このコンテンツを表示するには、JoVEへの購読が必要です。 または、無料トライアルをお申し込みください。

方法論記事

非侵襲体内生物発光システムによってマウスのホストである腸管出血性大腸菌の植民地化の検出

9K 回視聴

⸱

DOI:

10.3791/56169

⸱

2018年4月9日

 ,  , 
1Institute of Basic Medical Sciences, College of Medicine, National Cheng Kung University, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, College of Medicine, National Cheng Kung University

この記事について

サマリー

腸管出血性発光標識細菌によるエシェリヒア属大腸菌(EHEC) の植民地化のためのマウスモデルの詳細なプロトコルが表示されます。非侵襲的生体内でイメージ投射生きている動物のシステムによってこれらの発光細菌の検出は、EHEC の植民地化の私達の現在の理解を進めることができます。

要約

腸管出血性大腸菌(EHEC) o157: h7、これが食中毒病原体、causesdiarrhea、出血性大腸炎 (HS) と溶血性尿毒症症候群 (HUS) は、人間の腸管に植民地化します。EHEC の植民地化、体内の詳細な機構の研究を監視して定量化 EHEC 植民地動物モデルを持つことが不可欠です。ここを監視して生きている宿主の EHEC の植民地化を定量化 EHEC に発光発現プラスミドを変換することによってマウス EHEC 植民地化モデルを紹介します。発光ラベル EHEC を接種した動物と非侵襲的体内イメージング システム検出によるマウスでの強烈な発光信号を示します。1 と 2 日間は、感染症を投稿後発光信号まだ検出感染した動物、EHEC が、少なくとも 2 日間のホストで植民地化を示唆しています。また、これらの発光 EHEC がex vivo画像から具体的に、盲腸および結腸、小腸に検索を示します。このマウス EHEC 植民地化モデルは、EHEC 植民地化メカニズムの現在のナレッジを進めるためのツールとして役立つかもしれない。

概要

EHEC o157: h7 は、汚染された水や食品を介しても急性腎障害4フス3HS2下痢1を引き起こす病原体です。出血性大腸菌病原性 enterobacterium で、人間1の消化管に定着します。EHEC は最初ホストの腸の粘膜上皮に付着するとき、彼らは、アタッチを誘導してその後を強制する (A ・ E) 病変を卑下分子注射器として機能するタイプ III 分泌システム (T3SS) を介して宿主細胞に植民地化の要因を注入します。接着 (植民地化) の5。A/E 病変形成に関与する遺伝子、上皮細胞卑下 (イ) 病原性島5の軌跡によってエンコードされます。

生物発光は光生成の化学反応、どちらのルシフェラーゼの可視光6を生成するその基質ルシフェリンを触媒します。この酵素プロセスよく酸素またはアデノシン三リン酸 (ATP)6の存在が必要です。生物発光イメージング (結合)、生きている動物7で、研究者の可視化およびホスト病原体の相互作用の量子化ことができます。バリは、発光細菌を次に移行し、さまざまな組織7に侵入すると、生きている動物の細菌感染症のサイクルを特徴付けることができます。これは、感染症の動的な進行を明らかにします。さらに、動物の細菌の負荷は、発光信号8; に関連します。したがって、それは単純で直接的な方法で実験動物の病理学の条件を推定するための便利なインジケーターです。

ここで使用されるプラスミドには、ルシフェラーゼ オペロン、 luxCDABE、菌Photorhabdus luminescens独自のルシフェラーゼ基板7,9をエンコードするからであるが含まれています。細菌にこのルシフェラーゼ発現プラスミドを変換することによって植民地化および伝染のプロセスは生きている動物のこれらの発光細菌を観察することによって監視できます。全体的にみて、バリとバクテリアの生物発光ラベルは、細菌数と場所、細菌性抗生物質/療法の治療と感染症/植民地6,における細菌の遺伝子発現を監視する研究者を許可します。7. 感染症の感染サイクルや遺伝子発現を調べるluxCDABEオペロンを発現する多くの病原性細菌が報告されています。尿路大腸菌10EHEC8,11,12,13, 急性胃腸炎起因を含むこれらの細菌エシェリヒア属大腸菌(EPEC)8,シトロバクター属囓14,15, サルモネラ16リステリア菌17、 Yersinia enterocolitica18,19、とコレラ20、文書化されています。

いくつかの実験的モデルは、EHEC の植民地化の in vitroとin vivo21,22,23の研究を容易にするために開発されています。しかし、EHEC の植民地化は、生体内で、研究に適した動物モデルの欠乏そしてこうして詳細の結果不足があります。EHEC 植民地化メカニズムは、生体内での研究を容易にする、動物を観察し、非侵襲的な方法で生きている動物の EHEC の植民地化を定量化するモデルを構築する貴重なです。

本稿では、生物発光表現するシステムを使用して生きている宿主に時間をかけて EHEC の植民地化を監視するマウス EHEC 植民地化モデルについて説明します。マウスは接種量発光ラベル EHEC とマウスで、非侵襲的生体内でイメージ投射システム13と発光信号が検出されました。2 日後に感染症、それらの細菌は、2 日後に感染後ホストの腸の植民地を提案した後彼らの腸に発光信号を示した発光ラベル EHEC 感染マウス。前のヴィヴォの画像データを示した盲腸と結腸マウスの具体的にこの植民地化であります。このマウス EHEC のモデルを使用して、発光 EHEC の植民地化がは、生体内イメージング システムのさらなる理解を促進する可能性が腸内細菌の植民地化の詳細なメカニズムの研究生活ホストで検出できます。EHEC による生理学的および病理学的変化。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

プロトコル

注意: EHEC o157: h7 はバイオ セーフティ レベル 2 (BSL-2) センター疾病管理・予防 (CDC) のバイオ セーフティの命令 (https://www.cdc.gov/) によると病原体。したがって、EHEC を含むすべての実験手順は、BSL 2 施設で実行する必要があります。実験の実行中の白衣、手袋を着用してください。公認バイオ キャビネット (BSC) で動作します。70% のエタノールの実験の手順の前後には、実験ベンチを消毒します。すべての楽器や機器の接触 (または可能性のある連絡先) EHEC が 70% エタノールや漂白剤で消毒すること。汚染された (または汚染された可能性のある) 廃棄物は密封され、オートクレーブを慎重にする必要があります。必要に応じてマスク、目の保護、手袋や、スーツを着用します。6 週齢の c57bl/6 女性マウスが購入し、研究所動物センターの国立チェン イェーテボリ大学) で維持します。動物実験は動物介護機関と使用 NCKU 委員会 (承認番号 104-039) によって承認されました。

1. Bioluciferase ラベル EHEC 菌生成

  1. ミックス 50 ng デオキシリボ核酸 (DNA)、1 μ L 各 10 μ M の前方ゾーンおよび逆引きプライマー、2 μ L 2.5 mM 弱まり (dNTPs)、2 μ L バッファー、0.2 μ L の DNA ポリメラーゼ、および増幅する 20 μ L の最終巻に滅菌ダブル蒸留水 (ddH2O) × 10、反カナマイシン カセット、 nptII遺伝子24。DNA のテンプレートは、pBSL18024, 国立ナショナルバイオ リソース プロジェクト (NBRP) から購入されるからです。PCR の状態は、表 1に示すが、プライマー シーケンステーブル 2で利用可能です。
  2. キットに続く商業クローニング ベクトルに PCR の製品を縛るプロトコル (材料の表を参照してください)。
  3. NsiIおよびSmaIでクローニング ベクトルからnptII遺伝子のフラグメントを消費税し、pBBR1MCS4 は、カナマイシン耐性プラスミドを作成する pAKlux29 NsiIとScaIで消化されてのクローンを作成pWF27813。
  4. プラスミド9、 SpeI-HFとScaIとクローンでの pAKlux2 を表現するルシフェラーゼluxCDABEオペロンを消費税SpeI HFおよびSmaIにカナマイシンを生成する pWF278 を消化耐性とルシフェラーゼ発現プラスミド pWF27913。
    注: プラスミド抽出と摘出フラグメント精製、使用商業プラスミド抽出とゲル抽出キットそれぞれ。酵素の消化力の 100 ng の DNA、1 μ L の 10 x バッファー、各選択した制限酵素および滅菌 ddH2O 10 μ L の総ボリュームの 1 μ L を混合し、2.5-3 h の 37 ° C で孵化させなさい。
  5. 4 ms の 2,500 V の電気穿孔法による pWF279 プラスミドを大腸菌o157: h7 EDL933 有能なセルに変換します。
  6. 1 h の 37 ° C で 1 mL ルリア ベルターニカミラ (LB) 培地で変換された細菌の細胞を孵化させなさい。
  7. 16-18 時間 37 ° c カナマイシンの 50 μ g/mL を添加した LB 寒天培地プレート上の細菌をプレートします。
  8. は、生体内イメージング マシン次の日プレートの発光信号を確認してください。プレートから単一コロニーをピックアップし、3 mL 16 18 h の 37 ° C で 50 μ g/mL カナマイシンを添加した LB の文化します。
  9. 希釈することによって細菌のストック メディアの準備滅菌 ddH2O 30% グリセロールの解決をするために 100% グリセリン。
  10. 凍結カナマイシン耐性-80 ° C で細菌文化と 30% グリセロールの解決の 1:1 の比率としてスクリュー キャップ クリオバイアルで細菌の在庫としてルシフェラーゼ プラスミドをかくまっているエシェリヒア属大腸菌o157: h7 EDL933 細菌グリセロールの最終濃度は 15% です。

2. 発光 EHEC 菌経口接種に備えて

注: EHEC の作製とマウス経口実験プロシージャのタイムラインのフローチャートは図 1実験準備を支援するために提示されます。

  1. ストリークエシェリヒア属大腸菌o157: h7 EDL933 細菌-80 ° C 株式からの 50 μ g/mL カナマイシンと LB 寒天培地プレート上にルシフェラーゼ プラスミドをかくまっています。37 ° C で 16-18 h のバクテリアします。
  2. 一晩プレートと 220 rpm で 37 ° C のインキュベーターで 16-18 h の 50 μ g/mL カナマイシンを 3 mL の LB 培地での培養から単一コロニーを拾います。
  3. サブカルチャー流体培養基 LB の 200 rpm で 37 ° C の定温器で 2.5-3 時間を含んでいる (1: 100 希釈) カナマイシン (50 μ g/mL) に細菌。(追加 2 mL 一晩培養カナマイシン (50 μ g/mL) に 200 mL の LB 培菌など)。
  4. 2.5-3 h の細菌をインキュベートし、600 光学密度値を測定値まで nm (外径600) は、0.9 に 1 間。細菌の細胞数は約 108コロニー形成単位 (CFU) の密度で/mL。
  5. 遠心分離機の 4 ° C、30 分間 8,000 x g で再培養細菌
  6. 細菌のペレットを撹拌せず上澄みを廃棄し、穏やかな攪拌で 100 mL 0.9% 滅菌生理食塩水入りの餌を洗浄します。
  7. 2.5 および 2.6 の手順をもう一度繰り返します。
  8. その後、4 ° C、30 分間 8,000 の x g で細菌培養を遠心し、そっと上澄みを廃棄します。
  9. コンデンセート ペレットに 100 0.9% 滅菌生理食塩水入りに。例えば、200 mL の細菌は、遠心分離された場合、は、食塩水 2 mL 通常ペレットを中断するを追加します。
  10. 10 倍連続希釈25まで集中して細菌をメッキすることによって (にすべき約 109 CFU/100 μ 凝縮後食塩) する CFU の菌を確認します。

3. マウス経口 EHEC の

  1. 24 h のためのストレプトマイシン水 (5 g/L) と 6 週齢女性 c57bl/6 マウスを扱います。
  2. 24 h 後強制経口投与の前にさらに 24 時間の定期的な飲料水に切り替えます。24 時間定期的に水で治療、マウス経口 EHEC のため準備が整います。
  3. 100 μ L EHEC 菌で注射器を入力するには、プランジャーを手前に引きます。シリンジ内に気泡がないことを確認します。注射器の指をスナップすることによって泡を削除します。
  4. 動物を慎重に持ち上げ、ケアとケージの上に置きます。
  5. 慎重に、尾をマウスをつかみ、動物がケージの上部のグリップし離れて移動ましょう。
  6. そっと親指と人差し指の移動からマウスの頭を防ぐために動物の前後首のたるんだ皮膚をつかんでマウスを抑制します。
  7. 強制経口投与の針を挿入し、マウスの頭は固定化と垂直に垂直にマウスを保持します。
  8. 口の屋根に続くマウスの口に強制経口投与の針を挿入し、食道、胃へ移動します。
  9. 挿入した針が半分またはマウスの 3 分の 2 の長さの約 10 の9 CFU セルを含む 100 μ L EHEC 菌を注入します。

4. 可視化

  1. 経口投与後 1 ~ 2 日で発光信号を検出します。
  2. 動物の発光信号を調べる前に 1.5 L/分の酸素と 2.5% イソフルランの商工会議所にそれらを置くことによってそれらを麻酔します。
  3. すべてのマウスになる無意識との移動を停止するまで、2-5 分を待ちます。動物は、体内の発光検出のため準備ができています。
  4. 検出し、は、生体内イメージング システム動物の発光信号をイメージします。ソフトウェアの操作のセクション 5「データ取得」を参照してください。イメージング プロセス中にすべての動物が 1.5 L/分の酸素と 2.5% イソフルランの継続的な供給の下で。
    1. ファイルをクリックして > ライブ、および手動でマウスに焦点を当てます。
    2. 露出時間とレーザーの強度を選択します。
    3. 集録をクリック > をキャプチャします。
  5. Ex vivoイメージング、頚部転位によってマウスを安楽死させるし、感染マウスの小腸全体を削除します。生体内イメージング システム 9 cm シャーレとイメージで腸を配置します。設定は、生体内イメージング以外 A/B としてビューのフィールドを設定と同じ詳細については、セクション 5「データ取得」を参照してください。
    注: 頚部転位方法: 動物がケージをグリップできるように片方の手で尻尾をつかんでケージの上にマウスを抑制します。頭蓋底にマーカー ペンまたは親指と首の背部に対してもう一方の手の最初の指を置きます。すぐに頭を抑制しながら手や物体を進めて、尾を持っている手と後方を引き出します。
    呼吸の阻止とハートビートがない確認を念入りにチェックします。

5. データ集録

注: データ集録に使用するソフトウェアは、材料表に表示されます。

  1. 画像を取得する (図 2) ソフトウェアの取得コントロール パネルを開きます。
  2. 選択「発光」「写真」と「オーバーレイ」。
  3. 「自動」と露出時間をを設定します。「中」としてビニング設定します。
  4. 発光と 8 の 1 として ƒ/ストップの設定は写真のため。CCD 検出器によって光量受けた ƒ/停止を制御します。
  5. 画像取得に関心のあるフィールドに基づいてビューのフィールドを設定します。オプション"D"は、5 6 週齢マウスに合うし、すべて一度にそれらをイメージできます。"C"は、1 つのフィールドに 3 つの 6 週齢のマウスを映すことができます。
  6. マウス/サンプルは画像の準備ができましたら、画像の獲得のため「取得」をクリックします。
  7. 取得したイメージ データを開きます。
  8. ツール パレット パネル (図 3) を開きます。
  9. ROI ツールを選択します。画像 (図 4) の発光領域の範囲に円 (最も左のもの) をお勧めします。
  10. (図 3) 表面の発光強度を測定する「測定ロア」(鉛筆のアイコン) をクリックします。ROI 測定パネルと定量値 (図 5) が表示されます。
  11. ROI 測定パネルの左上隅の値/必要な情報 (図 6) を選択し、それ以外の場合このデータ テーブルをエクスポートして .csv ファイル (図 5) として保存する「エクスポート」をクリックして計測器の構成を使用します。
  12. .Csv ファイルの発光強度の定量化として「全光束 (p/s)"列の値を使用します。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

結果

生物発光ラベル EHEC を投与 (~ 109細菌細胞) 経口投与による 6 週間の古い女性 c57bl/6 マウスに。1 時間以内のマウスに EHEC の経口接種後動物は図 7に示すように、生体内イメージング システムによる発光信号について検討した.結果は、発光ラベル EHEC と強制経口投与マウスにおける強力な発光信号を示した。2 日間ポスト感染上の信号を調べた。図 8 aに示すとおり、マウス接種 2 日後に感染症は、EHEC を 2 日間でホストで植民地化を示唆した後も強烈な発光信号を示した発光ラベル野生型 EHEC EDL933。我々 は量も発光標識マウス (図 8 a) にΔrfaD (ΔrfaD) EDL933 を感染しています。この変異はリポ多糖 (LPS) に亡命した先行研究においてホストの植民地化を減らすために示されてい...

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

ディスカッション

それは、ホストまたは8,・11,・12生体内で遺伝子発現の局在を調べる EHEC ルシフェラーゼ プラスミドで形質転換が利用されていることが報告されています。ここに示すマウスモデルは、EHEC の植民地化のタイミングとローカリゼーションのマウス ホスト8検出に報告されています。それにもかかわらず、EHEC 接種マウスの量管理方法と経口用発光細菌を慎重に準備する方法の詳細プロトコルを提供します。特に、EHEC (ステップ 3.7) のマウス経口は強制経口投与針が挿入されるとき、マウスの頭の位置が重要に。位置が垂直、針を通過することは困難であろうし、マウスを傷つけることができる可能性が高い。3.8 の手順で強制経口投与の針はマウスの口の中、舌が横たわった口の外少し食道に強制経口投与針を渡す際に抵抗が発生した場合針を前進を停止し、すぐにそれを撤回します。針が食道に入っていることを確認してくださ...

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

我々 は、マウスに助けを感染と国立成功大学の研究所動物センターからの支援へのチー ・ チャン陳 Chi Mei 医療センター (台湾・台南) 医学研究科を認めます。この作品は科学の大臣によってサポートされ技術 (ほとんど) が CC に (最も 104-2321-B-006-019、105-2321-B-006-011、and106-2321-B-006-005) を付与します。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
シェーカーインキュベーターYIH DERLM-570Rバクテリアインキュベーション 
オービタル振盪インキュベーターFIRSTEKS300bacteria incubation 
pBSL180nptII遺伝子
pAKlux2luxCDABEオペロン
T&の源クローニングキットYeastern BiotechFYC001-20PTAクローニング用 
Nsi INEBR0127Sプラスミドクローニング用 
Sca INEBR0122Sプラスミドクローニング用 
Spe I-HFNEBR0133Sプラスミドクローニング用 
Sma I NEBR0141Sプラスミドクローニング用 
T4 リガーゼNEBM0202Sプラスミドクローニング用 
ExTaq TaKaRaRR001APCR増幅用
10X Ex Taq BufferTaKaRaRR001APCR Amplification
dNTP混合物 TaKaRaRR001APCR増幅
PCR装置への使用 バイオシステムに適用 2720サーマルサイクラー  PCR増幅
用 グリセロールSIGMAG5516-1Lバクテリアストック液用
NaClSigma31434-5KG-RLB培地を作るための薬品、10 g/L
トリプトンCONDA pronadisaCat 1612.00LB培地を作るための薬品、10 g/L
酵母エキス粉末Affymetrix23547-1 KGLB培地を作るための薬品、5 g/L
寒天CONDA pronadisaCat 1802.00LB寒天
kanamycinを作るための化学物質 SigmaK4000-5G抗生物質、セレシトン
ストレプトマイシンに使用 シグマS6501-100G抗生物質、マウスの微生物叢を排除
EDL933コンピテントセルの方法は補足文書にあります 
エレクトロポレーション用パルサー
エレクトロポレーションキュベットジーンパルサー/マイクロパルサー1652086エレクトロポレーション用
高速遠心分離機ベックマン・コールターアバンティ、J-26S XP遠心分離用バクテリア 
固定角ローターベックマン・コールターJA25.5遠心分離用バクテリア 
固定角ローターベックマン・コールターJLA10.5遠心分離用バクテリア 
ベックマン・コールター遠心分離ボトルREF357003細菌の遠心分離に使用 
遠心分離機ボトルサーモフィッシャーサイエンティフィック3141-0500遠心分離細菌用 
エッペンドルフバイオフォトメーター plus eppendorfAG 22331 ハンブルクのOD600値を測定するため
 NCKU
衣・人員保護用
イソフルラン パニオン&BFバイオテック株式会社G-8669マウス麻酔用、医薬品グレード
1mlシリンジ マウスの経口強制経口に使用
再利用可能な22 Gボールチップ給餌針φ0.9 mm X L 50 mm経口強制経口
外科用  はさみ マウス実験に使用
Xenogen IVIS 200イメージングシステムPerkin ElmerIVISスペクトルに生物発光画像キャプチャに使用 
データの定量化に利用リビングイメージソフトPerkin Elmerバージョン4.1
自家製エレクトロポレーター マイクロの バクテリアC57BL/6マウス実験動物センター白手袋  マウスの使用 画像する

参考文献

  1. Pennington, H. Escherichia coli O157. Lancet. 376 (9750), 1428-1435 (2010).
  2. Mayer, C. L., Leibowitz, C. S., Kurosawa, S., Stearns-Kurosawa, D. J. Shiga toxins and the pathophysiology of hemolytic uremic syndrome in humans and animals. Toxins (Basel). 4 (11), 1261-1287 (2012).
  3. Tarr, P. I., Gordon, C. A., Chandler, W. L. Shiga-toxin-producing Escherichia coli and haemolytic uraemic syndrome. Lancet. 365 (9464), 1073-1086 (2005).
  4. Obrig, T. G. Escherichia coli Shiga Toxin Mechanisms of Action in Renal Disease. Toxins (Basel). 2 (12), 2769-2794 (2010).
  5. Nguyen, Y., Sperandio, V. Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) pathogenesis. Front Cell Infect Microbiol. 2, 90(2012).
  6. Wiles, S., Robertson, B. D., Frankel, G., Kerton, A. Bioluminescent monitoring of in vivo colonization and clearance dynamics by light-emitting bacteria. Methods Mol Biol. 574, 137-153 (2009).
  7. Hutchens, M., Luker, G. D. Applications of bioluminescence imaging to the study of infectious diseases. Cell Microbiol. 9 (10), 2315-2322 (2007).
  8. Rhee, K. J., et al. Determination of spatial and temporal colonization of enteropathogenic E. coli and enterohemorrhagic E. coli in mice using bioluminescent in vivo imaging. Gut Microbes. 2 (1), 34-41 (2011).
  9. Karsi, A., Lawrence, M. L. Broad host range fluorescence and bioluminescence expression vectors for Gram-negative bacteria. Plasmid. 57 (3), 286-295 (2007).
  10. Lane, M. C., Alteri, C. J. S., Smith, S. N., Mobley, L. H. Expression of flagella is coincident with uropathogenic Escherichia coli ascension to the upper urinary tract. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (42), 16669-16674 (2007).
  11. Roxas, J. L., et al. Enterohemorrhagic E. coli alters murine intestinal epithelial tight junction protein expression and barrier function in a Shiga toxin independent manner. Lab Invest. 90 (8), 1152-1168 (2010).
  12. Siragusa, G. R., Nawotka, K., Spilman, S. D., Contag, P. R., Contag, C. H. Real-Time Monitoring of Escherichia coli O157:H7 Adherence to Beef Carcass Surface Tissues with a Bioluminescent Reporter. , (1999).
  13. Kuo, C. J., et al. Mutation of the Enterohemorrhagic Escherichia coli Core LPS Biosynthesis Enzyme RfaD Confers Hypersusceptibility to Host Intestinal Innate Immunity In vivo. Front Cell Infect Microbiol. 6, 82(2016).
  14. Wiles, S., et al. Organ specificity, colonization and clearance dynamics in vivo following oral challenges with the murine pathogen Citrobacter rodentium. Cell Microbiol. 6 (10), 963-972 (2004).
  15. Wiles, S., Pickard, K. M., Peng, K., MacDonald, T. T., Frankel, G. In vivo bioluminescence imaging of the murine pathogen Citrobacter rodentium. Infect Immun. 74 (9), 5391-5396 (2006).
  16. Contag, C. H., Contag, P. R., Mullins, J. I., Spillman, S. D., Stevenson, D. K., Benaron, D. A. Photonic detection of bacterial pathogens in living hosts. Mol Microbiol. 18 (4), 593-603 (1995).
  17. Hardy, J., Francis, K. P., DeBoer, M., Chu, P., Gibbs, K., Contag, C. H. Extracellular replication of Listeria monocytogenes in the murine gall bladder. Science. 303 (5659), 851-853 (2004).
  18. Kaniga, K., Sory, M. P., Delor, I., Saegerman, C., Limet, J. N., Cornelis, G. R. Monitoring of Yersinia enterocolitica in Murine and Bovine Feces on the Basis of the Chromosomally Integrated luxAB Marker Gene. Appl Environ Microbiol. 58 (3), 1024-1026 (1992).
  19. Trcek, J., Fuchs, T. M., Trulzsch, K. Analysis of Yersinia enterocolitica invasin expression in vitro and in vivo using a novel luxCDABE reporter system. Microbiology. 156 (Pt 9), 2734-2745 (2010).
  20. Morin, C. E., Kaper, J. B. Use of stabilized luciferase-expressing plasmids to examine in vivo-induced promoters in the Vibrio cholerae vaccine strain CVD 103-HgR. FEMS Immunol Med Microbiol. 57 (1), 69-79 (2009).
  21. Law, R. J., Gur-Arie, L., Rosenshine, I., Finlay, B. B. In vitro and in vivo model systems for studying enteropathogenic Escherichia coli infections. Cold Spring Harb Perspect Med. 3 (3), a009977(2013).
  22. Ritchie, J. M. Animal Models of Enterohemorrhagic Escherichia coli Infection. Microbiol Spectr. 2 (4), EHEC-0022-2013(2014).
  23. Chou, T. C., et al. Enterohaemorrhagic Escherichia coli O157:H7 Shiga-like toxin 1 is required for full pathogenicity and activation of the p38 mitogen-activated protein kinase pathway in Caenorhabditis elegans. Cell Microbiol. 15 (1), 82-97 (2013).
  24. Alexeyev, M. F., Shokolenko, I. N. Mini-Tnl 0 transposon derivatives for insertion mutagenesis and gene delivery into the chromosome of Gram-negative bacteria. Gene. 160 (1), 59-62 (1995).
  25. Wiegand, I., Hilpert, K., Hancock, R. E. Agar and broth dilution methods to determine the minimal inhibitory concentration (MIC) of antimicrobial substances. Nat Protoc. 3 (2), 163-175 (2008).
  26. Pansare, V., Hejazi, S., Faenza, W., Prud'homme, R. K. Review of Long-Wavelength Optical and NIR Imaging Materials: Contrast Agents, Fluorophores and Multifunctional Nano Carriers. Chem Mater. 24 (5), 812-827 (2012).
  27. Heim, R., Cubitt, A. B., Tsien, R. Y. Improved green fluorescence. Nature. 373 (6516), 663-664 (1995).
  28. Weissleder, R. A clearer vision for in vivo imaging. Nat Biotechnol. 19 (4), 316-317 (2001).
  29. Frangioni, J. In vivo near-infrared fluorescence imaging. Current Opinion in Chemical Biology. 7 (5), 626-634 (2003).
  30. Collins, J. W., et al. Citrobacter rodentium: infection, inflammation and the microbiota. Nat Rev Microbiol. 12 (9), 612-623 (2014).
  31. Mallick, E. M., et al. A novel murine infection model for Shiga toxin-producing Escherichia coli. J Clin Invest. 122 (11), 4012-4024 (2012).
  32. Petty, N. K., et al. The Citrobacter rodentium genome sequence reveals convergent evolution with human pathogenic Escherichia coli. J Bacteriol. 192 (2), 525-538 (2010).
  33. Kovach, M. E., Elzer, P. H., Hill, D. S., Robertson , G. T., Farris, M. A., Roop, R. M. II, Peterson, K. M. Four new derivatives of the broad-host-range cloning vector pBBR1MCS, carrying different antibiotic-resistance cassettes. Gene. 166 (1), 175-176 (1995).
  34. Galen, J. E., Nair, J., Wang , J. Y., Wasserman, S. S., Tanner, M. K., Sztein , M. B., Levine, M. M. Optimization of Plasmid Maintenance in the Attenuated Live Vector Vaccine Strain Salmonella typhiCVD 908-htrA. Infect Immun. 67 (12), 6424-6433 (1999).
  35. Francis, K. P., et al. Visualizing pneumococcal infections in the lungs of live mice using bioluminescent Streptococcus pneumoniae transformed with a novel gram-positive lux transposon. Infect Immun. 69 (5), 3350-3358 (2001).
  36. Goldwater, P. N., Bettelheim, K. A. Treatment of enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC) infection and hemolytic uremic syndrome (HUS). BMC Med. 10, (2012).

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

再版と許可

タグ

腸管出血性大腸菌生物発光イメージング生体内イメージングマウス定着モデル経口投与法発光定量盲腸定着結腸定着体外イメージング非侵襲的検出
非侵襲体内生物発光システムによってマウスのホストである腸管出血性大腸菌の植民地化の検出
お問い合わせ
図書館に推薦する

プライバシー

利用規約

ポリシー

著作権 © 2026 MyJoVE Corporation. 無断転載を禁じます。