Biocontainmentにおけるウイルスサンプルの陰性染色のためのカプセルの利用

Summary

このプロトコルは、BSL-2、-3、または-4の実験室で容易に使用することができる陰性染色ウイルスサンプルのための指示を提供する。これには透過電子顕微鏡グリッドを保護する革新的な処理カプセルの使用が含まれ、生化学の中でより乱暴な環境での取り扱いが容易になります。

Abstract

透過電子顕微鏡（TEM）は、ナノメートルの分解能を有するウイルスおよび他の微生物病原体の超微細構造を観察するために使用される。ほとんどの生物材料は、電子を散乱して画像を生成することができる緻密な要素を含まない。したがって、試料の周りに濃密な重金属塩を配置するネガティブな染色が必要である。 TEM下で懸濁液中のウイルスを可視化するためには、ナノメートルの厚さの透明な表面で被覆された小さなグリッドに適用する必要があります。サイズが小さく、脆弱であるため、これらのグリッドは取り扱いが難しく、気流によって容易に移動することができます。薄い表面は容易に損傷し、試料を画像化することを困難または不可能にする。感染性ウイルスは、バイオセーフティキャビネット（BSC）で取り扱われなければならず、またあるものは生物接種実験環境が必要です。ウイルスのバイオセーフティーレベル（BSL）-3および-4での染色は、これらの環境がより乱暴であり、技術者が必要とされるため特に困難ですo身体障害を減少させる個人用保護具（PPE）を着用する。

この研究では、生体適合性の陰性染色ウイルスを支援する新しいデバイスを評価しました。このデバイスは、特殊なピペットチップとして機能するカプセルです。グリッドがカプセル内に装填されると、ユーザーはカプセルに試薬を吸引してカプセル化されたグリッドにウイルスおよびステインを送達し、グリッドのユーザー操作を排除する。この技術はBSL-3または-4の生体適合性のために特別に設計されていますが、ウイルスのネガティブ染色を容易にすることにより、あらゆる実験環境でサンプル調製を容易にすることができます。この同じ方法を、ナノ粒子、高分子および類似の試料のネガティブ染色TEM試料を調製するために適用することもできる。

Introduction

透過型電子顕微鏡（TEM）は、従来の光学顕微鏡^{1、2、3、4}で見られるには小さすぎる生物学的試料の形態および超微細構造を表示するための有効なツールです。 TEMは、電子が光よりもはるかに短い波長を有するので、より高い解像度の画像を生成する非常に薄い標本を通して電子を撃つ。電子を曲げたりブロックするサンプルの領域は暗く見え、電子ルーセントの領域は白く見えます。

電子密度の問題の欠如は、電子を散乱させることができないため、ウイルスをTEM下で見ることを困難にする。ネガティブ染色は、コントラストを作成し、TEMでウイルスを観察するために使用される最も一般的な方法です。 Hall（1955）とHuxley（1957）が観察した実験に基づいて、最初のネガティブ染色手順がBrenner and Horneによって1959年に提案された電子密度の高い物質に浸したとき、逆のコントラストの生物学的構造の出現⁵ 。陰性染色のプロセスは、過去半世紀にわたって事実上変わらなかった。ネガティブ染色は簡単にウイルス^6を浸透させずに密な材料でウイルスを囲むための試みにTEMグリッド上のサンプルへの重金属塩溶液を適用することを含みます。これは、暗い境界線を作成し、粒子の形状^5を明らかにする。この研究では、ネガティブ染色のために酢酸ウラニル（UA）とリンタングステン酸カリウム（PTA）の2種類の試薬を使用しています。これらの汚れの両方は、一般に負、ウイルス、タンパク質複合体、およびナノ粒子^{7、 図8、 図9}のような小さな生物学的サンプルを染色するために使用されます。

従来のネガティブ染色法は、手動の液滴ネガティブ染色技術であるニーク⁷ 。この方法は、少量のウイルスサンプル、ステイン、およびリンスを適用するために、鉗子を用いて、壊れやすい小さなTEMグリッドを正確に取り扱う必要があります。典型的な調製プロトコルは、フィルムコーティングされたTEMグリッドの表面上に試料懸濁液の液滴を適用することを含む（ 図1A ）。サンプルをフィルム表面に付着させた後、グリッドを洗浄して非付着性ウィルスを除去し、サンプルのタイプに応じてUAまたはPTAで数秒〜1分間染色する。余分な液体はグリッドの縁に濾紙の片を触れることによってグリッドから逃げる。

手動液滴法では、各グリッドを個別に作成する必要があります。注意深く取り扱わなければ、コーティングされたTEMグリッドは容易に穿孔され、曲がり、または汚染される。複数のサンプルを処理すると、グリッドを追跡することが困難になり、各サンプルの染色が一貫して行われます。このマニュアル染色手順は、より多くのdこれらの環境に必要な個人用保護具（PPE）が必要であるため、バイオセーフティレベル（BSL）-3および-4バイオ実験ラボで実施された場合は不可能です。 PPEは煩雑で、生物学的環境は通常の研究室に比べてはるかに乱暴です。 BSL-3バイオ実験ラボで働く人材は、2組の手袋を着用し、バイオセーフティキャビネット（BSC）で作業する必要があります。この手袋の二重層は、触覚感度を低下させ、細かい運動を制限します。ユーザーを保護し、サンプルの汚染を防止するのに役立つBSCの気流は、サンプルおよび染みをあまりにも速く乾燥させ、汚染の質に影響を与える可能性があります。 BSCの強い乱流気流は、十分に保護されていないグリッドをすばやく吹き飛ばすこともできます。 BSL-4生物養成研究所では、追加の安全要件があります。要員は、身体的な動きとはっきりと見ることと操作する能力をさらに制限する正の圧力スーツを着用する必要がありますグリッドを灰化する。 BSL-4で働く技術者も少なくとも2対の手袋を着用し、外側のペアは手袋の手触りが良く、器用さと触感が大幅に低下します。最後に、TEMグリッドを取り扱うために使用される鉗子は鋭利であり、それにより手袋を穿刺する能力のために技術者に危険をもたらす。グリッドを含むカプセルでは、鉗子は必要ではないため、生体適合性のグリッドを操作するための安全で鉗子がない代替物を提供する。最後に、カプセルはまた、処理中、オスミウム蒸気汚染除去中、および貯蔵中にグリッドを貯蔵する効果的な方法を提供する。グリッドを組織化し、損傷から安全に保ちます。

本稿では、mPrep / gのカプセル、グリッド処理と^{10、11、12を}染色するためのカプセルベースのデバイスを利用する生物学的封じ込め実験室におけるネガティブ染色TEMグリッドのための新しい方法を導入します。カプセル収容部2つのTEMグリッドを修正し、直接の取り扱いを最小限に抑え、グリッド損傷の可能性を低減します。カプセルはピペットチップと同じ方法でシングルまたはマルチチャンネルのピペットに直接取り付けられ、さまざまな液体を内部のグリッドに塗布することができます。これにより、重複したグリッドで複数のサンプルを同時に作成することができます（ 図1B ）。カプセルで陰性染色するには、ウイルス試料をカプセル内に吸引し、ウイルスをグリッド表面に吸着させるために10分間保持する。その後、吸着したウイルスを含むグリッドを脱イオン（dI）水で洗浄し、UAまたはPTAのいずれかで数秒〜1分間染色する。このプロセスは、手動液滴法と同じプロトコールステップおよび試薬を用いる。違いはグリッドを物理的に扱うことなくカプセル内ですべての作業が行われることです。 （ 図1C 、1D ）。

この研究の目的は、生物学的環境におけるウイルスサンプルのネガティブ染色の新しい方法です。この研究はまた、2つの異なるウイルス不活性化手順、すなわち1％の四酸化オスミウム蒸気による急速な不活性化、および2％のグルタルアルデヒドによる24時間の不活性化から生成されたTEM画像の質を調べた。これらの両方をカプセルを用いて実施した。最後に、本発明者らは、カプセルに使用するために、一般的に使用される2つの陰性染色であるUAおよびPTAを評価した。 ¹³

Protocol

1.ウイルスサンプルを扱う前のBSL-2環境での実験準備

1. Formvarおよび炭素被覆TEM銅グリッド（通常200〜400メッシュ）を準備または購入してください。
2. コーティングされたTEMグリッドをカプセルに挿入する。
   1. このプロセスを簡単に実行するには、拡大レンズを使用します。 1つまたは2つのグリッドを各カプセルに挿入することができる。必要に応じて、このステップを排除するために予め充填したカプセルを購入することができる。
3. 挿入されたTEMコーティングされたグリッドを含むカプセルを、他の消耗品および試薬と一緒に、ウイルスが陰性染色される生物付着に移す。

2.グルタルアルデヒド水溶液と1％オスミウム・テトラオキシド蒸気不活性化を用いた生物付着における陰性染色のためのカプセル法

1. Biocontainment BSCの内部で、40μLのウイルス懸濁液をピペットに添付されたカプセルに吸引します。
   注：ピペットは、eカプセルに移す。ウイルスの準備は、前回の出版物^14に従っています。
2. グリッドを水平にして10分間ピペットを横に置きます。これは、コーティングされたグリッド上へのウイルス粒子の均一な分布を促進するためである。
3. 生態学的BSC内のカプセル内のウイルスを不活性化する。
   1. ピペットを拾い、プランジャーを押してウイルス溶液を廃棄容器に分注する。
   2. 40μLの2％グルタルアルデヒド固定液をカプセルに吸引する。
      注意：グルタルアルデヒドは危険な化学物質であり、適切な保護が必要です。グルタルアルデヒドは、通常のBSCでは短時間使用できますが、拡張されたオープン試薬はダクテッドBSCまたは化学フュームフードで作業する必要があります。
   3. その側にピペットを20分間置く。これは、サンプルが確実に固定されるようにするためです。
   4. 固定液を放出し、40μLのdI水をカプセル中に吸引する。固定液を灰分にする。この洗浄ステップを3回繰り返す。
4. 1％酢酸ウラニル（UA）または1％リンタングステン酸カリウム（PTA）40μLをカプセルに吸入させ、30秒間静置する。
   注：染色時間は、ウイルスサンプルに基づいて10秒から1分まで変化する可能性があります。
   注意：UAはアルファ放射体であり、累積毒素である。それを適切な保護具で取り扱ってください。
5. ピペットからカプセルを取り出し、グリッドがカプセル内に残っている間にグリッドの端に濾紙の部分を触れて、グリッドを汚す。
6. オスミウムテトラオキシド蒸気不活性化手順。
   1. 1％オスミウム四酸化物溶液に浸したろ紙を入れた50mLの遠心チューブに、蓋を開いた状態でカプセルを置きます。
      注意：四酸化オスミウムは蒸気圧が低いと極めて毒性があります。これは、ダクテッドBSCまたは化学フュームフードで使用する必要があります。それを適切な保護具で取り扱ってください。投稿の警告作業領域内の情報。
   2. 50mLの遠心チューブを1時間シールして、四酸化オスミウム蒸気を完全に透過させます。次に、汚染除去し、チューブを生物学的封鎖からBSL-2 EM施設に移す。
7. EMグリッドをカプセルから取り出します。
   1. BSL-2 EM施設では、遠心管からカプセルを取り出し、ピペットの上に置きます。
   2. 40μLのdI水をカプセルに吸入させ、水を廃棄容器に3回分注します。
   3. ピペットからカプセルを取り出し、濾紙を使用してグリッドを乾燥させ、グリッドの端に触れてください。
   4. 空気乾燥後、次のTEMイメージングのためにグリッドを保管する。

3. 2％グルタルアルデヒドを用いた生育における不活性化のためのカプセル法、続いてBSL-2実験室でのネガティブ染色

1. ウイルス不活性化手順。
   1. 生物学的BSCの内部に、ウイルス浮遊液を4％グルタルアルデヒドの同じ容量とよく混合して2％グルタルアルデヒドの最終濃度を達成する。
      注意：グルタルアルデヒドは危険な化学物質であり、適切な保護が必要です。グルタルアルデヒドは、通常のBSCでは短時間使用できますが、拡張されたオープン試薬はダクテッドBSCまたは化学フュームフードで作業する必要があります。
   2. パッケージ化、汚染除去の前に24時間以上固定液でウイルスを不活性化し、BSL-2 EM施設に移す。
2. BSL-2 EM施設では、ピペットに取り付けられた2つのTEMグリッドを含むカプセルにウイルスおよび固定剤混合物を吸引する。
3. グリッドを水平にしてピペットを10分間水平に置きます。
   注：これは、TEMグリッド上へのウイルス粒子の均一な分布を促進するためです。
4. ピペットを拾い、プランジャーを押してウイルスを廃棄容器に追い出す。 40μLのdIを吸引する水をカプセルに入れ、それを3回のすすぎサイクルの間廃棄物容器に放出する。
5. 1％UAまたは1％PTAのいずれか40μLをカプセルに30秒間吸引する。
   注：染色時間は、ウイルスサンプルに基づいて10秒から1分まで変化した。
   注意：UAはアルファ放射体であり、累積毒素である。それを適切な保護具で取り扱ってください。
6. ピペットからカプセルを取り出し、グリッドの端を濾紙に触れてグリッドを拭き取ります。グリッドを空気乾燥し、その後のTEMイメージングのために保管します。

Results

カプセル法は、TEMイメージングのために良質のネガティブ染色を生成する：

まず、マニュアル液滴法とネガティブ染色ザイレエボラウイルスのカプセル法の両方を用いて生成された画像の質を評価した。エボラウイルスは、 マルベールウイルスとともにフィロウイルス科のメンバーである。エボラウイルスは、典型的には、直径が80〜100nmであり、長さが1,000nmを超えることができる。エボラウイルスはBSL-4生物接種環境で扱われなければならない。 図2は、手動液滴法およびネガティブ染色のためのカプセル法を用いて生成された画像を示す。 図2A （手動液滴法）および図2B （カプセル法）は、ビリオンの中央にヌクレオカプシド構造を有する詳細を明確に定義したエボラウイル...

Discussion

陰性染色は、ウイルス、タンパク質複合体およびナノ粒子を評価およびサイジングするための貴重なTEM技術である。試薬からネガチブへのグリッドの手動移動によるこれらの標本の液滴調製は、半世紀以上にわたり古典的なプロトコールであった。それは簡単なプロセスですが、成功裏に修了するためには訓練を通じて得られた専門知識が必要です。優秀なネガティブ染色は、依然として最先端技術のセットと考えられ、多くのTEMラボで非常に望まれています。カプセル法は、手動液滴法に比べて、特に生物学的研究室において、いくつかの明確な利点を有する。第1に、簡単なピペット操作でエントリーレベルの技術者がカプセル法を使いやすくすることができるようになる前に、手動液滴法は十分な訓練と経験を必要とする。手動液滴法の最大の課題は、BSL-3およびBSL-4 PPEによる鉗子を用いたTEMグリッドの処理が成功したことですo大幅に減少した触覚感覚および器用さ。脆弱なコーティングされたTEMグリッドは、鉗子によって容易に損傷または穿刺される。コーティングされたTEMグリッドの損傷は、TEMで見られるまで明らかにされないことが多い。カプセルの第2の利点は、TEMグリッドがカプセル中に挿入され、...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Formvar/カーボンコーティングTEMグリッド	SPI	3420C-MB	200メッシュCu Pk/100
mPrep/gカプセル	EMS	85010-01	ボックス
mPrep/fカプラー	EMS	85010-11	16/Pk
グルタルアルデフダイド	EMS	16320	50%溶液、EMグレード
四酸化オスミウム	EMS	19190	4%水溶液
酢酸ウラニル	EMS	22400	粉末
カリウム リンタングステン酸	EMS	19500	粉末
濾紙	Whatman	1450-090	サイズ 50
透過電子顕微鏡	JEOL	JEM-1011	TEM