方法論記事

体内と組織や細胞植アプローチを使用して形態形成と胚および周産期の大動脈の病因を研究するには

DOI：

10.3791/56039

⸱

2017年9月12日

 ,  ,  ,  , 
1Yale Cardiovascular Research Center, Section of Cardiovascular Medicine, Department of Internal Medicine, Yale University School of Medicine, 2Department of Neurology, Yale University School of Medicine, 3Department of Neurology, Xinhua Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ここで体内のクローン解析運命マッピング、大動脈植と単離平滑筋細胞の詳細を使用して萌芽期および周産期のマウス大動脈を勉強するためのプロトコル。これらの多様なアプローチは、通常開発の萌芽期および周産期の大動脈の疾患の病態形成の調査を促進します。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

大動脈は体の最大の動脈です。大動脈の壁は、内皮細胞の内側の層、中間層の弾性線維板と平滑筋細胞 (SMCs) 交互になると線維芽細胞と細胞外マトリックスの外側の層で構成されます。病態モデル (例えば、アテローム性動脈硬化) 成人の大動脈での広範な研究とは異なり、はるかに少ない胎生期および周産期の大動脈について知られています。ここでは、我々 は平滑筋細胞に焦点を当てる形態形成の解析や正常な開発および病気の胎生期および周産期大動脈平滑筋細胞の病因のプロトコルを提供します。具体的には、4 つのプロトコルが含まれている: 私)生体内で胚運命マッピングとクローンの解析;ii) 胚大動脈培養;周産期の大動脈; iii) SMC 分離・ iv) 妊娠 (または非妊娠) マウス皮下浸透圧ミニ ポンプ配置。したがって、これらのアプローチは、origin(s)、運命、そして大動脈の生体内における平滑筋細胞のクローン構造の調査を促進します。薬理学的エージェントへの継続的な暴露によって胚大動脈形態形成子宮内で調節できます。さらに、孤立した大動脈組織外植片または大動脈平滑筋細胞は muscularization、増殖、移動などの基本的なプロセスの間に特定の遺伝子ターゲットの役割に洞察力を得るために使用することができます。孤立した平滑筋細胞と器官培養切片の大動脈にこれらの仮説を生成する実験は、薬理学的および遺伝的アプローチを通じて体内のコンテキストで評価できます。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

多細胞生物の細胞に栄養素と酸素を提供する関数の循環システム、ない外部環境と接触して、これらの細胞からの老廃物や二酸化炭素を削除します。脊椎動物、主循環システムは、ポンプ血血管のシリーズを通して、心で構成されます。動脈や、静脈などの太い血管の壁から成っている 3 つの層: 私) 内膜や血管内皮細胞の内側の層ii) メディア、または交互に円周方向の中間層細長い平滑筋細胞平滑筋細胞と弾性線維板;および iii) 外膜や結合組織、線維芽細胞の外側の層。血管生物学の研究の大半は血管内皮細胞に焦点を当てる、血管新生を新しい内皮細胞ライニング管の形成を調査します。比較では、平滑筋細胞は、比較的ほとんど注目を します。ただし、平滑筋細胞、血管病理、通常の動脈壁の建設に重要な細胞タイプです。

大動脈は心臓の左心室からの心拍出量を受けて体内最大口径動脈です。それは、多様な人間の病気、動脈硬化、動脈瘤、解離などに悩まされています。大人の有機体の大動脈とその主要な枝に激しく調査血管疾患のモデルで。例えば、供給が低比重リポ蛋白受容体またはアポリポ蛋白 E 遺伝子の null マウス高脂肪食を開発、動脈硬化と運命のマッピングの最近の研究を示す既存の平滑筋細胞がの種類の細胞に上昇を与える、動脈硬化性プラーク1。大動脈瘤の病理学的変化があります SMC アポトーシスと細胞外マトリックス2,3を改造します。

大幅に少ないは胎生期および周産期の期間中に SMC の形態形成と病態について知られています。ここでは、胎生期および周産期大動脈平滑筋細胞体内の組織移植片の細胞を研究するためプロトコルを提供します。例えば、プロトコルの最初のセクションは、運命とマウス胎仔のクローン解析を区切ります。セル固有のプロモーターの制御下を表明した Cre リコンビナーゼを容易に特定のセルのマーキングとその子孫4,5,6;ただし、セル固有のラベルの時間的制御はマウスの萌芽期の開発中に挑戦することができます。この文脈において胚平滑筋細胞 (e.g.,Myh11またはActa2)、Cre 記者プロモーターの下で条件付きクレエを表現する私たちを提供タモキシフェンまたはその活性代謝物 4-オハイオ州 - にタモキシフェン妊娠中ダムを注入するための方法胚や生後の子孫の標識細胞を分析するため。さらに、運命のマッピングの研究、主に利用する単一記者 fluorophore1,7と Cre 記者と対照をなしてクローン解析大幅にマルチカラー Cre 記者と強化されています。

プロトコルの 2 番目と 3 番目のセクションでは、分離、それぞれ胚大動脈および新生児期から大動脈平滑筋細胞を培養するための方法を説明します。こうした方法により、特に大動脈弁植の平滑筋細胞のシグナル伝達経路の操作と薬理学的エージェントの直接影響を分析します。したがって、マウスの伝統的な遺伝子操作をよりもはるかに速い方法で興味のティッシュの特定の遺伝子の役割を検査します。さらに、孤立した SMC 研究細胞遊走の解析が容易し、付着性は、技術的には、限定の生体内。

最後に、4 番目のプロトコル セクションは、皮下浸透圧ミニ ポンプ搭載されて妊娠中 (または非妊娠) のマウスにおける薬理学的エージェントの配置を区切ります。このメソッドは、急速な代謝のための連続的な注入を必要とするエージェントによる胚の発育に及ぼす影響の分析を促進します。頻繁に注射の代替多くの代理店のための実用的ではない、それは妊娠中のダムにかなりの不快感を引き起こす可能性があります避ける必要があります。

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プロトコル

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マウスのすべてのプロトコル、動物介護制度とイェール大学で利用委員会によって承認されています

。

1 体内 胚運命マッピングとクローン解析

注: 我々 は広く細胞モデルの開発と疾患モデルでクローン アーキテクチャの起源を評価するこれらのアプローチを使用している。 7, 8, 9, 10.

  1. 、クレエでマウスと Cre 記者とマウスの間で合うを設定します
    。 メモ: クレエは SMC マークの使用します。Myh11 CreERT2 または Acta2 CreERT2 マウス 11 , 12 は、この目的のため使用されます。我々 は広く萌芽期ティッシュをマークするため ROSA26R CreERT2 マウス 13 を使用しています。
    1. クローン解析のマルチカラー Cre 記者 (例えば 紙吹雪や虹 [Rb] マウス) 8 , 14 , 15 を使用し、運命のマッピングを使用して、単色 Cre 記者 (例えば、 ROSA26R YFP マウス 16) または二重色 Cre 記者 ROSA26R-mTomato-mGFP (mTmG) 17.
      注: この育種方式を使用して成体 2-6 ヶ月前 (一般に 〜 30 g)、胚、クレエと Cre 記者が生成されます
      2. 。
  2. 朝は、金属を使用して膣にプラグ プローブして萌芽期の日 (E) 0.5 としてプラグ検出の日の正午をチェックします
    3. 。
  3. プラグインが検出されたとき男性から女性を区切ります
    4. 。
  4. 準備 4-オハイオ-タモキシフェンとタモキシフェン作業ソリューションを。
    1. 4-オハイオ-タモキシフェンの 100% エタノール、2 分間渦の 50 μ L に 5 mg を溶解し、コーン油の 450 μ L を追加。氷の上には、サイクル サンプルが冷えるまでの間休憩 10 秒サイクルの出力レベル 2 で超音波を照射します。サンプルは、完全に溶解した後 (通常 〜 超音波照射の 4-5 サイクル) 熱量溶液 200 μ L をとり、最終的な作業ソリューション (4-オハイオ-タモキシフェン 1 mg/mL) にするためコーン油の 1,800 μ L に溶解します
      2. 。
    2. 50 mg/ml 100% エタノールと渦に希釈、タモキシフェンのそれが溶解するまで。完全に溶解して 45 ° C で攪拌し最終的な作業ソリューション (タモキシフェン 10 mg/mL) コーン油で希釈
      3. 。
  5. 初期胚誘導の注入 4 ああタモキシフェン腹腔妊娠中のダム。
    1. 4 ああタモキシフェン注射 (妊娠中のマウス、または約 5 mg/kg 体重あたりまで 〜 150 μ g) を使用して、E5.5 で、その後彼らは実行可能なダムや胚、子犬をもたらすと
      2. 。
    2. 0.5 - ダムの胚で妊娠中の 1.5 mg (または 17 〜 50 mg/kg) の投与量で使用タモキシフェン 〜 E9 以降。すべての注射の 30 G の針を使用します
      。 注: 0.22 μ m のフィルターによるろ過は注入前にすべての混合物を殺菌する通常使用されます。
  6. クローン解析 4-オハイオ-タモキシフェン (例えば、5 mg/kg) またはタモキシフェン (例えば、50 mg/kg) に複数の細胞の高用量の腹腔内注射を使用します。
      個々 のセルをマーク、4 ああタモキシフェンまたはタモキシフェン投与量を滴定しなさい、興味 (すなわち 大動脈) の組織で分析 (このセクションの終わりに後述) としてほぼすべての胚があるないラベルのセルまたはセルだけに
    1. 単一の色。これはしきい値線量です
      2. 。
  7. 中期後期妊娠期間で細胞をマークし、彼らの運命やクローナリティ生後早期のマウスでトレースする注入プロゲステロン腹腔妊娠中のダムの付随して 1:2 (プロゲステロン: タモキシフェン) でタモキシフェンと線量比
    。 注: タモキシフェン投与が 17 〜 50 mg/kg とプロゲステロンの用量は 8.5 〜 25 mg/kg (すなわち、タモキシフェン投与の半分)。プロゲステロン注射は、1 〜 2 日で労働を遅らせる可能性があります
    8. 。
  8. 安楽死綿やガーゼを含む容器にダムを配置する場所、オープン ドロップ方法を使用希望年齢の胚で妊娠中のダムは、原液イソフルランを浸した。気胸を誘導するために胸腔を開くことで、重要な臓器を削除することによってまたは頚部転位を実行することによって死を確認します
    9. 。
  9. は、70% エタノールで腹部を浄化します。腹部を切開し、子宮を解剖はさみを使用します。子宮から胚を外し、慎重に胎盤や鉗子を使用して卵黄嚢胚から分離します
    10. 。
  10. 頚部転位または手術用はさみで斬首や鋭い刃を実行して E15 以上の胚を安楽死させる
    。 注: E15 より若い胚は急速に母の安楽死および/または母から胚の除去に続いて死ぬ
    11. 。
  11. 氷冷 PBS で胚を置き、クレエと Cre のレポーターの遺伝子型にはさみを使って尾の小さな部分をカットします
    12. 。
  12. PBS で 3 回胚 2 h. 洗浄のための 4 ° C で 4% パラホルムアルデヒドで胚を修正し、30% スクロースを PBS で 2 日間かかることがあります彼らが沈むまで待って 15 mL チューブに胚をインキュベーションしています
    13. 。 凍結
  13. 塗りつぶしプラスチック金型の最適切削温度 (OCT) 化合物の最大レベルの 2/3 まで。室温気泡を最小限に抑える (RT) で 10 分間 10 月加温で完全に水没、金型でそれぞれの胚を垂直方向に配置します
    14. 。
  14. 凍結するティッシュのブロックをドライアイス、凍結する 70% エタノールお風呂で直立した場所。-80 でブロックをストア ° C
  15. は-22 ° c クライオスタット温度を設定し、全体の大動脈、10-20 μ m の厚さを横断を生成するブロックをカットします。RT-80 でそれらを格納する前に 30 分間のスライドを乾燥 ° C
  16. は、RT、fluorophores の漂白を避けるために光から保護でスライドを解凍します。0.1% PBS Tween20 とスライドを洗います。
    1. クローン解析核 (DAPI、5 mg/mL) のスライドを染色し、直接画像虹 Cre 記者の他のフルオロ (セルリアン: 433 nm 励起 max, 475 nm 蛍光最大; mOrange: 548 nm、562 nm; mCherry: 587 nm, 610 nm)。
      1. 正立型蛍光顕微鏡で蛍光物質を検出するために、次のフィルター使用: DAPI (励起/最大帯域幅 350/50 nm、排出量最大/帯域幅 460/50 nm)、セルリアン (励起 436/20 nm、発光 480/40 nm), テキサスの赤 (励起 560/40 nm、発光 630/75 nm) と mOrange (励起 577/10 nm、発光 630/50 nm) から mCherry を分離するカスタム フィルター
        2. 。
    2. MTmG Cre 記者と運命のマッピング、GFP を検出 (484 nm、510 nm)、直接イメージングまたは免疫染色を用いた。正立型蛍光顕微鏡イメージングのため GFP フィルター (励起 470/40 nm、発光 525/50 nm) を使用します
      3. 。
    3. 免疫染色、4 ° C で一晩一次抗体を持つセクションを孵化させなさい、0.1% で PBS でトリトン X-100 を洗浄し 1 h. 使用反 CD31 の二次抗体とインキュベートし (最終濃度 0.0016 mg/mL)、抗 GFP (0.006 mg/mL) と。Cy3-直接共役アンチ SMA (1: 500 最終希釈倍率の一次抗体と二次 antibodie を使用フルオロ (1: 500 最終希釈) (材料の表 を参照) を直接共役 s.
  17. 正立型蛍光顕微鏡でスライドを画像 (倍率: 4 X - 20 X) または共焦点顕微鏡 (10 X-63 X)。高倍率 1.4 0.6 の開口と 1,024 x 1,024 ピクセルのフレーム サイズ油目的 x 共焦点イメージングの 63 を使用します
    18. 。

2。胚大動脈文化を外植体

注: このアプローチ、explanted の狭窄に beta3 のインテグリンの役割を評価に使用していた 今回の Eln (-/-) 胚大動脈 9 , 18.

  1. 上 1.8、ステップごとの過剰イソフルラン吸入による E15.5 でタイミング妊娠中ダムを安楽死させる
    2. 。
  2. 収穫上 1.9-1.10 の手順に従って、胚を安楽死させると
    3. 。
  3. 葉末胚の位置し、解剖ボードに拡張四肢をピンします。郭清堅実で視覚化し、上部胸郭に胸骨を通じて腹部から縦切開をカットするはさみを使用してください。解剖まで胸腺、気管、肺、食道、肝臓、腸管
    4. 。
  4. ゆっくりと引き腹鉗子を用いた心臓、胸部および腹部の空洞の背側面から大動脈の解剖はさみを使っています。大動脈を解放するために近位のルートと遠位腹部位置カットします
    5. 。
  5. は、携帯文化フードで氷冷滅菌 PBS に大動脈を配置します。24 ウェル プレートに大動脈を転送し、DMEM で 0.5% で培養 37 24 h までの FBS ° C
    注: 培養培地はブロッキング抗体 (例えば、 0.02 mg/mL 9 時 αvβ3 抗体を抗インテグリン; 参照 テーブルの材料) や薬理学的エージェントと補われることができます
    6. 。
  6. 20 分の 4% パラホルムアルデヒドで固定し、PBS で 2 回大動脈を洗う
    7. PBS のショ糖を
  7. PBS と 30% で 1.5 mL チューブへの転送、大動脈で 3 回洗う。大動脈は流し後、する凍結するティッシュのブロック、カット セクション、および immunostain、1.13 1.15 の手順で上記のよう
    8. 。

3。周産期の大動脈から SMC 分離

注: このアプローチは現在周産期マウス Eln (-/-) と野生型マウスから分離した大動脈平滑筋細胞の生物学を比較する使用されている

。
  1. 、マウス子犬生後 (P) で 0.5、頚部転位または手術用はさみで斬首刑のいずれかまたは鋭い刃、1.10 の手順に記載されている上記安楽死
    2. 。
  2. は、2.3 の手順を実行し、胸部・腹部を開くと後、23 G 針で左心室を穿刺します。滅菌 PBS 含む注射器に針を接続するプラスチック製のチューブを使用は、PBS が重力によって左心室に流し込まれるように高い位置で垂直に開催。ブランシュは肝臓までは、左心室に滅菌 PBS の注入を許可します。
    1. 鉗子を使用して大動脈の外側に外の組織を削除し、ステップ 2.4 で説明されているように、大動脈を解剖します
      2. 。
  3. DMEM の単一のソリューションで大動脈をダイジェスト 225 U/mL コラゲナーゼ、2.25 U/mL エラスターゼ 1 x 37 ° C. 手動で振るの 45 分の抗生物質抗真菌とチューブ 5-10 分毎で補われる (500 μ L)
  4. 無菌細胞文化フード、titurate、上下単一細胞懸濁液を生成する 200 μ L ピペットでピペッティングによる消化組織。単一細胞懸濁液を 15 mL チューブに転送、DMEM、2 mL を加えるし、5 分 25 で 920 × g で遠心分離機 ° C
  5. は、上清を捨てます。SMC 培養液 (10 %fbs 添加 1 μ G/ml rhFGF、10 μ G/ml rhEGF、100 U/mL ペニシリン/ストレプトマイシン、2.5 μ g/mL アムホテリシン B を含む DMEM) 3 mL の細胞ペレットを再懸濁します。35 mm 培養プレートに転送します
    。 注: 最初の分離時に単一 P0.5 野生型大動脈; から取得されます ~ 400,000 セル~ 300,000、これらの細胞は平滑筋細胞
    6. 。
  6. は 37 ° C で細胞の培養し、新鮮な SMC 培 3 日ごとに変更します。標準的な手法を使用して、トリプシン、合流するときのセルを通路します。実験、3-7 の通路からセルを使用します
    7. 。

4。皮下の妊娠 (または非妊娠中) 浸透圧のミニ ポンプ配置マウス

注: このアプローチは以前に使用した (例えば、 インテグリン β3 と β5 阻害剤の薬理学的エージェントを継続的に提供するにはcilengitide) 胚の 子宮内で 9 に。ポンプが E13.5 に妊娠中のダムで挿入され分娩まで維持されます

。
  1. 麻酔と酸素 (1 L/分の流量) 誘導とメンテナンスのための 1-3% の 2-5% イソフルレン マウス。麻酔のレベルを監視するつま先ピンチ反射を使用し、必要に応じて麻酔薬を調整します。鎮痛に対する皮下ブプレノルフィン (0.05 - 0.1 mg/kg) を管理します
    2. 。
  2. は、背中の下部をバリカンで剃る。滅菌ドレープ、手袋、および計測器を使用し、手術中に加熱外科板でマウスを維持します
    3. 。
  3. 腹臥位でそれぞれにマウスを置き、イソプロピル アルコールに続いて betadine で背中をスクラブします。3-5 cm より低い背部の尾の根元に吻側水平皮膚切開 0.5 - 1.0 cm の基になる筋肉を傷つけることがなく長さを作るメスを使用します
    4. 。
  4. 挿入、止血、切開、止血顎の開閉によりポンプ注入の吻方皮下ポケットを作成します
    5. 。
  5. は、メーカーごとの選択のエージェントにミニ浸透圧ポンプを埋める ' s ガイドライン (材料の表 を参照してください)。ポケットにいっぱいポンプを挿入し、クリップまたは 6-0 非吸収性縫合糸で切開を閉じる。総手術時間が 10 分未満であることを確認
  6. は, 胸骨の横臥から回復が彼らまでマウス 15 分毎を監視します。48 時間毎の 6-12 h 皮下ブプレノルフィン (0.05 - 0.1 mg/kg) を管理します。マウスは、全身麻酔から完全に回復して、毎日それらを監視します。クリップの削除手術 7-10 日後に縫合糸またはします
    7. 。

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結果

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代表的なクローン性解析で平滑筋細胞のEln (細胞外マトリックス蛋白質エラスチン遺伝子) の変異株の胚運ぶまた Eln(+/-) マウスにEln(+/-)、Acta2 クレエT2マウスを交配、マルチカラー ROSA26R(Rb/Rb)記者。手順 1 で説明したプラグがチェックされ、E12.5 で単一タモキシフェン注入 (1.5 mg) で誘導された妊娠中のダム、彼らが E18.5 で犠牲になった。胚は、収穫、固定、冷凍、および誘因でした。横行大動脈凍結切片を降順がカットされました。Eln(+/-)、Acta2 クレエT2からのセクションROSA26R(Rb/+) 今回の Elnに蓄積する過剰な内側の層の平滑筋細胞胚を示す-null マウス (E15.5 以降) は、複数の色 (によって示される

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ディスカッション

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マウスの大動脈とその主要な枝動脈硬化のモデルなど、大人の病理学の条件の広範な調査とは対照的形態形成と胚および周産期の大動脈の病原性について知られています。ここでは、具体的には平滑筋細胞、胚/周産期大動脈に着目し、体内組織植を介して大動脈を研究するためのプロトコルを提供し、SMC の分離方法します。これらの無料の方法は、胚/周産期の大動脈を研究する様々 なアプローチの調査官を提供します。

クローン解析は、個々 のセルの動作を調査することができます非常に強力な方法です。最近10肺血管に特殊な平滑筋細胞を識別するためにこの方法を使いました。マルチカラー Cre 記者を運ぶ個体のマウス、同じ色のセルが 1 つ以上の再結合イベントから派生するチャンスがあることを認識が重要です。したがって、マルチカラー記者とクローンの解析には、多数のマウスの評価が必要となります。中期後期妊娠期間にタモキシフェンが中期後期妊娠期間で細胞をマーク、後天的、それらをトレース実験のための分娩に干渉するためプロゲステロンとタモキシフェン付随して注入する必...

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開示事項

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著者が明らかに何もありません。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

大動脈の SMC 分離のための彼の実験室のプロトコルを共有を学部長の李を感謝いたします。アメリカ心臓協会、国立衛生研究所 (R21NS088854、R01HL125815、および R01HL133016 D.M.G に) によって提供された資金援助 (D.M.G. に科研費 14GRNT19990019)、イェール大学 (午前にブラウン コックス交わりと起動D.M.G. に資金)。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
タモキシフェンシグマT5648
油シグマC-8267タモキシフェン
4-OH-タモキシフェンシグマH7904活性代謝物タモキシフェン
プロゲステロンシグマP8783-5Gの半分の濃度でタモキシフェン
OCT化合物サクラティッシュテック4583オブロックを作るため
CryomoldsPolysciences inc18986
DAPISigmaD9542IHC staining of nucleus, final concentration 5 mg/mL
Cy3 directly conjugated anti-SMA antibodySigmaA2547IHC staining of SMA, final dilution 1:500
Anti-CD31 antibodyBD Pharmingen550274IHC staining of GFP, final concentration 0.006 mg/mL
抗GFP抗体サーモフィッシャーサイエンティフィックA-11121IHC染色 CD31、最終濃度 0.0016 mg/mL
二次抗体 ヤギ抗ウサギ、Alexa 647Life Technologiesa21244IHC染色、最終濃度 0.004 mg/mL
抗体ヤギ抗ウサギ、Alexa 488Life Technologiesa11008IHC染色、最終濃度 0.004 mg/mL
DMEMサーモフィッシャーサイエンティフィック10567-014細胞培養用
FBSサーモフィッシャーサイエンティフィック10437028
抗インテグリンβ3ブロッキング抗体BD Biosciences553343Clone 2C9.G2、最終濃度 0.02 mg/mL
コラゲナーゼWorthington Biochemical Corp44H14977A大動脈の消化用
エラスターゼWorthington Biochemical Corp34K15139大動脈の消化用
抗生物質-抗真菌薬 (100X)サーモフィッシャーサイエンティフィック15240062
組換えヒト FGFPromegaG5071
組換えヒト EGFPromegaG5021
ペニシリン/ストレプトマイシン (10,000 U/mL)サーモフィッシャーサイエンティフィック15140122
アムホテリシン Bサーモフィッシャーサイエンティフィ15290026
組織培養プレートコーニングCLS430165
アルゼット 浸透圧ミニポンプDurect Corporation2001
ECLIPSE 80i Upright蛍光顕微鏡ニコン 
 TCS SP5Leica
Branson Sonifier 450VWR
Myh11-CreERT2 マウスジャクソン研究所 19079
Acta2-CreERT2 マウスPierre Chambon 博士と Daniel Metzger の研究室から入手
ROSA26R-CreERT2 マウスジャクソン研究所 8463
ROSA26R(mTmG/mTmG)マウスジャクソン研究所  
ROSA26R(EYFP/EYFP)マウスジャクソン研究所  006148 
ROSA26R(Confetti/紙吹雪)マウスジャクソン研究所 13731
ROSA26R(Rb/Rb) マウスIrv Weissman 博士研究室 Irv Weissman
コーンのの濃度で使用クライ 二次ック 026862の 博士の研究室から入手

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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