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方法論記事

マウス着床前胚幹細胞の誘導

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⸱

DOI:

10.3791/56171

⸱

2017年8月20日

 ,  , 
1Unitat de Biologia Cellular, Facultat de Biociències, Universitat Autònoma de Barcelona

この記事について

サマリー

この資料では、効率的に派生し、胚盤胞の段階でマウス胚からの多能性幹細胞株を培養するプロトコルについて説明します。

要約

マウス胚性幹細胞 (mESC) の導出は、着床前の胚からの多能性細胞が確立されたプロセスです。これらの行は、自己更新または特定の条件の下で区別するための能力を保持します。これらのプロパティにより mESC、再生医療、疾患モデル作製、および組織エンジニア リングの研究に有用なツールです。寛容なマウス系統白血病阻害因子を添加した培地でフィーダー細胞から胚盤胞培養 mESC 行高導出効率 (60 ~ 80%) を取得するための単純なプロトコルを説明します。プロトコルは、派生メディア (2i 中) に 2 つの小分子阻害剤のカクテルの簡単な付加によって効率的に mESC 行を非感受性マウス系統から派生にも適用できます。準備とフィーダー細胞、コレクションと mESC 行のマウス胚および派生のカルチャとカルチャのカルチャに関する詳細な手順を提供しています。このプロトコルは、特殊な機器を必要としないし、基本的な哺乳類の細胞の文化の専門知識を持つ任意の研究室で実施することができます。

概要

胚性幹細胞 (ESC) は、自己更新または [特定の条件1を区別する能力を保持する着床前胚由来多能性細胞です。これらのプロパティに基づいて、esc キー、再生医療、疾患モデル作製、組織工学研究2便利なツールとなっています。

ESC は、初めて着床前マウス胚、低成功3,4マウス ESC (mESC) 線を元から派生しました。長年、導出効率残った多能性体外を維持が困難なのため、低。その上フィーダー細胞の5導出の効率を向上させる存在促進コロニーの添付ファイルと、核型安定性6、多能性維持の改善にプロトコル リードのいくつかの変更。最も重要なだった白血病抑制因子 (LIF) のまた mESC 培7、8、129S2 寛容な背景9からの胚の使用と mESC を添加した培地での培養が定義されています。血清、潜在的な差別化要因10の無料。最近では、説得力のある証拠はまた mESC 培 (2 i として知られている) するシグナル伝達経路の 2 つの小分子変調のカクテルの多能性を維持するために最善であることを示しています。マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ (MAPK) 経路を阻害することによって分化信号を減らす、PD0325901 MEK 阻害剤の GSK3β 阻害剤 CHIR99021 は、低密度で細胞の生存を高める組み合わせから成るカクテル 2i11wnt シグナル経路を活性化。

本稿では効率的に mESC 行をマウス胚盤胞に由来する単純なプロトコルをについて説明します。LIF と血清交換12導出培にフィーダー細胞に寛容な系統からの胚を培養標準の手順を従ってください。このプロトコル、mESC ラインは、2 i の中で得られたものと同等の効率で派生できます。これにもかかわらず、非寛容な系統を扱うときに多能性維持、または可能性のある問題を回避する 2 i を追加できます。

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プロトコル

動物と Autònoma · デ · バルセロナの人間研究に関する倫理委員会、部門 d の以下のセクションに記載されている動物の使用を承認されている ' Ramaderia、育種釣り私ジャナラリター ・ デ ・ カタルーニャ (プロトコル #8741) の Alimentació

。

1 フィーダー細胞の不活性化とストレージ

注: ひと包皮線維芽細胞 (HFF-1) 以前 90% 胎仔ウシ血清 (FBS) と 10% ジメチル ジメチルスルホキシド (成る凍結溶液 1 mL でフリーズした。DMSO)、使用するまで液体窒素に保存されます

。
  1. 37 ° C の水浴のバイアルを浸すことによって HFF 1 (1 mL) のセラムを解凍
    2. 。
  2. 極低温バイアルの解凍の内容を予め温めておいたダルベッコに追加 ' 更新イーグル s ' s 媒体 (DMEM) 10% を 1:10 に FBS 希釈
    3. 。
  3. T75 フラスコで希薄化後のセル (10 mL) をシードし、37 ° C、5% CO 2 でそれらを文化します
    4. 。
  4. 次の日は、DMSO の残党を排除するために媒体を変更します。メディアを削除し、10% に予め温めておいた DMEM の 10 mL を追加 FBS
    5. 。
  5. 、タイトピロー包装文化し、文化融合の段階に達するまで、媒体ごとの 48 h を変更します。これは約 7 〜 10 日かかる場合があります
    6. 。 不活化ソリューションを準備、10% を DMEM にマイトマイシン C を希釈する
  6. 10 μ G/ml の最終的な集中に FBS。37 ° C、5% CO 2 で 3 h の不活化ソリューションと細胞をインキュベートします
    7. 。
  7. 不活性化ソリューションを削除、三度と 2 mL のハンクス平衡塩ソリューション (HBSS) マイトマイシン C の残骸を除去するために細胞をすすいでください
    8. 。
  8. 不活化セルを解除するには、予め温めておいたトリプシン EDTA 溶液の 1 mL を追加し、37 ° C、5% CO 2 で 5 分間インキュベートします
    9. 。
  9. が切断されていることを確認する倒立顕微鏡下で細胞を観察 (0.3 の開口または NA 10 × 対物)。そうでない場合は、37 ° C、5% CO 2 で、数分間インキュベートします。再び倒立顕微鏡下で細胞を確認してください
    10. 。
  10. 細胞塊を分離するためにソリューションをパスツール ピペット ピペットします
    11. 。
  11. 10 %fbs と再懸濁します DMEM の 4 つの mL を追加することによって酵素のソリューションを中和します
    12. 。
  12. 細胞懸濁液の因数と HBSS で 1: 100 希釈を行います。セルの数を決定する、ノイバウアーに希釈の 10 μ L を読み込む ' s 商工会議所。(0.45 NA で 20 × 対物) 倒立顕微鏡下で商工会議所の大きな四角形の 1 つであるセルをカウントします。
    1. 4 つの大きな正方形の合計にカウントの繰り返し。N (N) のセルの合計数を計算するセルの数の平均値を = 容量希釈 x 10 4 x x カウント
      2. 。
  13. 上清 200 x g. 破棄で 5 分間サンプルの残りの部分を遠心し、凍結 1 mL あたり 10 の 6 セルの濃度の溶液にペレットを再懸濁します
    14. 。
  14. 因数 10 6 セル (1 mL) 各セラム チューブの懸濁液。冷凍コンテナーでセラム チューブを置き、-80 でフリーズ ° C
  15. 次の日は、液体窒素でセラム チューブを格納します
    16. 。

2。フィーダー細胞培養

  1. 導出プロセスを開始する前に 1 〜 4 日雪解けセラム 1 x 10 の 6 を含む不活化 37 で水浴の HFF 1 セル ° C
  2. で解凍 HFF 1 の 1:6 希釈加温 10 %fbs と 37 温 DMEM を ° C
  3. 豚皮から予め温めておいた 0.2% のゼラチンの 500 μ L で 4 ウェル プレートのすべての井戸を埋めるし 37 ° C で 10 分間でプレート
  4. は井戸からゼラチンの 500 μ L を取り外してタイトピロー包装希釈を 500 μ l 添加します。井戸の底にタイトピロー包装の均一な分布を確実にプレートがみ合います。円形の動きを避けるために、井戸の中央に細胞が集中
    5. 。
  5. 少なくとも 24 h 各ウェルで不活化タイトピロー包装の単分子膜を取得する CO 2 を 37 ° C、5% でプレートをインキュベートします
    6. 。
  6. 次の日は (0.3 NA と 10 × 対物) 倒立顕微鏡下で細胞を観察し、接続されているが、均一を確認します。DMSO の残党を排除するために媒体を変更します。メディアを取り出して、10% に予め温めておいた DMEM を 500 μ l 添加 FBS
    7. 。

3。胚のコレクションおよび文化

  1. 4 日採卵前に、管理 5 IU 妊馬の ' 6-12 週齢の雌マウスに腹腔内投与による s 血清ゴナドトロピン
    。 注: 他のマウス系統から女性を使用できますが、129S2 または B6CFAF1 株から雌を使用している我々。それにもかかわらず、とき (例えば CBA)、非寛容な株から雌と作動媒体補わなければなりません 2i と手順 4.2 で説明した
    2. 。
  2. 後 48 h と腹腔内投与によるひと絨毛性ゴナドトロピンの 5 IU を管理する少なくとも 8 週齢、1:1 の比率で男性と女性を仲間します。次の日、男性から女性を区切ります
    3. 。
  3. 採卵前日は 35 mm 細胞培養シャーレ 4 mg/ml のウシ血清アルブミン (BSA) KSOMaag 培のいくつかの 40 μ L 滴を準備し、鉱物油滴を完全にカバーするためにプレートを埋めます。媒体を平衡に CO 2 を 37 ° C、5% で皿をインキュベートします
    4. 。 胚操作ピペットを準備する
  4. は熱長い先端ガラス パスツール ピペット ブンゼン バーナーを使用しての薄い部分です。柔らかい、炎から引き出すし、2 つの端を離れて引っ張る。希望の長さにそれを破る。先端の内径が 100-150 μ m にする必要があります
    5. 。
  5. 頚部転位 45 48 h の ポストの coitum (パソコン) による雌マウスを安楽死させる
    6. 。
  6. は、湾曲した滑らかな鋭いハサミで皮膚とまっすぐ鋭いハサミで腹膜を切断することによって腹腔内を公開するマウスを解剖します。ピンセットで 1 つ子宮をつかむ、まっすぐ鋭いはさみを使用して卵管を切断し、Hepes バッファー CZB 培地 (HCZB) 13 37 に ° c. その他の卵管を削除する処理を繰り返します
    7. 。 2 細胞期胚を収集する時計鉗子によって行われて
  7. フラッシュ HCZB 搭載 1 mL 注射器で卵管
    。 注: フラッシュの針を 30 G の注射針を準備する、最後をカットし、研磨石の鈍い先端に地面します
    8. 。
  8. 口のピペットなどの器具を使用して、胚をピックアップ、HCZB で洗って、胚盤胞期まで 37 ° C、5% CO 2 で事前に準備された胚培養皿にそれらを文化します。50 胚までそれぞれ 40 μ L ドロップで培養することができます。胚開発顕微鏡の下のすべての 24 h を監視します
    。 注: 代わりに、胚を 体外で 胚培養を短縮する胚盤胞の段階で収集できます。この場合、3.5 から 4.5 p. c. の日に女性を安楽死させる、子宮を解剖します。HCZB とフラッシュと
    9. 。

4。幹細胞誘導

    胚の播種日 派生プレートの準備
    2. 100 μ M β 2 メルカプトエタノール、1 を DMEM 培地を補うことで派生メディアの準備 x 非必須アミノ酸、血清の置換、および 10 の 20 3 U/mL LIF。
    3. に応じて、また追加 MEK 阻害剤 PD0325901 の 1 μ M と 3 μ M の GSK3 阻害剤 2i 媒体を取得する CHIR99021 です
      4. 。
    4. 取るから不活化タイトピロー包装 (ステップ 2.6) の単分子膜 4 ウェル プレート、インキュベーター。メディアを取り出して、予め温めておいた派生中の 800 μ L を各ウェルに追加します。インキュベーターにプレートを返します
      5. 。
  1. 透明帯除去、播種胚
    1. 35 mm 細胞培養シャーレ酸性 Tyrode 3 30 μ L 滴と準備 ' s ソリューション 14 派生中 3 30 μ L 滴。鉱物油と滴をカバーし、37 で皿を保つ ° C
    2. は、インキュベーターから胚培養皿を取る。一つずつ酸性 Tyrode 文化滴から、胚盤胞を転送 ' s ソリューション ドロップ操作、胚のピペットを使用しています。可能な場合のみ、拡張胚盤胞導出プロセスを開始するを選択します
      3. 。
    3. は、顕微鏡下で透明帯消化を監視します。透明帯が消えると、すぐに、派生中ドロップする酸性 Tyrode を洗浄するために胚盤胞を転送 ' s ソリューションです
      4. 。
    4. 各ウェルにインキュベーターと種子 1 つ透明帯除去胚盤胞フィーダーから 4 も派生板細胞を取る
      5. 。
    5. 4 よく導出プレート インキュベーターと 37 ° C、5% CO 2 で文化に戻ります
      6. 。
  2. 監視幹細胞成長および媒体を変更
    1. 培養倒立顕微鏡 (0.45 NA で 20 × 対物) の下のすべての 24 h を監視します。幹細胞の分化、腫れの屈折細胞周囲の副産物かもさておき、フィーダー細胞を押すなどの兆候があるかどうかに注意することが重要だ
      2. 。
    2. 毎日、文化の媒体を変更します。インキュベーターから 4 ウェル プレートを取る、各ウェルからメディアを取り出して、使用される場合は LIF と 2 i、予め温めておいた導出培の 800 μ L を追加します。(6-8 日) 観察される増殖までの文化を維持します
      3. 。

5。幹細胞文化およびメンテナンス

  1. 準備 Kolle のようなハンドルおよび幹細胞操作ピペット。フォロー ステップ 250-300 μ m の先端の内径と幹細胞操作ピペットを準備するのに 3.4 Kolle のようなハンドルを準備するのにプルのパスツール ピペットの他の部分を使用します。熱し、フックを得るまで形状します
    2. 。
  2. は、インキュベーター外 4 ウェル培養プレートを取るし、顕微鏡下で伸長を探します。分化細胞や副産物を囲む餌箱を押してすぐハンドルを使用します
    。 メモ: 最終的な分化、伸長を避けるためには、それは副産物の端から差別化されたすべてのセルを削除することが重要です
    3. 。
  3. 幹細胞操作ピペットと伸長を吸引し、50 μ L のトリプシン-EDTA ドロップで新しい料理
    4. 。
  4. メスを使用して、両方の機械的および酵素の分解およびそれのためにいくつかの部分に突起をカットします
    5. 。
  5. すぐにトリプシンを中和するために導出中の新鮮なドロップに伸長フラグメントを転送します
    6. 。
  6. は、フィーダーの単分子膜の新しい 4 ウェル プレートに伸長フラグメントを転送します。ウェルあたり最大 10 個の断片を転送し、誘導培地で 37 ° C および 5% の CO 2 とそれらを文化します
    7. 。
  7. は、mESC の樹立を検討する前に、少なくとも 6 週間の幹細胞のような文化を維持します。他のすべての日とサブカルチャー媒体を変更して週に 1 回
    8. 。

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結果

このプロトコルに従い以上伸長形成の 95% の文化 (図 1 a) の最初の週後達成する必要があります。6 継代後 mESC の樹立は、60-80% の平均成功の実験的複製間で変数です。2i 添加ほど向上しません結果 129S2 のバック グラウンドを持つものなど、寛容なマウス系統を操作するときが、非寛容な系統を使用するときに必要です。

マウス esc キー コロニー フラットの形をした正規の形態を示すべきである (図 1 b-C) 治療せず培養した場合のエッジを定義や 2i で培養された (図 1)。コロニー周辺分化標識の提示をする必要があります (図 1E-F

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ディスカッション

MESC 行派生は日常的に多くの実験室で使用されるよく知られているプロシージャが、その効率は常に多能性維持を妨げることができる複数の要因のために期待高。本稿で示す、ステップバイ ステップ、シンプルで信頼性のあるプロトコルを使用して高効率 mESC ラインを確立する方法。これらの効率は文献で報告されたものに似ています。

最大の効率を確保するため、毎日、細胞を制御することが重要ですし、毎日、以降示されたポイントだけ説明。これは細胞死と分化を促進するためにコロニーの増殖を避けるために不可欠です。これはまた細胞生存率を減らすことができるためにも、継代培養中植民地のトリプシン-EDTA への暴露を可能な限り減らすために重要です。

もう一つの重要な要因は、フィーダー細胞のソースと彼らの文化です。いくつかの研究は、マウス、マウス萌芽期の繊維芽細胞 (MEF) HFF STO 線維芽細胞が均等に esc キー導出と文化15をサポートすることが実証しています。ただし、HFF は文化

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開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

ジョナタン ルーカスは、フィーダー細胞培養、動物のケアのための Servei Estabulari デ ラ UAB とビデオを記録するための Domènec ・ マルティンと技術的な援助を感謝いたします。この作品は Ministerio デ エコノミア y Competitividad AGL2014-52408-R、ジャナラリター ・ デ ・支えられているカタルーニャ 2014 SGR 524。MVC は、PIF UAB フェローシップの受益者です。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
1 mLスリリンジBD 
2-&β;-メルカプトエタノールLife Technologies31350-010
4ウェルプレートThermo Scientific Nunc176740
酸性チロード液 自家製Nagy et al、2003のレシピを参照してください。短期保管(最大1か月)の場合は4°Cに保ちます。または、長期保管の場合は-20°Cに保ちます。溶液の効率が低下する場合は、HCl 1Mの小さな滴を追加することで酸性化する必要があります。
BSASigmaA3311
Chicken anti-Mouse IgG, Alexa Fluor 488Molecular Probes - InvitrogenA-212001:500希釈。Oct4、Tuj1、αSMAおよびAFPマウス抗体の二次抗体 
CHIR990212Axon Medchem 1386粉末1mgごとに2.15 ml DMSOで再構成し、1 mMのストック溶液を得る。希望の量で分注し、-20°Cで保存します。凍結と解凍のサイクルは避けてください。 
CryoTubeThermo Scientific Nunc3754518
DMSOSigma41640
DMEMBioWestL0107
FBSBioWestS1810使用前に56°Cで30分間加熱して不活化してください。C
フラッシングニードルBD 304000石の鈍い先端に粉砕
Fluka48724蒸留水で0,2%で希釈し、オートクレーブします。各希釈液は1ヶ月間使用できます。
ヤギ抗ウサギIgG、Alexa Fluor 594分子プローブ - InvitrogenA-110371:500希釈。Sox2ウサギ抗体の二次抗体 
HBSSBioWestL0611
Hepes緩衝CZB Chatot et al, 1989
Human chorionic gonadotropinDivasa-FarmavicVeterin-Corion 3000 UINaCl 0.9% at 50 IU/ml. Aliquot it in 1 mL and store at -20ºCは最長2ヶ月間。解凍したら、再び凍結しないでください。 
人間の包皮の線維芽細胞ATCCATCCSCRC-1041長期保存のために液体窒素でそれらを保存することをお勧めします。
ノックアウトセラムリプレイスメントライフテクノロジーズ 10828-028光性。10mlなどの少量で分注し、-20°Cで保存することをお勧めします。C(有効期限を確認してください)。凍結と解凍のサイクルを避けてください。   
KSOMaag EvolveZenith BiotechZEKS-050、4 mg / mlBSA付き。37ºで平衡化します。Cと5%のCO2を使用前に。
白血病抑制因子Merk MilliporeESG1106
マウス Charles River/HarlanmESCの導出に関しては、寛容株(129S2やC57BLなど)のマウスを使用することをお勧めします。しかし、近交系は胚を産生する効率が悪いです。したがって、ハイブリッドの活力を利用するために、129S2 x C57BLまたはB6CBAF1などのハイブリッド株を使用することをお勧めします。 
ミネラルオイルSigmaM8410胚を試験しました。感光性. 
マイトマイシンCServa2980501粉末をMilliQ水で0.5 mg / mlで再構成します。Cは光から保護します。注意、それは有害であり、癌を引き起こす疑いがあります。 
マウス抗チューブリン&β;III (Tuj1)BiolegendMMS-435P1:500
マウスモノクローナル抗アルファ;SMASigmaA52281:200
マウスモノクローナル抗AFPR&D SystemsMAB13681:50希釈マウス
モノクローナル抗Oct3/4 Santa cruzSc-52791:50希釈
非必須アミノ酸LifeTechnologies11140-035
PD0325901Axon Medchem 1408粉末1mgごとに2.08 ml DMSOで再構成し、1 mMのストック溶液を得る。希望の量で分注し、-20°Cで保存します。凍結と解凍のサイクルは避けてください。
ペトリ皿 (35mm)Thermo Scientific Nunc153066
ペトリ皿 (60mm)Thermo Scientific Nunc150288
妊娠中の牝馬の血清性腺刺激ホルモンフォリゴンフォリゴン-1000 UINaCl 0.9% で 50 IU/ml. 1 mL で希釈し、-20º で保存します。Cは最長2ヶ月間。解凍したら、再び凍結しないでください。 
Rabbit policlonal anti-Sox2Merck MilliporeAB56031:200 dilution
T75 falconThermo Scientific130190
Trypsin-EDTA 10xBioWestX0930HBSSで1:10希釈して1x溶液を得る
309628針の端を切り、豚の皮からゼラチンの研磨します 自家製 感サプリメント希釈 希釈

参考文献

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