このプロトコルでは、電気泳動、ゲル画像を用いた近赤外蛍光に分類された DNA に変化の観察を通じて変更された DNA の DNA ポリメラーゼの合成の特性について説明します。アクリルアミドゲルはサイズに応じて異なる速度で移行短い核酸の分離の高分解能イメージングに使用されます。
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この記事について
サマリー
要約
酵素、堅牢な定量的メソッドがネイティブと組み換え酵素の特性評価のため必要です。DNA ポリメラーゼの DNA 合成は、体外DNA 合成法によるポリアクリルアミドゲル電気泳動が続くと言えます。この試金の目標は、変更された DNA (DNA) と自然な DNA の合成を定量化することです。これらのアプローチは単一のヌクレオチド分解能、酵素オリゴヌクレオチド合成時の個々 のステップの観察とオリゴヌクレオチドを解決する場合に特に便利です。これらのメソッドは、DNA 合成の個々 のステップ、DNA 合成と DNA 結合親和性の誤り率の定常状態速度定数の測定などの生化学的および生物物理学的プロパティの配列の評価に適用されています。使用して、変更されたヌクレオシドの三リン酸塩に限らず、(NTP) は、M-DNA および/または突然変異 DNA のポリメラーゼ、ペアを効果的に評価できる基板 DNA ポリメラーゼの相対的なユーティリティを含むコンポーネントを変更しました。ここでは、我々 は非伝統的なプライマー DNA の分類の近赤外蛍光標識 DNA などの戦略に合わせて行う必要があります変更を含め、自身を分析を詳しく説明します。また、注ぐアクリルアミドゲルの重要な技術的なステップの詳細な実行して、することがあります技術的に挑戦的です。
概要
DNA ポリメラーゼは、正確かつ効率的な DNA 合成を行い、ゲノムの整合性の維持に不可欠な。エラーすることがなく何百もの 1 秒あたりのヌクレオチドを合成する能力も分子生物学とバイオ テクノロジーの DNA ポリメラーゼの不可欠なツールになります。ただし、これらのプロパティも M DNA 基板上へのアプリケーションを制限します。一般的に言えば、自然の DNA ポリメラーゼを合成できない多くの可能性のある貴重な DNA の M 基板可能性が高いため生体内で非標準基板の使用に対する高選択的圧力に。多くのグループが進化の M DNA 合成1,2,3,4、5のことができる突然変異の DNA ポリメラーゼを生成する方法を開発しています。これらの努力は、DNA6,7,8のバイオ テクノロジーの有用性を拡大しています。
M-DNA を合成する DNA ポリメラーゼ....
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プロトコル
1 です。 作業の試金
注: ここで説明した方法を使用しての DNA ポリメラーゼを特徴付ける多くの場合実行の試金の典型的な 2 つのタイプがあります。全体的な合成 (DNA 合成の多くのステップを含む) の質的特徴かどうか、かどうか彼らは定量的個々 のステップに焦点を当てるが異なります。我々 は以下ごとにこれらの必要な手順を説明します
。
注: 材料の組立は比較的複雑で、時間敏感な実験のためなのですべての材料はあらかじめ組み立てられていることをお勧めします。アッセイのすべての重要なコンポーネントのレシピは次のとおりです。コンポーネントの商業サプライヤーは、材料表 に記載されています
- SF バッファー調理法 x 10 (10 x SFB)
注: 私たちの試金には N 末端切り捨てを使用する通常 DNA のポリメラーゼの 好熱菌、Stoffel としてよく知られているはフラグメント (SF) 16 、 17。ここのレシピは、SF 3 , 13 の最寄りのバッファーです。その他のバッファーは、特定の DNA ....
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結果
全体的な活動 (セクション 2.1、図 1で説明) と定常状態速度論 (セクション 2.1、図 2の結論のノートで説明します) の質的評価の成功ポリアクリルアミド ゲルの分析が表示されます。失敗ポリアクリルアミド ゲル分析している (図 3)。
市販のはしごや分子マーカーを使用しないことに注意してください。時折、我々 は分子マーカーを作成するのに知られていたポリメラーゼ基板組み合わせを使用ただし、別の修正されたヌクレオチドの非常に異なる電気泳動移動度, オリゴヌクレオチドの長さが異なる塩基配列構造の比較を不適切なことを注意してくださいすることが重要です。
.......
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ディスカッション
ここでは、DNA ポリメラーゼを介した DNA の合成を特徴付けるアッセイを説明しました。近赤外線標識 DNA プライマーを使用し変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動を使用して、異なるサイズのオリゴヌクレオチドを解決する、我々 は合成の正確な測定を有効にするオリゴヌクレオチドの単一のヌクレオチドの解像度を取得できます。これらのアプローチは、酵素 (セクション 2.1) の全体の活動を計測するかまたは個々 の手順 (手順 2.1 を次に注意) のミカエリス-メンテン型のパラメーターを測定するために使用できます。私たちの研究室は最近使用したこれらの両方以前進化した酵素9の特徴し同様、合理的設計酵素10。
ここで説明した私たちの試金は非放射性 DNA ラベルの使用で従来の方法によって異なります。歴史的に、放射能は、放射性リン ラベル11,18を使用して得ることができる高い感度のた.......
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開示事項
著者が明らかに何もありません。
謝辞
この仕事はだった科学の進歩 (コットレル大学学者賞 #22548) の研究株式会社トライリンク バイオ (ResearchReward グラント #G139) でサポートされています。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| トリスHCl | プロメガ | H5123 | |
| トリスベース | プロメガ | H5131 | |
| MgCl<サブ>2 | フィッシャーサイエンティフィック | BP214-500 | |
| チル化BSA | プロメガ | PR-R3961 | |
| KCl | シグマ | P4504 | |
| ジチオスレイトール(すなわちDTT) | リサーチプロダクツインターナショナル | D11000 | |
| エチレンジアミン四酢酸(すなわちEDTA)(0.5M溶液) | シグマ | 03690-100mL | |
| グリセロール | シグマ | G5516 | |
| ムア | クロス | AC42374-5000 | |
| オレンジG | シグマアルドリッチ | O3756 | |
| モフェノールブルー | フィッシャーサイエンティフィック | 50-701-6973 | |
| dNTPs | フィッシャーサイエンティフィ | FERR0191 | |
| M-dNTP(リボNTP) | フィッシャーサイエンティフィック | 45-001-341(343、345、347) | |
| M-dNTP(その他すべての修飾NTP) | TriLink Biotechnologies | アソート | |
| プライマー1 | IDT DNA / TriLinkBiotechnologies | カスタムシンセシス | IR700色素を使用しており、これはカスタム合成として購入できます。通常、精製されたオリゴヌクレオチドHPLCを購入します。配列は5'-dTAATACGACTCACTATAGGGAG |
| テンプレート1 | IDT DNA / TriLink Biotechnologies | カスタム合成 | です 私たちは通常、精製されたオリゴヌクレオチドHPLCを購入します。シーケンスは5'-dCGCTAGGACGGCATTGGATCAGTCAGTCCCTATAGTGAGTCGTATTA |
| ア | 研究製品国際 | A11405 | 38.67%アクリルアミドと1.33%ビスアクリルアミド |
| トリス/ホウ酸塩/ EDTA(TBE)固体 | 研究製品国際 | T22020 | |
| 素超高純度 | 研究製品国際 | U20200 | |
| ゲルテープ | CBS科学 | GT-72-10 | |
| 大型ホワイトスプリングクランプ ポリプロピレン | CBS Scientific | GPC-0001 | |
| 過硫酸アンモニウム (APS) | フィッシャーサイエンティフィック | BP179 | |
| テトラメチルエチレンジアミン (TEMED) | フィッシャーサイエンティフィ | BP15020 | |
| 0.75 mm スペーサー | CBS サイエンティフィ | SGS-20-0740A | |
| 33x42 ノッチ付きガラスプレートセット | CBS科学的な | SGP33-040A | |
| くさびの版の分離器 | CBSの科学 | WPS-100 | |
| のゲルの電気泳動のための櫛 | CBSの科学的な | SG33-0734 | |
| ゲルの電気泳動の装備 | CBSの科学 | 的なSG-400-33 | |
| の超純水 | 私達はMillipore | ||
| のDNAのポリメラーゼ | からのMilli-Qシステムを使用しますこれらは、公開されたプロトコルを使用して私たちの研究室で準備されています。 |
参考文献
- Ong, J. L., Loakes, D., Jaroslawski, S., Too, K., Holliger, P. Directed evolution of DNA polymerase, RNA polymerase and reverse transcriptase activity in a single polypeptide. J Mol Biol. 361 (3), 537-550 (2006).
- Chen, T., Romesberg, F. E. Directed polymerase evolution.
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再版と許可
