Ivacaftor、主要な代謝産物および嚢胞性線維症患者の体液中の Lumacaftor の臨床サンプルの高スループット分析のための最適化された LC-MS/MS 法

Summary

Ivacaftor と ivacaftor lumacaftor の組み合わせは、2 つの新しい CF 薬です。ただし、まだ自分の PK/PD と薬理学の理解の不足があります。Ivacaftor 主要な代謝物と lumacaftor の同時解析のために最適化された HPLC MS 技術を提案します。

Abstract

嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子 (CFTR) の欠陥は、嚢胞性線維症 (CF)、生命にかかわる肺症状を病気の原因です。Ivacaftor (IVA) と ivacaftor lumacaftor (輝度) の組み合わせは、直接活動と欠陥 CFTR 蛋白質の輸送を調節する 2 つの新しい CF の画期的な薬です。ただし、薬物動態/薬力学パラメーターに関する理解の不足、ivacaftor と lumacaftor の薬理学はまだです。高速液体クロマトグラフィー MS ivacaftor、ヒドロキシメチル ivacaftor、ivacaftor-カルボン酸、および lumacaftor 標準の ivacaftor または ivacaftor lumacaftor の組み合わせを受けている患者の体液中の濃度の同時分析法治療は、以前されて私たちのグループによって開発され、FDA の基準を部分的に検証されます。ただし、患者サンプルの大きい数の高スループット解析をできるように、私たちのグループが小さい細孔サイズ逆相クロマトグラフィー コラムを使用して報告されたメソッドに最適化 (2.6 μ m、C8 100 Å; 50 x 2.1 mm) と溶媒混合系のグラデーション (0 1 分: 40 %b;1-2 分: 40-70 %b;2 2.7 分: 70 %b にて開催2.7 2.8 分: 70-90 %b;2.8-4.0 分: 90 %b 洗濯;4.0 4.1 分: 90-40 %b;4.1 6.0 分: 40 %b で開催) ではなくイソクラティック溶出。本研究の目的は、大量の患者のサンプルの分析のために不可欠であるサンプルあたり 6 分のみ 〜 15 分から大幅にサンプルあたりの高速液体クロマトグラフィー-質量分析時間を減らすことでした。これらの画期的な CF 薬物の量反応関係を研究のためかなりユーティリティのこの便宜的なメソッドになります。

Introduction

嚢胞性線維症 (CF) は肺、肝臓、膵臓、肺機能、膵機能不全^1,の減少などの進行性多臓器不全を引き起こす腸の分泌粘液腺を含む一般的な遺伝的疾患^2,3。Ivacaftor (IVA) は最初の食品医薬品局 (FDA 米国) と欧州医薬品庁 (EMA) 明らかな臨床的有効性の重要な生産と嚢胞性線維症膜コンダクタンス レギュレータ (CFTR) 増強剤を含む薬を承認ベアリング G551D CFTR CF の患者の小さいサブセットでプラセボに対する肺機能の改善 [グリシン (G) 551 の位置にはアスパラギン酸 (D) 置き換え] ミスセンス変異 (CF 人口の 4 〜 5%)^4,5。これは経口投与薬剤増加 CFTR チャネルを開く、塩化物イオン流を増加させると CF^4,6の臨床症状につながる主要な欠陥に作用します。残念ながら、イヴァ単独療法は [フレーム位置 508 にフェニルアラニン (F) の損失の結果 CFTR 遺伝子の削除] でより一般的なホモ F508del 変異を有する患者における効果的なの 〜 50% に見られる変性 CFTR の結果CF 人口^7,8。

最近、FDA は薬 lumacaftor CFTR 補正とイヴァを組み合わせることの承認を付与します。CFTR チャネル活性を増強する変調器 (IVA) を用いた細胞表面に F508del CFTR を救助する「CFTR 補正 (lumacaftor、LUMA) を組み合わせた巧妙な戦略効果的に CF 人口⁵のほとんどに治療ウィンドウを表示.競合レポートの数の臨床^9,10時にその疑いが浮上しているようにこれらの薬が彼らの約束を果たすかどうか以上の質問が残っています。さらに、肺の機能の改善だけささやかな (2.6 4 の % であった ivacaftor lumacaftor 組み合わせ) 軸受 G551D 突然変異 (10.6 12.5%)⁸患者の IVA 単独で達成した成功と比較して。IVA とルミナンス ivacaftor lumacaftor 併用の臨床的有効性が制限される可能性がの潜在的な敵対的薬物相互作用は、その理想的な未満の薬物動態的特性^7,11から来る。IVA は活性代謝物ヒドロキシメチル-イヴァ (IVA M1, M1) と不活性形 IVA-カルボン酸 (IVA M6 M6)^7,12主にチトクローム p450 (CYP) によって代謝されます。CYP3A4 誘導ルミナンス、その一方で、広範囲で代謝されてし、は主としてそのまま糞便¹¹に排泄されます。CYP3A4 誘導剤がチトクローム代謝を誘導する、ivacaftor (CYP3A4 基質) 濃度を減らすことができます。また、イヴァとルミナンスの両方は非常に疎水性の分子、~ 99% にバインドされる血漿蛋白 (アクティブ) 遊離型薬物濃度^1,13を大幅に制限します。

総称して、これらの要因は、ivacaftor lumacaftor 併用の臨床的有効性を制限する一緒に来るかもしれません。Ivacaftor lumacaftor の組み合わせで現在服用下で最適な血中濃度を達成するかどうかまたはかどうか治療のしきい値は⁸を維持されますが不明です。現在、ピークといった薬物動態学的パラメーターに関する情報の少なさと ivacaftor または ivacaftor lumacaftor の定常状態血漿濃度があります。Ivacaftor と lumacaftor の指摘の代謝を考えると、すると、ivacaftor または ivacaftor lumacaftor 療法の最適用量レジメンを達成するために必要な暴露-反応関係の監視です。当社グループは最近、イヴァとルミナンス¹⁴の量反応関係の監視のための最初の高速液体クロマトグラフィー/液体クロマトグラフィー-質量方法を公開しました。これまで ivacaftor、その代謝産物および lumacaftor 濃度測定の代替技術は報告されていません。大規模患者集団の高スループット解析を許可し、分析時間を大幅に削減する、当社グループが小さい細孔サイズ逆相クロマトグラフィー コラムおよび勾配溶剤系を使用して報告された方法を最適化します。コストと実行時間を削減します。

Protocol

倫理の承認からモナッシュ大学人間研究倫理委員会 (MUHREC) が得られた

。

1 アッセイのアプリケーション: 患者サンプル コレクション

1. とき患者と 150 mg ivacaftor または ivacaftor 125 mg/lumacaftor の標準的な量の時間を記録 200 mg。
。
2. 注下患者の血液サンプルを収集するとき正確な時刻です
   。 注: 24 時間コース上 4-5 の試料を収集をお勧めします。示された時間ポイントは 2.5-4 h ポスト ivacaftor または ivacaftor lumacaftor の組み合わせ投与、定常状態で C の _最大 濃度は後達成される場合のみ 1 つのサンプルのコレクションは、> 連続投与後 5 日
。
3. 市販の未処理青いチューブの血液の 4 ~ 5 mL を収集します
。
4. 全血のコレクションの後許可を室温で邪魔されずに残して凝固血
   。 注: これは通常 15-30 分かかる
5. は、冷却遠心機で 4 ° C で 10 分間 1,000-2,000 × g で遠心分離によって血腫を除去します。プラズマとして結果の上澄みを指定します
。
6. 遠心分離後すぐにパスツール ピペットを使用して清潔なポリプロピレン チューブに上清 (プラズマ) を転送します。プラズマ管を患者 ID を (例えば 患者 1)、(例えば、ivacaftor lumacaftor の組み合わせ)、投与薬と患者のサンプルの時間のラベルは収集した (例えば、2.5 時間後の投与量).
7. の処理中に 2-8 ° C で維持するサンプル。処理が完了すると、ストアでサンプル – 20 ° C
8. 必要に応じて、出荷サンプル分析研究所に承認されたクーリエ
   。 注: サンプルをドライアイスに到着まで発送して保管 – 解析までの 80 ° C.

2。準備および発生したサンプルの処理と基準

注: ivacaftor/lumacaftor 療法を健康なドナーの世間知らずからプラズマがオーストラリア赤十字社から得られました。整合性を確保して収集と処理中にすべてサンプル/基準 2-8 ° C でおきます。処理が完了すると、ストアでサンプル – 20 ° C

1. IVA、IVA-カルボン酸、ヒドロキシメチル-IVA、社内基準への参照となる輝度を量り
。
2. LC MS グレードのメタノール 100 μ g/mL、10 μ g/mL の各試料 (IVA、M1、M6 および LUMA) の 2 つの独立した在庫ソリューションを準備します
   。 注: 化合物は、ベンチトップで 10 日後切れます
。
3. たて準備各解析実行前に液体クロマトグラフィー-質量校正標準器校正基準の濃度希釈原液以下の濃度を達成するためにひと血漿に: 0.01 0.025 0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.5、5.0、10.0 μ g/mL。これらのサンプルを基準と呼びます
。
4. 蛋白質の沈殿物、アセトニ トリル (ACN、LC MS グレード) の 0.1% ギ酸 (FA) を準備し、必要になるまで冷蔵庫にしておきます
。

3。発生したサンプルおよび標準の前処理

1. 部屋の温度平衡に両方の患者と空白の血漿サンプルを許可します
。
2. 15 の血漿を混合する渦サンプル毎秒です
。
3. 1.5 mL ポリプロピレン微量遠心チューブに基準のいずれかの空白プラズマまたは分析のための患者のサンプルの 100 μ 因数を転送します
。
4. は、標準的な管のそれぞれに内部標準 IVA を追加 (例えば 0.01、0.025、0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.5、5.0、および潜在的な濃度範囲をカバーする 10.0 μ G/ml)、蓋を閉めるし、2-3 s. 注内部標準の渦は、のみ空白のプラズマに追加と内部標準は患者のサンプルに追加されません
。
5. 3.4 の手順を繰り返します内部の標準 M1、M6、ルミナンス。
。
6. スピン ・ ダウン各チューブに簡単に蓋の上に水滴がないことを確認します
。
7. 0.1% のミックスの追加 200 μ L を血しょう蛋白質を沈殿させた各チューブに ACN で FA
。
8. 渦約 15 のために精力的に混合 s.
9. 冷蔵庫に 10 分放置する管を許可します
。
10. 可能であれば 4 ° C で 10 分間、10,000 × g で遠心分離機します
。
11. 1.5 mL の HPLC バイアルに 13 mm のシリンジ フィルター通過の上清 200 μ L 因数をフィルター処理します
。
12. 高速液体クロマトグラフィー質量分析用 LC MS バイアルに上澄みの転送 100 μ L.

4。高速液体クロマトグラフィー質量分析

注: トリプル四重極質量分析計 (表 1) と相まって LC MS システム上の高速液体クロマトグラフィー-質量分析を行った.

1. に LC MS システム上自動サンプラでサンプルとトレイを配置します
。
2. ガード列に列し LC MS システムに接続します
。
3. 移動相の両方の本を添付 (ボトル a: 100 %acn; ボトル水の b: 0.1% ギ酸) LC MS システムの平衡と
。
4. 次パラメーターを組み込む LC MS プロトコル。
   1. 2:1 の比率で質量分析計に入る前に移動相の流れを分割 (廃棄物: MS 入口).
   2. グラジエント移動相に水の 100 %acn と 0.1% ギ酸を使用して 0.5 mL/min の流量での実行 (開始点、40: 60 で v/v)。移動相の容積 % 分析を通じて変更されるに注意してください
   。
   3. 肯定的なエレクトロ スプレー イオン化モードで質量を操作します
   。
   4. LC MS 設定は次のとおりであることを確認: イオン スプレー電圧 4.5 kV、衝突エネルギー 295.9 V、噴霧ガス: 3 L/分で窒素; 衝突ガス: アルゴン; 乾燥ガス 20 L/分の流量、電圧 Q3 のレンズ:-22 V、溶媒の温度熱ブロック 250 ° C400 の温度 ° C
   5. サンプルあたり注入 10 μ L のボリューム
   。
   6. 監視 (MRM) 複数の反応を利用して検出検体。M/z 392.49 のイオンの遷移を監視 →、393 m/z 408.49 → 409、m/z 422.47 → 423 と m/z 452.40 → ルミナンス、イヴァ M6、イヴァ M1 IVA 453 それぞれ
      。 注: 新しく最適化されたメソッドがまだされて完全に FDA の基準に従って検証される
   。

5。較正曲線

1. 構築 LC MS 内部標準へ 4 つの analytes のそれぞれのピーク面積比との校正の標準的な公称濃度との関係を使用して各解析実行前に検LC MS 設定プログラム内 ivacaftor (IVA M1、イヴァ M6 またはルミナンス).
   注: 検量線の建設のための正確な手順は使用されている LC MS 機器のモデルによって異なります。この情報機器マニュアルにあります
。
2. によると濃度の逆数 1/C ² を重み付けによる線形最小二乗回帰分析を実行します
。

Results

我々 は最近の C8 列 (5 μ m、内径 3.9 × 50 mm) を用いた 100% 水 (40: 60 の ACN と 0.1% ギ酸から成る移動相をトリプル四重極液体クロマトグラフィー-質量と高速液体クロマトグラフィー検出器システム、FDA の基準を部分的に検証メソッドに報告しています。、v/v) 1 mL/min の流速で。すべての代謝物、ivacaftor、Iva M1、Iva-M6、lumacaftor¹⁴のひと血漿は 0.01 から 10 μ g/mL までの濃度範囲でピークの相関を認めた.このメソッドを最適化されていますここで劇的に許可する LC 保持時間あり、したがって臨床サンプルの大量の高スループット分析のために不可欠である試金の完全な実行時間を削減します。アッセイは、小さい細孔サイズ逆相クロマトグラフィー コラムおよび 〜 15 分からわずか 6 分にサンプルあたりの時間を短縮、アイソクラティック代わりに勾配溶剤系を使用して最適化されていました。イオンクロマトグラフィーは、監視 (MRM) 複数の反応を用いたエレクトロ スプレー肯定的なモードで決定されます。

Discussion

既報のように、私たちのグループは、初めて開発および HPLC や LCMS 迅速検出と ivacaftor とヒドロキシメチル IVA M1 (アクティブ) とイヴァ カルボン酸 M6 (非アクティブ); その主要代謝物の定量法を検証血漿および CF の患者の¹⁴の喀痰中 lumacaftor。以前私たちのグループによって報告されたアッセイ ルミナンス、IVA、イヴァ-M1 とプラズマで IVA M6 の濃度とイヴァ 150 mg/q12 h と定常状態標準治療を受けている CF の患者の喀痰を定量化する採用されました (ラテン語の用語: quaque12 h;12 時間間隔) または 200 mg/q12 h ルミナンス 125 mg/q12 h IVA の組み合わせ¹⁴。患者サンプルを大量の高スループット分析のため小さい細孔サイズ逆相クロマトグラフィー コラム C8 を使用して報告されたメソッドを最適化 (2.6 μ m; 100 Å; 50 x 2.1 mm²)、現在ではなくグラデーション溶剤シス...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
IVA(カタログ番号#S114)	SelleckChem (米国).
LUMA (Cat#S1565)	SelleckChem (米国).
IVA-カルボン酸塩(Cat#510242247CS)	Clearsynth (カナダ).
ヒドロキシメチルIVA(Cat#510240849CS)	Clearsynth (カナダ).
メタノール(MeOH、LC-MSグレード)、	Sigma-Aldrich
アセトニトリル(ACN、LC-MSグレード)	Sigma-Aldrich
ギ酸(FA)	Sigma-Aldrich
トリプル四重極 島津製作所 8030 LC-MS
フェノメネックス キネテックス (2.6 & マイクロ;m C8 100 Å;50 ×2.1mm)(
KrudKatcher Ultrea HPLCインラインフィルター 0.5mデプスフィルター×内径0.004インチ).
1.5 mLポリプロピレン微量遠心チューブ(VWR)
Eppendorf Centrifuge 5430
13 mmシリンジフィルター(0.45 µm nylon, GRACE, USA)
[フェノメネックス VEREX、9 mm、PP、300 & マイクロ;L、PTFE/シリコンセプタム].