ネイティブポリアクリルアミドゲル電気泳動は、RNA-タンパク質相互作用を分析するための基本的なツールです。伝統的に、ほとんどの実験では垂直ゲルが使用されています。しかしながら、水平ゲルは、電気泳動の間に複合体をモニターする機会のようないくつかの利点を提供する。我々は、水平ネイティブゲル電気泳動を生成および使用するための詳細なプロトコールを提供する。
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この記事について
サマリー
要約
ネイティブポリアクリルアミドゲル電気泳動は、RNA-タンパク質相互作用の生化学的分析に広範に使用されている分子生物学の基本的ツールである。これらの相互作用は、伝統的に、2枚のガラスプレートの間に生成されたポリアクリルアミドゲルおよび垂直に電気泳動されたサンプルで分析されてきた。しかし、ポリアクリルアミドゲルは、トレイにキャスティングされ、水平に電気泳動されると、いくつかの利点をもたらす。例えば、蛍光RNA基質と特定のタンパク質との間の複合体を分析するために使用される水平ゲルは、電気泳動が進行するにつれて複数回画像化することができる。これは、実験中のいくつかの時点でRNA-タンパク質複合体をモニターする独特の機会を提供する。さらに、水平ゲル電気泳動は、多数の試料を並行して分析することを可能にする。これは、時間経過の実験を大幅に促進するだけでなく、複数の反応を同時に分析して、異なる成分および条件を比較することができる。ここで私たちはprRNA-タンパク質相互作用を分析するための水平ネイティブゲル電気泳動を生成および使用するための詳細なプロトコルを提供する。
概要
電気泳動移動度泳動シフトアッセイ（EMSA）は、特定のタンパク質-核酸相互作用1、2、3を分析するための貴重な生化学的ツールであることが証明されています。これらのアッセイは、核酸 - タンパク質複合体1の成分化学量論であるRNAまたはDNA 3に対するタンパク質の結合親和性に関する重要な情報を提供し、基質競合実験1を介したRNA結合タンパク質の結合特異性に関する重要な新しい洞察を提供する。
これらのアッセイのための従来の実験装置は、精製されたタンパク質を放射性標識されたRNA基質と混合することからなる。次いで、得られた複合体を、2つのガラスプレートの間に注がれた非変性（天然）ポリアクリルアミドゲルで分析し、次いで垂直装置3でサンプル電気泳動を行う。このアプローチは、タンパク質の核酸への結合の基礎をなす生化学的メカニズムにおける重要な洞察を提供するために徹底的に使用されてきたが、いくつかの制限もある。例えば、この基本戦略はスループットが比較的低く、多くの結合反応を並行して分析する必要がある用途には容易に適応できない。加えて、従来の縦型装置では、潜在的に電気泳動図3、 図4中に複数回に錯体を監視することが困難です。
ここでは、フラットベッド装置で鋳造ネイティブポリアクリルアミドゲル、水平電気泳動および蛍光標識されたRNA基質4、5、6、7を使用するEMSAアッセイの適応を提示します。これらの比較的簡単な変更を基本的なひずみに組み込むことtegyはいくつかの強力な利点を提供します。特に、水平フラットベッドフォーマットは、数十のサンプルを同時に分析するのに適しています4 。また、Bicaudal-Cタンパク質とそのRNA基質との間に形成されるRNA-タンパク質複合体の場合、水平ゲル中での電気泳動は、異なるRNA-タンパク質複合体を分離し、これらを非結合RNA基質から区別する能力を高める。
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プロトコル
水平ネイティブポリアクリルアミドゲルの調製4 。
- 必要な材料の準備。
- 水平ゲル装置の場合は、27cm×21cmのトレイを備えたゲルボックス（37cm×24cm）を使用し、2つの24ウェルコームの容量を使用します。この設定では、合計48個のサンプルを同時に分析できます。
- 40％アクリルアミド - ビス19：1,5x TBE（Tris-ボレート-EDTA pH8.0）、TEMED、および10％APS（過硫酸アンモニウム）の試薬を調製する。
- 10％天然アクリルアミドゲルの生成。
- 500mLのフラスコに、80mLの5×TBE、100mLの40％アクリルアミド、および水を最終容量400mLまで加える。
- 10％APS 4mLとTEMED400μLを加える。よく混ぜます。
- 混合物を水平キャスティングトレーに注ぎ、ゲルを30分間重合させる。ゲルの厚さは約2cmです。
注：ゲルはヒュームフードでキャストしてスピードを上げることができます重合を開始する。重合後、薄い液体層がゲルの上に残る。 - 液体を注ぎ、ランニングバッファーですすいでください。慎重に櫛を外し、シリンジを使用してランニングバッファーでウェルをリンスします。
- ランニングバッファーの準備。
- ゲルボックス用の1x TBEランニングバッファー2 Lを調製する。 400mLの5XTBEを1600mLで希釈し、混合する。冷たい部屋に1x TBE緩衝液を入れて冷ます。
- ゲルのプレ - ランニング
- 2Lの冷たいランニングバッファーをゲルボックスに加え、ゲルを挿入する。
- 冷たい部屋で4℃、1時間、120Vでゲルをプレランします。この間、結合反応を準備する。
2.結合反応8
- 2.1。以下の反応成分を調製する。
20mM DTT
10mM BSA
10mM酵母tRNA
5X結合緩衝液（50mM HEPES pH8.0,5mM EDTA、25μl0mM KCl、0.2％Tween-20）
市販されている100nMフルオレセイン標識RNA
濃縮されたBicaudal-Cタンパク質
DEPC処理H 2 O中の50％グリセロール
DEPC処理H 2 O - 結合反応成分をRNaseフリーの微量遠心チューブに集める。
- チューブに、5μLの10mM BSA、5μLの20mM DTT、5μLの10mM酵母tRNA、10μLの5×Binding Bufferを加えます。
- タンパク質を50μL中250nMの最終濃度に添加する。 45μLの最終容量に水を加える。
- 5μLの蛍光標識RNA基質を添加する。市販の3 'フルオレセイン標識32-ヌクレオチド基質を使用する。
- 混合し、室温で30分間暗所でインキュベートする。
3.ネイティブ水平ポリアクリルアミドゲル上の試料の分析
- 各反応に、50μLのグリセロール15μLを添加し、穏やかに混合する。
- ケアフー各反応液30μLをゲルに加える。単一のウェルに充填することができる試料の量は、ゲルの厚さおよびウェルのサイズに依存して変化する。私たちは、24ウェルの櫛で作製したゲルの1ウェルに、15μLと45μLという少量を充填し、2cmの厚さに注いだ。
- 電源をゲル装置のスイッチに接続して電源を入れ、電圧を調整します。ゲルを4℃、120Vで反応させる。
注：水平ゲル装置の場合、これは約5V / cmになる。縦型ゲル装置の場合、これは16V / cmである。- 蛍光標識されたRNAの損傷または漂白を防ぐために、暗所で電気泳動を行います。
- 分析されるRNA-タンパク質複合体の特性に応じて電気泳動時間を変化させる。
注：水平EMSA分析の主な利点は、電気泳動を停止し、ゲルを画像化し、次にゲルlを装置に戻すことができ、電気泳動をより長い時間続けることができる。
4.ゲルのイメージング
- 蛍光基質の検出とイメージング用に設計された任意の機器で分析を行います。
- イメージャにゲルを置きます。
- イメージャの設定を調整します。フルオレセイン標識RNAリガンドについては、以下の設定を用いる：FAM（波長473nm）、750光電子増倍管電圧（PMT）、100μmピクセルサイズ。
- ゲルをスキャンして画像をキャプチャします。
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結果
水平ネイティブゲル電気泳動の力と汎用性を実証するために、我々はBicc1結合部位を含む蛍光標識されたRNAをアフリカツメガエル Bicaudal-C（Bicc1）タンパク質の結合を分析しました。 Bicc1タンパク質は、動物の開発9の母体段階の間の細胞運命決定を制御するために、mRNAを特異的翻訳リプレッサーとして機能10、11、12、並びに成人13における特定の器官の機能、14。 Cripto-1 mRNAの8、12の3'UTRから32ヌクレオチド領域：
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ディスカッション
ネイティブポリアクリルアミドゲルは、タンパク質-RNA相互作用を調査し、伝統的に、これらのゲルを上下に2、3電気泳動するための貴重なツールです。我々が作成され、水平方向に1、4、6、7、15電気泳動ネイティブポリアクリルアミドゲルを代入プロトコルの変形を使用しています。蛍光標識されたRNA基質と組み合わせて使用されるこれらの変化は、タンパク質-RNA結合相互作用の生化学分析に多数の利点を提供する。これらの利点には、緩衝液を下部チャンバから上部に移すためにポンプを必要とする垂直装置と比較して、緩衝液の混合が単純化されており、水平のゲルは、水平ゲル電気泳動は、しばしば、垂直ゲルと比較してRNA-タン...
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開示事項
著者は何も開示することはない。
謝辞
フィギュアを準備してくれたLaura Vanderploegに感謝します。 Sheetsラボでの作業は、NSFグラント1050395とNIHグラント（R21HD076828）によってサポートされています。 Ryderラボの研究は、NIHグラントR01GM117237とR01GM117008によってサポートされています。 Megan Dowdleは、国立衛生研究所（T32GM008349）の全米医科学研究所を通じて、ウィスコンシン大学マディソン大学院大学およびバイオテクノロジー訓練プログラムを通じて、SciMed GRS Advanced Opportunity Fellowshipの支援を受けています。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| ホリゾンタルジェルボックス | OWL | N/A | 製品はもう製造されていません。同様のゲルボックスは、Thermo Scientific の A シリーズゲルボックスでも見つけることができます。カタログ番号:A2-BP |
| 24ウェル大型大型水平ゲル電気泳動コームフ | クロウ | N / A | 製品はもう作られていません。同様のジェルボックスは、Thermo ScientificのAシリーズゲルボックスコームで見つけることができます。カタログ番号: A2-24C |
| Powerpac 300 | Bio-Rad | 1655050 | |
| Mini-Protean II 電気泳動細胞 | Bio-Rad | 165-2940 | |
| InstaPAGE-19 40% 19:1 アクリルアミド/Bis | IBI | IB70015 | |
| TEMED | IBI | IB70120 | |
| APS | IBI | IB70080 | |
| 酵母 tRNA | Ambion | AM7119 | |
| フルオレセイン標識 RNA | IDT | N/A | 注文は、長さと希望の配列にカスタムすることができます |
| EDTA四ナトリウム塩水和物 | Sigma-Aldrich | E5391-1KG | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034-500G | |
| トリスベース 超高純度 | US バイオロジカル | T8600 | |
| ホウ酸 | フィッシャーサイエンティフィック | BP168-500 | |
| 塩化カリウム | フィッシャー・サイエンティフィック | BP366-1 | |
| Tween-20 | フィッシャー・サイエンティフィック | BP337-500 | |
| DEPC | シグマ・アルドリッチ | 1609-47-8 | |
| ジチオスレイトール (DTT) | シグマ・アルドリッチ | 3483 12 3 | |
| ウシ血清アルブミン (BSA) | シグマ・アルドリッチ | 9048-46-8 |
参考文献
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