Method Article

リアルタイムで開発を可視化する多光子タイムラプス イメージング: ゼブラフィッシュ胚の神経堤細胞の可視化

DOI:

10.3791/56214

⸱

August 9th, 2017

 , 
1Department of Ophthalmology and Visual Sciences, Kellogg Eye Center, University of Michigan

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

長い波長多光子蛍光励起顕微鏡レーザーの高度な光学技術の組み合わせは、Tg (sox10:EGFP) および Tg (foxd3:GFP) ゼブラフィッシュ胚の神経堤移行の高解像度、リアルタイム三次元画像をキャプチャする実装されました。

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

先天性の目と頭蓋顔面の異常、神経の頂上、全身に様々 な細胞タイプに上昇を与える渡り鳥の幹細胞の一時的な人口の混乱を反映します。神経の頂上の生物学を理解することは、制限、リアルタイムで生体内で調査することができます遺伝的扱いモデルの不足を反映してされています。ゼブラフィッシュは、渡り鳥細胞群、神経堤などを勉強するため特に重要な発達モデルです。Sox10とfoxd3初期神経分化と神経堤細胞のマーカーを表す可能性があります多数の動物モデルで示されている、発展途上の目に神経の頂上の移行を検討するには、長波長多光子蛍光励起顕微鏡レーザーの高度な光学技術の組み合わせはトランスジェニックゼブラフィッシュ胚で、Tg (sox10:EGFP) と Tg (foxd3:GFP)、すなわち開発の目の高解像度、立体化、リアルタイムのビデオをキャプチャする実装されました。多光子タイムラプス イメージングは、動作や目の早期開発に貢献する 2 つの神経堤細胞集団の移住性パターンを識別する使用されました。このプロトコルは、例としてゼブラフィッシュ神経堤移行中に時間経過のビデオを生成するための情報を提供し、ゼブラフィッシュと他のモデル有機体の多くの構造の初期の開発を視覚化するさらに適用することができます。

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

先天性眼疾患小児失明を引き起こすことができるおよび頭蓋神経堤の異常によることが多い。神経堤細胞は神経管から発生し、全身の多くの組織を形成する非定常の幹細胞です。1,2,3,4,5前と、中脳由来神経堤細胞は、骨と軟骨の顔面と前頭葉、虹彩、角膜、小柱網と目の眼の強膜に上昇を与えます。4,6,7,8神経堤細胞、咽頭アーチ菱フォーム、あご及び心臓流出路から。1,3,4,9,10研究を強調しますしている眼に神経の頂上の貢献や眼周囲の開発、脊椎動物の目の開発のこれらのセルの重要性を強調します。確かに、神経堤細胞の移動と分化の混乱は、Axenfeld リーガー症候群および Peters プラス症候群における顎顔面と眼球の異常に します。11,12,13,14,15,16,17したがって、これら神経堤細胞の分化、増殖、移行の包括的な理解は、先天性眼疾患の基になる複雑さに洞察を提供します。

ゼブラフィッシュはゼブラフィッシュ眼の構造は、哺乳類に類似し、多くの遺伝子は、ゼブラフィッシュと哺乳類の間保存された眼の開発を研究するため強力なモデル生物です。18,19,20また、zebrafish の胚が透明で、卵生、目におけるリアルタイムの可視化を促進します。

以前に発行された仕事で拡大して、6、7,20神経堤細胞の移動パターン多光子蛍光タイムラプス イメージング (性決定領域 Y) sry 遺伝子の転写制御の下で緑色蛍光タンパク質 (GFP) の付いたトランスジェニックゼブラフィッシュ線を使用して記述された-ボックス 10 (sox10) またはフォーク ヘッド ボックス D3 (foxd3) 遺伝子の規定する領域。21,22,23,24. 多光子蛍光タイムラプス イメージングはレーザ走査型顕微鏡標本 fluorophores が付いているタグの立体化、高解像度の画像をキャプチャする長い波長多光子蛍光励起の高度な光学技術を組み合わせた強力な手法です。25,26,27多光子レーザーの使用増加組織浸透と減少蛍光漂白などを含む標準の共焦点顕微鏡上の明確な利点があります。

このメソッドを使用すると、移行と渡り鳥の経路のタイミングでさまざまな神経堤細胞の 2 つの異なる集団が眼周囲間充織と発展途上の目で判別、すなわち foxd3 陽性の神経堤細胞と顔面の間充織で sox10 陽性神経堤細胞。この方法では、開発中にリアルタイムで規制の神経堤の移行を観察しやすくゼブラフィッシュ眼と顔面神経の頂上の移行の移行を可視化へのアプローチは導入されました。

このプロトコルは、Tg (sox10:EGFP) の例として、Tg (foxd3:GFP) 遺伝子導入ゼブラフィッシュ初期の目の開発の間に時間経過のビデオを生成するための情報を提供します。このプロトコルは、ゼブラフィッシュ神経堤細胞由来眼と顔面の構造体の早い開発の高解像度、リアルタイム 3次元可視化のためさらに適用できます。また、このメソッドは、他の組織や臓器ゼブラフィッシュと他の動物モデルの開発の可視化のためさらに適用できます。

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ここで説明するプロトコルは、ミシガン大学動物の使用と世話に関する委員会(UCUCA)によって確立された実験動物の人道的取り扱いに関するガイドラインに従って実施されました。

1. タイムラプスイメージングのための胚採取

  1. 午後3時から9時の間に、オスとメスの成魚Tg(sox10:EGFP)またはTg(foxd3:GFP)トランスジェニックゼブラフィッシュをペア交配のための分割された繁殖水槽に設置します><。 注:トーマス・シリングとメアリー・ハロランからの親切な贈り物であるTg(sox10:EGFP)とTg(foxd3:GFP)の魚は、それぞれキャスパー(ロイ-/-、真珠層-/-)の背景に交差して、自家蛍光と色素沈着の干渉を減らしました。
    1. ブリーディングタンク(スロット付きインナータンク+ソリッドアウタータンク)を組み立て、逆浸透(RO)システムの水で満たします。
    2. 仕切りで区切られた水槽の反対側に最大3匹のメスと3匹のオスを移します。1つの繁殖水槽で最大6匹の魚をペアで繁殖させることができます。
    3. 翌朝、ビバリウムのライトが点灯した直後に仕切りを取り外します.
      注:本研究では、ライトは14時間ライト(午前9時に点灯)と10時間暗灯(午後11時にオフ)のサイクルで点灯しています。
    4. 20分間、または十分な数の胚が生成されるまで、邪魔されずに交配を行ってください。胚は繁殖タンクの底にあります。卵が観察されたら、スロット付きのインナータンクを魚と一緒に持ち上げ、それら(魚とインナータンク)をRO水で満たされたきれいな固体のアウタータンクにすばやく入れます。
  2. RO水1 Lあたり0.287 g(4.9 mM)NaCl、0.127 g(0.17 mM)KCl、0.048 g(0.33 mM)CaCl2.2H 2O、0.04 g(0.33 mM)MgSO4(無水)を添加して、標準的な1X胚培地を調製します。塩が完全に溶解するまで溶液を攪拌します。
    1. 0.1%メチレンブルー100μLを殺菌剤として添加します。0.25gの重炭酸ナトリウムを加えて、pHを7.75に調整します。培地は室温で保存してください。
  3. 卵収集スクリーンを使用して外側のタンクから卵を採取し、卵を30mLの1X胚培地を含むシャーレ(皿あたり~50個の胚)に移します。採取した卵を28.5°Cでインキュベートします。
  4. 胚の準備
    1. Tg(sox10:EGFP)胚。
      1. Tg(sox10:EGF)胚については、受精後12時間(hpf)で死んだ卵子を取り出し、胚の発生段階を評価します。標準的な460-490 nmバンドパス励起フィルターを備えた解剖蛍光実体顕微鏡を使用したGFP陽性胚のスクリーニング。鉗子を使用して、GFPを発現する3〜4個の胚から絨毛膜を取り出し、これらの胚を30mLの新鮮な1X胚培地を含む別のシャーレに移します。
    2. Tg(foxd3:GFP)胚。
      1. Tg(foxd3:GFP)胚の場合、22-24 hpfで、死んだ卵子を取り出し、胚の発生段階を評価します。解剖性蛍光実体顕微鏡と標準的な460-490 nmバンドパス励起フィルターを使用して、陽性胚をスクリーニングします。鉗子を使用して、GFPを発現する3〜4個の胚から絨毛膜を取り除きます。
      2. 1000X Phenylthiourea(PTU)ストック溶液を調製するには、0.75 g(3%)のPTUを25 mLのジメチルスルホキシド(DMSO)に溶解します。ストック溶液を分注して4°Cで保存し、1000X PTU(3%)ストック溶液30 μLを1X 胚培地30 mLに加えて、0.003% PTU溶液を生成します。
      3. スクリーニングおよびデコレーションしたGFP陽性胚を0.003%PTU溶液に入れて、色素沈着を抑制します。早期治療(<20 hpf)は神経堤と神経上皮の発達に悪影響を与える可能性があるため、20 hpfより前にPTUによる胚の治療を開始しないでください。.28
    3. タイムラプス実験を行う前に、温度ドリフトの制御として、標準的な実体顕微鏡を使用して12〜24時間間隔で年齢一致比較を行い、ライブイメージングを通じて胚を監視します。

2. タイムラプスイメージングのための胚の装着

  1. タイムラプス胚培地の調製
    1. 100 mLのRO水に0.004 gのトリカインを加えて、標準の0.4%トリカインストック溶液を調製します。ストック溶液を新鮮な1.5 mL遠心チューブに分注(~1 mL)し、-20°Cで保存します。
    2. 2 mLの0.4%トリカイン溶液を48 mLの1X胚培地に加え、タイムラプス胚培地(50 mLの1X胚培地、0.016%トリカイン)を調製します。胚を使用する場合 >22 hpf、次に、胚培地に50 μLの3% PTUストック溶液(最終濃度.003% PTU)も加えます。
  2. 2%低融点アガロースの調製
    1. 0.4 gの低融点アガロース粉末を20 mLの1X胚培地に加えます。1〜2分間、または溶液が透明になり、すべての粒子が溶解するまで加熱します。
      注:アガロースゲルの割合を増やすと、マトリックスの多孔性が減少し、胚の成長と発達を物理的に妨げる可能性があります。したがって、アガロース溶液を1.5%に下げて、これらの影響を最小限に抑えることができます。しかし、レーザー走査型顕微鏡で励起ビームを静止させておくと、より大きな加熱が発生し、時間とともに対数関係で急速に増加する可能性があります。このプロトコルでは、蛍光色素の吸収による加熱は、焦点領域に高度に局在化しています。したがって、関心領域では、温度が十分に高い値(≥30°C)まで上昇し、1.5未満のパーセンテージで製造されたアガロース溶液を溶かすことができ、それによって胚を直接レーザーにさらすか、胚が焦点面から浮かぶ条件が可能になります。このため、1.5%未満のアガロース溶液の使用は推奨されません。
    2. アガロース溶液を新鮮な1.5 mL遠心チューブに分注(~1 mL)して保存します。余分なアガロース溶液を液体の形でヒートブロック(60〜70°C)に2〜3週間保存します。
  3. 胚のマウント
    1. オープンバスチャンバーを設置するには、オープンバスチャンバーのベースに少量の高真空グリースを置きます。円形のガラスカバースリップをベースに置き、開いたバスチャンバーの上部をベースにねじ込みます(図1A、B)。
    2. 2%アガロース溶液(60-70°C)をピペット(~500-700 μL)して、塩基が~3/4満たされるまでオープンバスチャンバーに入れます(図1C)。アガロース溶液がラボベンチのオープンバスチャンバーに入ると、溶液の温度は約1°C/s低下することに注意してください。
    3. 30秒待って、完全に重合せずにアガロースをわずかに冷まし(~30-40°C)、続いて単一の胚を塩基の中心に移します(図1D、E)。
    4. 蛍光実体顕微鏡下で、1〜10μLのマイクロピペットチップを使用して胚を配置し、胚がアガロースの底近くに配置されていることを確認します。胚がアガロースの表面に近すぎると胚が浮遊する可能性があるためです
      注:提示されたビデオ(ビデオ1〜3)では、胚は横向きですが、関心のある領域に応じて、胚は腹側または背側に向けることができます。
    5. アガロースが固まるまで胚をモニターし、再配置します。アガロースが固まったら、トランスファーピペットを使用して、組み立てたオープンチャンバー全体にタイムラプス胚培地を充填します( 図 1F)。
    6. オープンバスチャンバーをクイック交換プラットフォームに配置し、ステージアダプター(図1G)に適合します。セットアップ全体(胚、オープンバスチャンバー、クイック交換プラットフォーム、ステージアダプター)を、コンデンサーのすぐ上の顕微鏡のステージに置きます(図1H)。

3. タイムラプスイメージングのための顕微鏡のセットアップ

  1. レーザー設定の決定
    1. 使用するレーザー波長の決定。目的の蛍光色素の励起波長の2倍の波長を使用します(例:GFPの場合は880〜940 nmの波長)
      注:本研究では、GFPの波長設定は880〜940nmでした。波長が高ければ高いほど、レーザーの出力は低くなります。
    2. レーザー透過率を決定します。レーザー透過率が高いと胚が死滅し、最低レベルの透過率を使用します(推奨)。24〜48時間のタイムラプス研究では、本明細書に示されているように、透過率を5%未満に保ちます。
    3. 顕微鏡検出システムを決定し、蛍光色素に適したフィルターが所定の位置にあることを確認します。
      注:多光子顕微鏡の場合、放出された蛍光に対してさまざまな感度を持つ複数の検出システムがあります。一般に、内部検出システムは外部検出システムよりも感度が低くなります。GFP発現量が高いトランスジェニック株には、内部検出システムが適切です。GFP発現のレベルが低いトランスジェニック株や他の蛍光色素(赤色蛍光タンパク質など)を含むトランスジェニック株の場合、レーザー透過率を妥当なレベルに維持するために、外部検出システムが必要になる場合があります。使用する検出システムに関係なく、蛍光色素に適したフィルターを装着する必要があります。
  2. 多光子顕微鏡のソフトウェア設定の調整
    1. 5X対物レンズを使用して、胚を見つけます。手動でステージを最も高い位置に上げ、ファインフォーカスを使用して胚を顕微鏡範囲の中央に配置します。
    2. 手動でステージを下げ、5倍対物レンズを25倍水浸対物レンズ(開口数NA、0.95)に変更します。胚の焦点を戻すために、ステージを慎重に上げます。
    3. ソフトウェアで、「xyzt」モードをクリックして、「z」の深さにわたってx-y平面の時間間隔(t)で複数の画像を取得します。落射蛍光または明視野ビューを使用して、Zスタックを区切る対象領域の焦点深度を見つけます。
      1. ソフトウェアで「開始」ボタンをクリックすると、これらの実験では、目の横方向のエッジがZスタックの始まりでした。「終了」ボタンをクリックします。胚の正中線はZスタックの終わりでした.
        注:ステップサイズは0.3〜0.6μmで、zスタックサイズが60〜120μmの場合、合計~200ステップでした。
    4. 取得時間とイメージング周波数を調整するためのメニューをクリックします。現在のシステムでは、~200ステップでZスタックの集録ごとに約5分かかります。蛍光色素の適切な回収と胚の生存のためには、zスタック取得(レーザーパワーオン)と回復時間(レーザーパワーオフ)の間に少なくとも1:3の比率を考慮してください。
      注:たとえば、zスタックは20分ごとに取得され、zスタックの取得は5分、回復は15分です。このプロトコルでは、より大きなzスタックを取得できますが、zスタックの取得間隔が適切に長くなり、タイムラプスコースでの画像が少なくなります。
      1. 胚の回復に適切な時間で、指定されたウィンドウでzスタック間の時間を設定します。適切なウィンドウで実験の合計時間を設定します。
    5. 最終的なソフトウェア、レーザー、および胚の調整。
      1. ライブ画像設定をオンにして、レーザー設定を最終調整します。ソフトウェア内でレーザー透過率(3.1.2を参照)、ゲイン、オフセットスライダーバーを調整して、蛍光画像を最適化します。また、必要に応じて、実験の長さ、胚の予想される成長などに応じて、胚の向きを調整します。実験の期間中、対象領域がフレーム内に留まることを確認します。
      2. 落射蛍光光源は、タイムラプス取得中は不要になるため、オフにします。レーザーセーフティボックス(図1I)でステージを覆います。内部検出システムを使用する場合、レーザーセーフティボックスは背景光から保護するのに十分です。「スタート」を押します。
        注:ただし、より感度の高い外部検出システムでは、レーザーセーフティボックスが十分な背景光を遮断しないため、画像取得の中断を防ぐために追加のカバーが必要になります。

4. タイムラプス取得中

  1. レーザーセーフティボックスのスライドドアを介してタイムラプス取得中に、8〜12時間ごとに(少なくとも1日2回)タイムラプス胚培地をオープンバスチャンバーに補充します（ 図1I)。
  2. レーザーセーフティボックスのドアを開ける前に、顕微鏡がアクティブに画像を取得していないことを確認してください
    注:ヒーターと循環メディアシステムの使用は、24〜48時間続くタイムラプスイメージング実験には必要ありません。実際、ステージヒーターとインラインヒーターの両方の温度を制御することは困難であり、画像取得中、胚は25〜28°Cの温度範囲で適切な発達速度を示します。さらに、循環メディアシステムはオーバーフローし、機器に損傷を与える可能性があります。したがって、すべての胚は取得後に定期的にステージングされます。

5. 取得後の処理

  1. ソフトウェアで、「ファイル」メニューをクリックし、「保存」を選択します。
  2. 画像処理ソフトウェアでファイルを開きます(資料の表を参照)。正しい画像シリーズを強調表示します。ソフトウェアで、「プロセス」メニューを選択します。3D Deconvolutionをクリックし、「Apply」をクリックして各zスタックをデコンボリューションします
    注 : ファイルのサイズが大きい。したがって、この手順には数時間かかる場合があります。
  3. ソフトウェアの「プロセス」メニューの下にある「最大投影」をクリックします。「適用」をクリックして最大投影を開始し、zスタックごとに1つの画像を生成します。最大投影された各ファイル(zスタックごとに1つの画像)をtiffとしてエクスポートします。
  4. 個々のtiffファイルをビデオ処理ソフトウェアにインポートします。すべてのtiffファイルを選択し、ビデオエディタにドラッグします。ビデオ内の各画像の長さを 0.1 秒に調整します。ビデオをmovまたはmp4ファイルとしてエクスポートします。

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Results

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多光子蛍光タイムラプス イメージングは、ゼブラフィッシュ行 craniofacial 構造と Tg (sox10:EGFP) と Tg (foxd3:GFP) の眼の前眼部に上昇を与える頭部神経堤細胞の移行パターンを明らかにしたビデオのシリーズを生成されます。例としてsox1012 と 30 の hpf の間肯定的な神経堤細胞は神経管の端から顎顔面領域 (ビデオ 1 図 2) に移行します。前、中脳から細胞移行眼周囲間充織を作成する開発の目に腹側および背側。さらに、これらsox10 -陽性細胞は成人のプロセスを形成します。菱から神経堤細胞は、腹側に移行し、咽頭のアーチを生じさせる。タイムラプス イメージングfoxd3-30 と 60 の間肯定的な神経堤細胞 hpf と眼裂眼杯と表面の外胚葉間にこれらの細胞が移行されたことを示した

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

多光子タイムラプス イメージングが一過性と渡り鳥の細胞集団の生体内で追跡を可能にします。リアルタイムで萌芽期のプロセスを研究するこの強力な技術を使用ことができます、現在の研究では、このメソッドの結果は神経堤細胞の移動と開発の現在の知識を強化します。以前のタイムラプス イメージング研究は、通常、共焦点レーザ走査型顕微鏡を利用します。29,30,31,32ここで、従来の共焦点顕微鏡に比べて多くの利点を持っている多光子技術の使用を紹介します。多光子顕微鏡の基礎より長い赤外線波長の 2 つの光子を使用して蛍光体を刺激することです。その結果より少ない散乱そしてこうして減少の背景、深い組織浸透を有効にする、生体共焦点顕微鏡よりもより効率的な検出と 1 mm を超える画像の深さを達成するあります。これらのプロパティは、光毒性は、繰り返し、頻繁に画像の取得で重要な考慮事項を小さくも...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この仕事は健康の国民の協会 (K08EY022912-01) とビジョン研究コア (P30 EY007003) の国立眼研究所からの助成金によって財政上支えられます。

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者は、トーマス ・ シリングが親切贈与 Tg (sox10:eGFP) 魚とメアリー halloran さん親切贈与 Tg(foxd3:GFP)魚をありがちましょう。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
仕切り付き飼育タンクアクアニアリングZHCT100クロッシングタンクセット(1.0リットル) 蓋とインサート付き透明ポリカーボネート
M205 FA コンビスコープライカマイクロシステムズ CMS GmbH立体蛍光顕微鏡 - FusionOptics and TripleBeam
塩化ナトリウムミリポア (EMD)7760-5KGダブルPEサック。CAS番号7647-14-5、EC番号231-598-3
カリウムミリポア(EMD)1049380500塩化カリウム99.999スープラプール。CAS番号7447-40-7、EC番号231-211-8。
塩化カルシウム二水和物フィッシャーサイエンティフィックC79-500ポリボトル; 500 g. CAS No. 10035-04-8
硫酸マグネシウム (無水)ミリポア (EMD)MX0075-1ポリボトル; 500 g. CAS No. 7487-88-9, EC Number 231-298-2
メチレンブルーミリポア (EMD)284-12ガラス瓶; 25 g. 粉末, 認定生物学的染色
重炭酸ナトリウムミリポア (EMD)SX0320-1ポリボトル 500g、パウダー、GR ACS.CAS番号144-55-8、EC番号205-633-8
N-フェニルチオ尿素シグマP7629-25G>98%。CAS番号103-85-5、EC番号203-151-2
ジメチルスルホキシドシグマD8418-500ML分子生物学グレード。CAS番号67-68-5、EC番号200-664-3
トリカインメタンスルホン酸ウエスタンケミカル株式会社MS222Tricaine-S
低融点アガロースISC BioexpressE-3112-25GeneMate ふるい GQA 低融点アガロース、25 g
オープンバスチャンバーワーナーインスツルメンツRC-40HPハイプロファイル
ガラスカバースリップフィッシャーサイエンティフィック12-545-102サークルカバーガラス 直径25 mm
高真空グリースフィッシャーサイエンティフィック14-635-5C2.0ポンドチューブ。ダウ・コーニング・コーポレーション
1658832
クイック交換プラットフォームワーナー・インスツルメンツQE-135 mm
ステージアダプターワーナー・インスツルメンツSA-20LZ-AL16.5 x 10 cm
TC SP5 MP 多光子顕微鏡ライカ・マイクロシステムズ CMS GmbH
マイ・タイ DeepSee Ti-サファイア レーザースペクトル物理
レーザー セーフティボックスLeica Microsystems CMS GmbH
Leica Application Suite X (LAS X) ソフトウェアLeica Microsystems CMS GmbH
Photoshop CS 6 Version 13.0 x64 SoftwareAdobe
iMovieバージョン10.1.4 ソフトウェアApple
塩化

References

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