我々は、マウス肝臓および牛乳中のN-アセチルノイラミン酸およびN-グリコリルウラミン酸の定量のためのHPLCベースの方法を記載する。
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この記事について
サマリー
要約
CMAH（シチジンモノホスフェート-N-アセチルノイラミン酸ヒドロキシラーゼ）は、哺乳動物におけるシチジンモノホスフェート-N-アセチルノイラミン酸の酸化を担う。しかしながら、ヒトは、 CMAH遺伝子の一次エクソン欠失のために、シチジンモノホスフェート-N-アセチルノイラミン酸をシチジンモノホスフェート-N-グリコリルノイラミン酸に酸化することができない。 CMAH活性の欠如の影響および影響をより詳細に理解するために、マウスにおけるCmahノックアウトモデルは、基礎および応用研究に非常に興味深い。このマウスモデルの表現型を決定するための分析方法は、本明細書中に詳細に記載されており、野生型およびCmahノックアウトマウスの肝臓および乳汁中のN-アセチルノイラミン酸およびN-グリコリルウラミン酸の両方の検出に基づく。内因性シアル酸は、放出され、o-フェニレンジアミンで誘導体化されて蛍光発生誘導体を生成し、その後、HPLCによって分析することができる。提示されたプロトコルは、様々な他の起源の乳および組織サンプルの分析にも適用され、N-グリコリルノイラミン酸の栄養および健康への影響を調査するのに有用である可能性がある。
概要
N-アセチルノイラミン酸（Neu5Ac）およびN-グリコリルノイラミン酸（Neu5Gc）は、ほとんどの哺乳動物において最も一般的なシアル酸である1 。内因性のNeu5Acを合成することができるが、人間が原因CMP-Neu5Acをヒドロキシラーゼ2、3 CMAHをコードする遺伝子上の主要エクソン欠失へのNeu5Gcを産生することができません。しかし、動物性食品は、抗のNeu5Gc抗体の産生につながるのNeu5Gc 4、5、6の栄養源となり、したがってのNeu5Gc 7に対する免疫応答を誘発することができます。 Neu5Gcこの食物効果は、慢性炎症および種々の他の疾患8、9、10に寄与することが疑われます。 hでのNeu5Gcの効果を包括的に理解するために食品由来のシアル酸の影響を体系的に研究するための動物モデルが非常に望ましい。ノック....
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プロトコル
動物被験者に関する手順は、SPFに収容された動物を用いて、実験的動物福祉に関する国家ガイドライン（科学技術省、中国、2006年）に従って、南京農業大学の実験動物センターの倫理委員会によって承認されている施設（許可ID：SYXK-J-2011-0037）。
1. Cmahノックアウトマウスモデル
- 揚州大学（中国）の比較医学センターの野生型C57Bl / 6マウスを使用する。
注：CMAHノックアウトマウスもあるCMAH遺伝子のエクソン6から92個の塩基対を除去することによって商業的にCRISPR / Cas9 20ストラテジーを使用して前CMAHノックアウト研究17、19及び得られたのから提供された情報に基づいて生成されましたヒトCMAH遺伝子で欠失している19 。正のF 0 </サブ> -mice（2人）は、ヘテロ接合F 1 -miceを得るために、野生型マウスと交配しました。ヘテロ接合F 1 -mice（5個体）と交差した後、ホモ接合CMAHノックアウトF
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結果
記載された分析方法の概略図は図1に示されており、野生型およびCmahノックアウト突然変異体マウスの乳および肝臓サンプルからのシアル酸の単離およびこれらの成分の蛍光誘導体化およびHPLC分析が含まれる。 図2および図3は、ホモおよびヘテロ接合ノックアウトCmahマウス（ - / - および+/-）および野生型マウス由来の乳および肝臓試料の誘導体化シアル酸の代表的なHPLCクロマトグラムを示す。 図4は、HPLCピーク面積から計算した分析マウス試料のN-グリコリルノイラミン酸（Neu5Gc）の相対量を示す。
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ディスカッション
本明細書に提示されたプロトコールは、乳及び肝臓試料のNeu5Gcの相対量を分析及び定量することにより、ホモ接合Cmahノックアウトマウスの表現型評価を可能にする。分析は、蛍光検出を伴う標準的なHPLC設定を用いて行った。この手順の最も重要なステップは、陰イオン交換カラムの調製および陰イオン交換クロマトグラフィーの実施である。樹脂を適切に沈殿させ、適切な洗浄および溶出画分を集めることは、少しの練習を要する。
あるいは、本明細書で使用する誘導体化剤OPDは、より高価な誘導体化剤DMB（1,2-ジアミノ-4,5-メチレンジオキシベンゼン）で容易に置換することができる。さらに、得られたシアル酸誘導体を工程6.5から分析した。蛍光検出（ すなわち 、MS-2020検出器と結合したShimadzu Nexera UPLCシステム）の代わりに質量分析検出を用いて分析することもできる。 Aステップ7.2-7.6を適用すると、382.0および398.0のm / z比（これらはそれぞれ、Neu5Ac-OPDおよびNeu5Gc-OPDのH + -
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開示事項
著者は何も開示することはない。
謝辞
この研究は、中国の自然科学財団（助成金番号31471703、A0201300537および31671854、JVおよびLL）および100の外国人才能計画（助成番号JSB2014012からJV）によって部分的に支持された。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 化学薬品: | |||
| N-アセチルノイラミン酸 | シグマ | A0812 | |
| N-グリコリルノイラミン酸 | シグマ | 50644 | 1 mgアリコートは十分でなければなりません |
| -フェニレンジアミン | シグマ | 694975 | |
| 硫酸水素ナトリウム | J&K Scientific Ltd | 75234 | |
| ツール/材料: | |||
| 3 mL SPEチューブ | Supelco | Sigma 57024 | 固相抽出カラム |
| SPEチューブの流れを停止するための | ルアーストップコック | シグマ | S7396 |
| Dowex 1X8 | Dow Chemicals | Sigma 44340 | 200 - 400メッシュ |
| ダウンスティッシュグラインダー | Sigma | D8938 | tight fit |
| HPLC Analysis: | |||
| High-recovery HPLC vial | Agilent Technologies | #5188-2788 | |
| HPLC System | Shimadzu | Nexera | |
| HPLC用蛍光検出器 | 島津 | RF-20Axs | |
| HPLC カラム | Phenomenex | HypercloneODS | 250 x 4.6 mm |
| LCMS グレード H2O | Merck Millipore | #WX00011 | |
| LCMS グレード アセトニトリル | Merck Millipore | #100029 | Hypergrade |
| 水酸化アンモニウム溶液 | Fluka | #44273 | puriss. P.a. |
参考文献
- Lamari, F. N., Karamanos, N. K. Separation methods for sialic acids and critical evaluation of their biologic relevance. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 781 (1-2), 3-19 (2002).
- Irie, A., Koyama, S., Kozutsumi, Y., Kawasaki, T., Suzuki, A.
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再版と許可
