍微小環境成分を定量的に同定するために開発された。

要約

腫瘍の微小環境への関心が高まっているため、致命的で最も侵襲性の脳腫瘍であるグリア芽細胞腫の患者サンプル内の微小環境成分を特異的に決定する方法を開発しました。定量的方法は、病変組織を正確に記述するのに有益であるばかりでなく、より正確な予後、診断、および組織工学システムおよび置換の開発に潜在的に寄与し得る。グリア芽細胞腫では、グリア細胞（例えば、ミクログリアおよび星状細胞）は、病理学者のグレーディングに基づいて予後不良と独立に相関している。しかしながら、これらの細胞および他のグリア細胞成分の状態は、定量的に十分に記載されていない。これは、これらのグリア細胞を標識する大きなプロセスのために困難であり得る。さらに、大部分の組織学的分析は、全体的な組織サンプルに焦点を当てるか、または腫瘍の大部分内のみに焦点を当てるが、領域に基づく定量化を描写するのではなく高度に異種の組織である。ここで、我々は、グリア芽細胞腫患者からの腫瘍切除の腫瘍バルクおよび隣接領域内のグリア細胞の集団を同定し、定量的に分析するための方法を記載する。本発明者らは、染色体免疫組織化学を用いて、患者の腫瘍切除におけるグリア細胞集団を同定し、ImageJは、各グリア集団についての染色のカバレッジ率を分析した。これらの技術を用いて、神経膠腫腫瘍微小環境の領域全体にわたってグリア細胞をよりよく記述することができる。

概要

神経膠芽腫（GBM）、最も一般的な悪性脳腫瘍は、周囲の健康な脳実質^1,2に原発腫瘍塊から高度に拡散侵入によって特徴付けられます。この拡散侵入は完全に切除する腫瘍は特に難しくなり、治療後のまま侵入癌細胞は避けられない再発^2、3、4のための最も一般的な理由です。以前、我々は、しかし、少しはGBM浸潤に貢献する複雑なメカニズムについて知られている^、5治療上有益であることがびまん性神経膠腫細胞の浸潤を阻害することが分かりました。腫瘍微小環境、または癌を取り囲む組織は、複数の癌^6,7における腫瘍の進行に関与しています。グリア芽腫腫瘍の微小環境、p星状細胞、ミクログリアおよび希突起膠細胞などの複数のグリア細胞、ならびに細胞外マトリックス、可溶性因子および生物物理学的因子を構成する、比較的特徴が低く、独特に複雑である。実験的に、アストロサイトおよびミクログリアは^10、9、神経膠腫の進行および浸潤^8を増加させること^が示されているが、天然のヒトの脳の微小環境内のすべてのグリア細胞の組成は不明です。

我々は以前微小環境のコンポーネントが定量的に神経膠芽腫微小環境の細胞成分を分析し、比例ハザードモデル¹¹に、私たちの分析を組み込むことにより、患者の生存を予測することができます示しました。ここでは、グリア芽細胞腫患者からの腫瘍切除の腫瘍バルクおよび隣接領域内のグリア細胞の集団を同定するための定量分析方法を説明するs。我々は、グリア細胞集団を同定するために発色免疫組織化学を使用し、各グリア集団の染色のカバレッジ率を分析するためにImageJを使用した。カバレッジ率を評価すると、細胞、特にがん細胞との相互作用によって影響を受ける細胞の形態学的相違を決定するための簡単な測定が行われます。組織病理学的染色を定量化するための以前の研究では、抗体ベースの免疫組織化学染色の特異性を利用していないヘマトキシリンおよびエオシン¹²またはマッソントリクロム¹³などの標準染色を使用しています。本発明者らの方法は、グリア芽細胞腫患者の腫瘍切除物中のグリア個体群を直接定量化するために開発されたものであり、これは複雑なグリア芽細胞腫の微小環境を解明することを目的とする。

プロトコル

このプロトコルは、ホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）サンプル中の細胞成分を同定する。パラフィン包埋により、細胞形態および組織形態の最良の維持が可能になるばかりでなく、切片の長寿命が向上する。この分析に用いたサンプルは、University of Virginia Biorepository and Tissue Research Facilityを介してアクセスしました。患者サンプルは、2010年から2013年の間にバージニア大学で腫瘍切除術を完了したグリア芽細胞腫（星状細胞腫、WHOグレードIV）の確定診断に基づいて神経病理学者によって選択され、この分析の前に同定解除された¹¹ 。

FFPEサンプル脱パラフィンおよび再水和

注：プロトコルのこの部分は、FFPEサンプルに固有です。パラフィン包埋されたサンプルは、細胞およびtの保存のために、この分析のためにより有用であり得るが形態解析を行う場合、この解析はフリーズしたセクションでも行うことができます。凍結切片を使用する場合は、この部分を省略して、発色免疫組織化学に直接進むことができる。

1. キシレン、キシレン、100％エタノール、100％エタノール、95％エタノール、95％エタノール、70％エタノール、脱イオン水、脱イオン水

抗原検索

注：プロトコールのこの部分は、FFPEサンプルのホルマリン固定中に形成されたメチレン架橋を破壊し、抗体が結合する抗原部位を露出させるために必要である。

1. トリスをベースとする高pH抗原非マスキング溶液を蒸留水中の製造業者推奨で希釈する。
2. マイクロウェーブを用いて熱媒介抗原回収を行う。他の形態の熱媒介回収（圧力鍋、野菜蒸し器、または沸騰水など）でも十分である。
   1. 希釈されたマスク除去溶液を密封されていない電子レンジに加える容器。スライドを容器に入れる。スライドを電子レンジに置きます。
   2. 高出力で20分間沸騰させる。蒸発のための液体レベルをモニターし、必要に応じて蒸留水を補充します。
3. 試料を室温で1時間溶液中で冷却させる。

3.発色免疫組織化学

1. サンプルをカバーするために必要な試薬の量を最小限にするために、疎水性ペンで組織サンプルを輪郭を描きます。
   注：組織サンプルを水和させた状態に保ち、染色効果に影響するため乾燥させないでください。
2. 組織サンプル（典型的には約100〜200μL）を覆うのに十分な透過性溶液（トリス緩衝化生理食塩水（TBS）+ 0.01％Triton-X）をピペットで加える。
3. 溶液を除去して廃棄し、ステップ3.2を繰り返す。
4. ブロッキング溶液（2.5％ウマ血清+透過液）で室温でサンプルをインキュベートする。
5. サンプルを4℃で一晩インキュベートし、一次抗体を希釈ブロッキング溶液中でインキュベートする。
   注：ここで使用したすべての一次抗体は1：200で希釈しますが、製造業者の推奨事項から始めて連続希釈を使用して最適希釈を決定することができます。このプロトコールで使用される抗体の詳細な情報は、以前に公開された¹¹ 。
6. 最初の抗体宿主動物に対応する西洋ワサビペルオキシダーゼポリマー試薬を使用して、製造元のプロトコルに従って、一次抗体を検出する。
7. 組織試料を覆い、5分間インキュベートするのに十分な透過性溶液をピペットで加える。
8. 溶液を除去して廃棄し、ステップ3.7を繰り返す。
9. スライドを1x TBS中の0.3％H ₂ O ₂中で15分間インキュベートする。
10. 所望の染色強度が得られるまで、ペルオキシダーゼジアミノベンジジン（DAB）基質を用いて2〜10分間サンプルを展開する。
11. サンプルを対比染色し、ヘマトキシリンなどの細胞核を、製造業者のプロトコルに従って同定する。
12. サンプルを100％脱水し、エタノールおよびキシレン。
13. サンプルをマウントメディアで恒久的にマウントします。

4.関心領域

1. 高解像度画像が可能な明視野顕微鏡下の画像スライド。
   注：イメージングセルラーコンポーネントは、最低20倍の解像度で使用してください。
2. 組織サンプル全体の関心領域にカメラを移動します。
3. 定量化のために画像をTIFFファイルとして保存します。

5.画像解析

1. カバレッジ率の定量化のためImageJで画像を開きます。
2. ヘマトキシリン染色された核から紫色を除去するには、Threshold Colorプラグインを使用します。
3. 画像を8ビットに変換します。
4. 暗い背景なしでしきい値を追加します。
5. 17個の予めロードされたImageJ閾値フィルタ（ すなわち MaxEntropy）の1つを使用して画像を処理し、DAB染色部分のみが閾値に含まれるようにする。
   注：minimizの最適な事前ロードされたしきい値フィルタを選択してくださいバックグラウンド染色の包含。これは、抗体の染色性および特異性に依存し得る。各患者サンプル内のすべての技術的複製に同じ閾値を使用する。
6. しきい値を適用します。
7. 閾値処理された画像の面積％を測定する。
8. 各サンプル内の複数の領域の平均カバレッジ面積。

結果

この分析のために、原発腫瘍バルクおよび拡散した浸潤性癌細胞を有する健康な組織（ 図1A 、 1B ）を主に含む隣接領域の2つの関心領域を、ヘマトキシリンおよびエオシン染色患者の神経病理学者と共同して同定したサンプル。各患者サンプル内で、発色免疫組織化学によるアストロサイト（ 図1C ）、ミクログリア（ 図1D ）、および希突起膠細胞（ 図1E ）の陽性染色が同定された。これらの集団は、それぞれ一次抗体ALDH1L1、Iba1、および乏突起膠細胞特異的タンパク質（OSP1）を用いて同定された¹¹ 。抗体希釈液の最適化と、染色が正確で陽性であるかどうかを確認するための製造業者のプロトコールとの協議が推奨される （ 図2...

ディスカッション

ここで提案された我々の方法は、伝統的な発色免疫組織化学を用いて染色された組織学的試料を分析する定量的アプローチである。このタイプの分析のための現在の方法論には、同様の染色プロトコール、続いて独立した病理学者による採点が含まれる。この方法は信頼性がありましたが、多くのアプリケーションでは、腫瘍に関連する異種性のより良い理解やin vitro研究のための腫瘍の正確な再現など、細胞構成のより正確な理解が必要です。

このプロトコルは、脳腫瘍微小環境内のグリア細胞の集団を定量的に分析するための直接的な技術を実証する。この技術は広く適応可能であり、血管、ケモカインなどの微小環境の他の多くの成分、ならびに乳房または膵臓のような他の癌を同定するために拡大することができ、腫瘍切除術ではより大きい実質領域。さらに、この技術は、細胞の形状、さらにより複雑な形態学的結果等方性、クラスター化、方向付けなどを評価するために、細胞のカウントおよび細胞周囲などの他の測定値を取得するために適合させることができる。これらの技術はまた、癌に限定されるものではない、という点で、これらの染色および定量化の方法論は、任意の脳...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
キシレン	フィッシャーケミカル	X3P
エタノール
高pH抗原アンマスキングソリューション	ベクターラボ	H-3301
TBS
Triton-X	アムレスコ	9002-93-1
馬の血清
抗ALDH1L1	アブカム	ab56777
アンチIBA1	アブカム	ab5076
抗オリゴデンドロサイト特異的タンパク質1	アブカム	ab53041
ImmPRESS 反ヤギ	Vector Labs	MP-7405
ImmPRESS Universal (anti-mouse/rabbit)	Vector Labs	MP-7500
過酸化水素	Sigma Aldrich	216763
ImmPACT DAB 基板	Vector Labs	SK-4105
ヘマトキシリン対比染色	ThermoScientific	72404
Histochoice 封入剤	Amresco	H157-475
Aperio Scanscope	Leica Biosystems
, Image Scanscope	Leica Biosystems
Super HT, PAP, Pen	Research Products International	195506