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方法論記事

可視化とアデノ随伴ウイルスと共焦点顕微鏡を用いた脊髄脳スライスにおけるオリゴデンドロ サイト オルガネラのライブ イメージング

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⸱

DOI：

10.3791/56237

⸱

2017年10月23日

 , 
1Division of Anatomy, Institute of Basic Medical Sciences, University of Oslo, 2Department of Microbiology, Oslo University Hospital

この記事について

サマリー

ミエリンオリゴデンドロ サイトは、迅速な活動電位伝搬と神経細胞の生存を促進します。ここで説明した、切片蛍光タンパク質のオリゴデンドロ サイト固有表現のプロトコルです以降のタイムラプス イメージングと脳スライス。さらに、無染色のミエリンを可視化するための簡単な手順が表示されます。

要約

神経細胞は、電気絶縁性およびミエリンオリゴデンドロ サイトの栄養サポートに依存します。オリゴデンドロ サイトの重要性にもかかわらず現在ニューロンを研究に使用する高度なツール部分的にしか撮影されているオリゴデンドロ サイトの研究者。セル型固有のウイルスの伝達による染色は、ライブ オルガネラ動態を研究するための有用なアプローチです。本稿での転写の制御の下で対象となるミトコンドリアの蛍光蛋白質遺伝子を運んでいるアデノ随伴ウイルス (AAV) の伝達によって脊髄脳スライスにおけるオリゴデンドロ サイト ミトコンドリアを可視化するためのプロトコルミエリン塩基性タンパク質のプロモーター。コロナ マウス脳切片切片を作るためのプロトコルが含まれています。[ミトコンドリアのタイムラプス イメージングのための手順に従います。これらのメソッドは、他の細胞器官に転送することができ、特に髄鞘の細胞小器官を調べる場合に役立ちますがあります。最後に、共焦点反射顕微鏡 (コア) による生活のスライスで無染色のミエリンの可視化を容易に利用できる手法について述べる。コアは、余分な機器を必要としないとライブ イメージング中に髄鞘を識別することができます。

概要

脳の白質は神経細胞の軸索が髄鞘、オリゴデンドロ サイトによって形成された特殊な拡張プラズマ膜に包まれたので構成されます。髄鞘が高速かつ信頼性の高い活動電位伝搬と有髄軸索の長期的な生存のため必要と髄鞘の損失は、神経機能障害を引き起こす可能性が。その重要性にもかかわらずオリゴデンドロ サイトのプロパティは、あまり知られてに比べニューロンとアストロ サイト。その結果、オリゴデンドロ サイトを勉強の少ないツールを開発されています。

生きるイメージング細胞小器官のミトコンドリア、endoplasmatic 小胞体 (ER) や小胞構造の異なる時間の経過とともに細胞小器官のダイナミックな変化を研究することができます。伝統的に、リビングのオリゴデンドロ サイトのイメージングをモノカルチャー1,2で行った。単作のオリゴデンドロ サイトはコンパクトなミエリンを表示しないし、切片または急性脳スライスが、局在と細胞内小器官の動きを勉強するときにしたがってより良いオプションをことがあります。細胞小器官と髄鞘蛋白の局在は有髄の軸索と周囲の髄鞘の間の短い距離のために挑戦することができます。したがって、光顕微鏡による免疫染色の手順だけでは、有髄軸索のミエリン鞘の細胞小器官とを区別するため空間分解能を持っていません。これは、細胞型-特異的発現プロモーターによって駆動される細胞小器官をターゲットとした蛍光タンパク質の遺伝子をウイルスの伝達によって解決できます。利点は、オルガネラ局在とダイナミクスの正確な評価を可能にする細胞特異とスパース表現です。トランスジェニック動物は、このような細胞小器官をターゲットとしたセル固有の式3を達成するためにも使用できます。しかし、生産やトランスジェニック動物のメンテナンスは高価です、通常ウイルスの方法によって達成することができますスパース表現を提供していません。

記載されているメソッドはここ (MBP 水戸下流か MBP 水戸 GFP) を視覚化するミエリン塩基性タンパク質プロモーターによって駆動されるミトコンドリアをターゲットとした蛍光蛋白質 (下流または緑色蛍光タンパク質 GFP) とオリゴデンドロ サイトのウイルスの伝達を使用します。脊髄脳スライスにおけるオリゴデンドロ サイト ミトコンドリア。さらに、別の蛍光蛋白質 (GFP 水戸した dsred と併用または水戸 GFP を使用 tdtomato) 細胞質内の式は、髄鞘の細胞コンパートメントを含む細胞形態の可視化を有効にするためです。プロトコルには、脊髄の脳のスライス (・ デ ・ シモーニとゆう、2006年4,5で記述されたプロトコルの修正されたバージョン) を行うための手順が含まれています。我々 はミトコンドリアの動きを研究するためタイムラプス イメージング手順を説明します。この手順は、イメージング メディア、イメージング中に薬やその他の媒体の変更の簡単なアプリケーションを可能にするセットアップの継続的な交流と直立した共焦点顕微鏡を使用します。タイムラプス イメージング手順は、以下のように生活のスライスを維持するためのいくつかの余分な機器と、共焦点顕微鏡で実行できます。プロトコルには、画像を最適化し、毒性を削減するいくつかのヒントも含まれています。

最後に、共焦点反射顕微鏡 (コア) 無染色ミエリンを視覚化するための迅速かつ簡単な方法を説明します。これは、ライブ イメージング中に髄鞘を識別することができます。近年、いくつかのテクニックは、必要な任意の染色することがなくイメージ ミエリンに開発されているが、これらのほとんどは、特定機器と専門知識6,7,8を必要とします。ここで説明する手順ミエリン鞘の反射のプロパティを使用して、分光共焦点の顕微鏡検査の簡略化された単一励起波長バージョン (スコアは、いくつかのレーザーの波長はミエリンを視覚化する結合されます)9. コアは、488 nm レーザーと 470 500 nm バンドパス排出フィルターまたは可変発光フィルター、共焦点顕微鏡で行うことができます。

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プロトコル

ここで説明する手順は、ノルウェーの動物研究の権威によって承認されています。サプライヤーおよび消耗品等のカタログ番号必要な機器が、ドキュメントの最後に材料のリストで利用できる

。

1。 切片スライス準備

注: このレシピ使用 2 つのマウスの子犬生後 7-9 (p7-9)、2 つの六つの文化料理に分かれて 24 切片スライスをもたらす。無菌フードで特に記述がない限り、すべての手順を行う必要があり、nitril またはラテックスの手袋を使用する必要があります。細胞培養グレードの材料のみを使用する必要があります

。
  1. オートクレーブ ボトル、解剖ツール (1 鉗子、1 の小さな丸いと尖ったスパチュラ 1 大きい平らなヘラ 1 小さなはさみ 1 大規模なシザーは、マテリアルを参照してください詳細についてはリスト)、ガラス ピペット、ピペット チップ、スライスの準備のために使用される組織綿
    2. 。
  2. ガラス ピペットの半分は、大きな開口部を使用する必要があります、狭い端を断つ。
    1. ダイヤモンド スクライバーとスコアはピペット ガラスが縮小を開始ポイントのすぐ下周り (ある場合) をペンします。ニトリル手袋にまたは類似した、ピペットの先のとがった端を置きます。慎重に作業台を押しながらピペットを曲げることによって先端を断つ
      2. 。
    2. 、砂紙の上をこすることによって切断端を鈍らせるか、ブンゼン バーナーで少し溶けます。壊れたピペットはゴム球になって壊れた端カット脳スライスを転送に使用される、大規模なオープン エンド ソリューション/スライスに触れて
      。 注: これは無菌フードでは行われませんし、数日を事前に行うことができます
      3. 。
  3. 培養皿を準備します
    。 メモ: スライスする前にまたはスライスする前に少なくとも 2 時間の日をこれすることができます。
    1. 滅菌ポリテトラフルオロ エチレン (PTFE) 膜 (" 紙吹雪 ")。2 滅菌鉗子を使用して周囲の青いプラスチックの部分から単一の紙吹雪を削除し、96% のエタノール (エタノール) を含むペトリ皿に 2 回浸漬による消毒します。乾燥滅菌大型ペトリ皿でフラット紙吹雪を置く
      。 注: 紙吹雪は、親水性 PTFE 膜文化挿入で膜のようです。シングル スライスすることができます簡単には転送挿入から顕微鏡のセットアップに鉗子で紙吹雪を持ち上げることによって、ライブ イメージング エイズの紙吹雪の使用 (4.8 を参照してください。 詳細については)。また、脳スライスは (あるスライスは直接に添付文化挿入の膜) 紙吹雪なし培養することができます。この場合、膜挿入顕微鏡お風呂にスライスを転送するメスで切ることです
      2. 。
    2. 培養液 1 mL を追加 (試薬のレシピ ' テーブル) 6 ウェル培養皿の各井戸
      3. 。
    3. の場所の 1 つの文化は、滅菌の鉗子を使用して各ウェルに挿入します。挿入と培養液中の気泡を避けるためします
      。 注: お金と環境を節約だ文化挿入を再利用することが可能。これは蒸留 H 2 O (dH 2 O) の徹底した洗浄によって行うことができます 70% で再使用まで 24 h 以上のエタノール。新しい文化を準備するとき乾燥 uv (紫外線) 光 15-30 分の下での細胞培養プレートの挿入
    4. 文化の両側の 2 つ (滅菌・乾燥) 紙吹雪を挿入します。最小限のオーバー ラップを取得するインサートのエッジに向かって紙吹雪を配置します
      5. 。
    5. 5% CO 2 と 37 ° C で細胞文化のインキュベーターでプレートを配置します
      6. 。
  4. バブル冷たい解剖中 (試薬のレシピ ' テーブル) bioxide ガス (95% O 2/5%CO 2)。ソリューションを無菌に保つために、ボンベからのチューブを滅菌注射器フィルター (0.22 μ m 孔サイズ) に接続します。 生殖不能の管に
    1. 注射器のもう一方の端のカップル フィルター滅菌ガラス ピペットに接続。ガラス ピペットをソリューションに配置、パラフィルムでカバー、ガスをつけます。氷の郭清培地を保つ
  5. 郭清/スライス領域の準備します
    。 注: 理想的には、この手順にされるべき無菌フード。これが可能でない場合、vibratome は作業台に残すことが。この場合、髪のネット、顔のマスクを使用することをお勧めします。
    1. シングル エッジかみそりの刃を使用して agarose のゲルの長方形の部分 (約 2 cm × 0.5 cm) をカット (試薬のレシピ ' テーブル)、長い面を vibratome 刃など vibratome の舞台にこれを接着と
      2. 。
    2. をすべてのサーフェスおよび 70% EtOH vibratome パーツ、オートクレーブ組織ワイプで拭いてきれい
      。 注: 江藤は、細胞を損傷することができますので、脳組織の接触するすべての部分を完全に乾燥重要だ
      3. 。
    3. 滅菌かみそりの刃を付ける、vibratome と、vibratome にこの機能がある場合の振動チェックを実行します
      4. 。
    4. オートクレーブ組織と共にボンネットの場所オートクレーブ解剖ツール ワイプ、4 つの小さなペトリ皿、丸刃メス、ゴムの電球、2 つ開口ガラス ピペット (pt. 1.1 を参照) との 2 のガラス ピペットとスーパー接着剤 (エタノールを散布).
      5. Vibratome ボートと 4 つの小さなペトリ皿に、
    5. 注ぐバブル解剖中です
      。 注: この手順のみすべき解剖前にすぐにこの時点から媒体のバブルまたは氷で保管されていないので
  6. Dissect とマウント脳
    。 メモ: 健全なスライスを取得するには、迅速かつ正確にこの手順を実行する必要があります。いくつかの練習が必要です。
    1. 地域のガイドラインによると首の脱臼により動物 #1 を安楽死させるし、大ばさみを首をはねる
      2. 。
    2. 使用して小さな鋭いはさみ、すぐに鼻に首から矢状切開することによって皮膚を削除し、脇を引く頭蓋骨を明らかにします。
      1. インテリアの一部、頭骨とラムダ縫合線 (大脳と小脳の間の境界線) の上に横切開に続いて、矢状縫合に沿ってカットします
        2. 。
      2. はそれぞれの側に曲げて開きに鉗子を頭蓋骨を使用します。脳神経は脳から脳の腹側下の丸みを帯びた、鋭いへらを挿入し、ゆっくりヘラを横移動で遮断されています
        3. 。
    3. シングル エッジかみそりの刃を使用して小脳に吻側カット コロナ
      。 注: このカット、スライスのカットの角度を決定します。それはしたがって、ストレートの角度ですべきである、です
      4. 。
    4. 郭清媒体を含んでいる小さいペトリ皿に頭蓋骨から脳をフリップします
      5. 。
    5. 繰り返し手順 1.6.1-1.6.4。 動物 #2 および場所のこの 2 番目のペトリネット脳料理。
      。 注: 動物は無菌ではないです。フードの片側に解剖を行い、脳が頭蓋骨から削除されているしたら、他のきれいな側に移動します
      6. 。
    6. 手袋を変更します
      7. 。
    7. アタッチ脳 vibratome 舞台: マウントされた agarose のゲルの正面ステージにスーパー接着剤の薄層を追加します。大きな平らなヘラで新鮮なカットで (尾) 脳 #1 側を保持するヘラと腹側に触れる (と中に可能な限り近い) agarose のゲル。
      1. 鉗子のセットでヘラを押すことによって接着剤に脳をそっと置きます。脳 #2 に十分なスペースを残すようにしてください
        。 注: それは脳が過剰な接着剤ではなくステージにも接続されていることが重要これは切断を妨げることができるとします
        2. 。
    8. #1 の脳の取り付け後すぐに脳の上に郭清中のいくつかの滴を追加する大きなヘラを使用します。これは脳の潤いを保つが、接着剤硬化し、それが脳の両側にくっつかないようにします
      9. 。
    9. 1.6.7 と 1.6.8 の手順を繰り返します脳 #2.
      10. 。
    10. Vibratome ボートにステージをアタッチします
      11. 。
  7. 230 μ m 厚いコロナのスライスを削減振幅を持つ 1 〜 1.5 ミリメートル、85 Hz の周波数と 0.2 mm の速度/s の約 1.4 mm 吻側と 2.1 mm 前に尾間収集スライス。
    1. 収集スライス後開口ガラス ピペット (第 1.1) を使用して各スライスをカットされています。スライスを郭清媒体を含んでいるペトリ皿に転送します。2 つの半球に分割、2 つの部分にスライスをカットする丸いメスを使用します
      2. 。
  8. すべてのスライスをカットするときは培養皿にスライスを配置します。
    1. (一時間) 培養皿を取り出し、インキュベーター
      2. 。
    2. 開口ガラス ピペットを使用して慎重に紙吹雪のそれぞれに 1 つのスライスを転送します
      。 メモ: スライスは、紙吹雪の真ん中にきっかり置く必要があります。これには、いくつかのスキルが必要です。ただし、いくつかのスライスが完璧ではない場合は、インキュベーターに、できるだけ早くすべてのスライスを得ることは重要であるそれらを移動しようとして時間を費やすより、それらを残すことをお勧めします
      3. 。
    3. ガラス製ピペット (先のとがった端) を使用して優しくスライスに触れることがなく余分なメディアを削除します
      。 メモ: スライス浸るべきでなく液体で孵化中。したがって、余分なメディアは、スライス (媒体の薄膜は、スライスを引き続き) 空気にさらされているように吸気する必要があります。液体に浸漬のままスライスは通常健全なできないか、死ぬ (4 と我々 の観察).
    4. すべての紙吹雪が 1 つのスライスにしたら、インキュベーターに皿を移動します
      5. 。
    5. 手順 1.7.8-1.8.4。 料理 #2.
      6. 。
  9. 培養培地を変更します
    。 注: これは、スライス (1 in vitro DIV1 の日) の翌日を行われるべき、2-3 日おき。
    1. 水バスやインキュベーターで培養液を予熱します
      2. 。
    2. 無菌フードを使用し真空吸引や通常のピペット滅菌チップ各ウェルから培地を吸引します。これは、優しく (約 30 度) で料理をチップ、ピペット チップ文化挿入の端に配置することで
      3. 。
    3. は、(媒体で覆われている挿入の下を維持する十分な媒体だけを残して) 各ウェルから約 800 μ L を削除します。その後、きれいなピペットを使用して、各ウェルに予熱媒体の 800 μ L を追加します。細胞文化のインキュベーターに料理を配置します
      4. 。

2。ウイルス伝達

10 , 11 を前述のように、興味のプラスミド
  1. 購入または通気します
    。 注: このプロトコルの使用を記述する AAV 血清型 2/8 (AAV 2/8) のミトコンドリアを運ぶとして対象とした dsred や GFP ミエリン塩基性タンパク質プロモーター 12 の転写制御の下でレポーターの遺伝子 (AAV2/8 MBP_mito_dsred または AAV2/8 MBP_mito_GFP) オリゴデンドロ サイト ミトコンドリアを視覚化します。AAV 2/8 一般的な CAG プロモーターによって駆動されるレポーター遺伝子として GFP や tdtomato を運ぶ (AAV 2/8 CAG_GFP または AAV 2/8 CAG_tdtomato) オリゴデンドロ サイト細胞質を可視化するために使用します。したがって、AAV2/8 AAV 2/8 CAG_GFP と MBP_mito_dsred の組み合わせを与える赤のミトコンドリアとオリゴデンドロ サイト、緑細胞質 AAV2/8 MBP_mito_GFP と AAV 2/8 の組み合わせに対し CAG_tdtomato 緑ミトコンドリアと赤い細胞質を与えます。構造体で記述されています詳しくは 13 では別の場所
    2. 。
  2. 日 7 体外 (DIV7)、変換、通気とオリゴデンドロ サイト
    。 注意: 通気での作業に関する安全規則に従います。適切な訓練と必要なバイオ セーフティ レベル承認を持っていることを確認します。次のすべての点は、手袋、白衣を使用してクラス II の安全キャビネットで実施されなければなりません。ここでは、AAV のスライスの皮質領域への応用は、これは最高の回復が表示される領域は、説明します。
    1. Dilute 予熱 (37 ° C) で AAV 培。スライス内の単一セルのイメージングを可能にするオリゴデンドロ サイトのまばらな伝達を得るに 2 × 10 9 ゲノム コピー/ml (GC/mL) 中の希釈を推奨します。ただし、異なる抗体を使用してパイロットは特定の実験に適している導入されたオリゴデンドロ サイトの密度を確保するためにされるべき。同じソリューション内混合し、同時にスライスに追加する必要があります 2 つの異なる通気を使用している場合
      2. 。
    2. は、約 1.3 μ L を各スライスの AAV の希釈を追加: ピペット チップの外側が乾燥を確認してください。1.3 μ L をピペット ピペット チップ (約 1 mm の距離) でスライスに触れることがなくできるだけ近くに、野上ピペットを押し AAV を希釈します
      3. 。
    3. は、ピペットからソリューションをゆっくりとプッシュします。ソリューションに触れるスライス、ピペット チップにソリューションを全皮質部領域に広がる皮質の上移動します
      。 注: この手順は、必要以上に長くのためのフードからスライスを保つことを避けるためにできるだけ早く行う必要があります。時これを行う 1 つの皿に、インキュベーターに料理 #2 を開始する前に最初の料理を置きます。いくつかの練習と着実に手を必要とする、組織を損傷せずに AAV の良好な分布を取得する
      4. 。
  3. 文化の時間の間に顕微鏡下で皿を配置することによってタンパク質の発現をチェックことができます直立蛍光顕微鏡の細胞の研究室で使用可能な場合します
    。 注意: 皿ない保管すべきインキュベーター外 2 5 分以上します
    4. 。

3。タイムラプス イメージング

注: 蛍光マーカーの表現のレベルが十分な健康のスライスを見るたびに、イメージングを実行できます (通常 DIV11-14).

  1. バブル イメージング ソリューションを入力し、お風呂を終了することができますと加熱して、顕微鏡、灌流、ヒーターが正しくセットアップされていることを確認します
    。 注: さまざまなソリューションがありますお風呂の部屋。シンプルなバージョンを次に示します。
    1. で - と鈍化注射器針 (~ 45 ° 曲げ) ブル ・ タック/楽しいタックによってバスの側面に接続されているバスのアウトレット
      2. 。
    2. 加熱管ヒーター ユニットのお風呂の入口の注射針を通して、蠕動ポンプを介して継続的にバブル イメージング ・ ソリューションの瓶からチューブが行くことを確認します
      3. 。
    3. は、注射器の針のコンセントに別のチューブを接続します。このチューブは、蠕動性ポンプとボトルのイメージング ソリューション (または廃液ボトル) に戻る行く
      4. 。
  2. バブルのイメージング ソリューション (試薬のレシピ ' テーブル) bioxide ガスと
    。 注: この sta である必要があります。rted 少なくとも 15 分前画像に、と実験を通して継続します
    3. 。
  3. ターン蠕動性ポンプとヒーターと最適な浴温度 (37 ± 0.5 ° C) を取得するバスを介して実行ソリューションです。バス ソリューションに温度の単位に接続されている温度計センサーを浸漬することを確認します
    4. 。
  4. 顕微鏡、蛍光ランプと適切なレーザーをオンにします
    5. 。 サンプルの
  5. セットを適切な光パスです
    。 注: これは顕微鏡のセットアップとプローブによって異なります。共焦点の顕微鏡を使用する方法の一般的な知識が必要ですし、ここでは扱いません
    6. 。
  6. は、適切な倍率と開口数 (エヌ) 水浸対物レンズを使用します。我々 は、40 x 水浸計画アポクロマート対物レンズ (エヌ 1.0) を使用します
    7. 。 時間経過のビデオを約 2-2.5 μ m の光学セクションを達成するために
  7. オープン ピンホール。これはミトコンドリアのタイムラプス中のピント移動の発生を低減します
    8. 。
  8. お風呂に転送切片スライス:
    1. 小さなプラスチック シャーレにイメージング ソリューションまたは培養液中のドロップを追加します
      2. 。
    2. 無菌フードの膜から脊髄スライスの 1 つを転送する使用滅菌鉗子挿入ドロップ。紙吹雪とスライスではなく、鉗子がタッチのみ
      3. 。
    3. 、シャーレに蓋を配置します
      4. 。
    4. インキュベーターにスライスの残りの部分を含む培養皿をすぐに置く
      5. 。
    5. スライス顕微鏡を含むもたらすシャーレ
      6. 。
    6. は、顕微鏡お風呂にスライスを転送中蠕動性ポンプの電源を切ります。まず、鉗子を使用して、(紙吹雪が浮かびます) お風呂の上部にシャーレからスライスで紙吹雪を持ち上げます。紙吹雪の各側に鉗子の 2 つのヒントを置いて、スライスに触れることがなく、紙吹雪をタッチし、お風呂の底に解決する紙吹雪をプッシュします。お風呂の真ん中に紙吹雪をセンターします
      7. 。
    7. スライスに触れることがなく、紙吹雪の上にホールド アンカー (ハープ) を配置する使用鉗子
      。 注: ハープは、浮いている、またはお風呂で漂流からスライスを防ぐために使用される馬蹄形のプラチナ アンカーです。急性スライス (音楽ハープに似ている) 他にハープの 1 つの側面から薄い文字列を実行します。脊髄スライス、ハープがミサデジタルでき、それがスライスに触れることがなく、紙吹雪の上に置くことができますこのような方法で紙吹雪のサイズに合わせています
      8. 。
    8. 蠕動性ポンプの電源を入れます
      9. 。
  9. サンプルまで目標を下げる
    10. 。
  10. セルとイメージする領域を選択します
    。 注: これは細胞毒性を引き起こす可能性があるレーザー光に対する細胞の過剰な露出を避けるため (以下の点のヒントを参照してください)。
    1. 接眼レンズおよび蛍光ランプを使用して正しい表現と健康なオリゴデンドロ サイトを検索します。通常、蛍光タンパク質の強い発現があるオリゴデンドロ サイトは不健康な表示されます。不健康なオリゴデンドロ サイトがメタボールの外観を持つプロセスとミトコンドリア断片化されたが表示されます。健康的なオリゴデンドロ サイトの相馬とプロセス滑らかに表示し、ミトコンドリアは、さまざまな長さを持つ (ただし通常のニューロンとアストロ サイトの 13 , 14 , よりずっと短いです。 15).
    2. ビューのフィールドの真ん中に興味のセルを配置します
      3. 。
    3. 使用の " ライブ " 画面上のセルを識別し、いくつかの主要なプロセスまたは髄鞘、または単一のプロセスが含まれているセルの一部 など 関心のある分野を選択 (ライカ、ツァイス顕微鏡) のソフトウェアの機能やミエリン鞘
      。 注: 可能な限りプロセス/鞘のイメージすることができるするには、比較的レイアウト プロセスを含む領域は x、y 方向のフラットを選択します
      4. 。
    4. 興味の分野でズームイン (通常 0.14 - ピクセル サイズでイメージを作り出す 0.30 μ m) です
      5. 。
    5. 使用の " 地域 " ツール、領域を囲む四角形を描画し、選択した領域だけをスキャンするオプションを選択します。選択した領域のみをスキャンすることによってスキャン時間、およびこうしてレーザ露光が減少します
      。 注: 水平方向の四角形領域をスキャンしたラインが必要な数が短いため垂直領域よりも速くスキャンされます。垂直方向の四角形の領域をスキャンすると、スキャン時間がスキャン フィールドを (自由に回転ツールを使用して) 90 度回転させることで減らすことが
      6. 。
  11. ミトコンドリアの良いビューを得るためのレーザー出力の調整とゲイン
    。 注: は、必要最小限のレーザー パワーを使用します。可能であれば、レーザー出力の増加よりもむしろゲインを上げます。細胞毒性を引き起こすだけでなく高すぎるレーザー パワーはレーザー パワーのさらなる増加を必要と時間をかけて、イメージ オブジェクトをブリーチまたはスキャンの間に得る。必要なレーザー パワーとゲイン式レベルで顕微鏡によって異なります。LSM700 共焦点の顕微鏡イメージした dsred 20-40 μ の力で 555 nm のレーザーを使用してまたは GFP (レーザパワー測定目的の背面の開口部に) をイメージに 20-30 μ で tdtomato、488 nm レーザーが使用されます。ゲインは GFP の 700-800 と 850-980 下流の tdtomato の範囲で通常ライブ イメージング用高に設定されます。高利得のいくつかより多くのバック グラウンド ノイズ デジタル オフセット (offset 値は通常 0 から 15 の間レイアウト) を増やすことによって削除される原因します。我々 の経験で、MBP_mito_dsred よりも優れた信号ノイズに-を与える MBP_mito_GFP を使用しています
    12. 。
  12. 選択スキャン速度です
    。 メモ: 高速スキャン速度を使用して、小さなスキャン領域を描画することによってスキャン時間を最小化 (を参照してくださいポイント 4.10.5 以下)。また、双方向のスキャンを実行することでスキャン時間を保存することが可能です。ただし、これは画質のため推奨されません
    13. 。
  13. セットの頻度と時間経過の記録、キャプチャ画像のオリゴデンドロ サイトでミトコンドリアのイメージングのための 20 分の合計 2 秒ごと など の期間
    。 メモ: 興味の目的の移動によるとに頻度と期間を設定する必要があります。高い頻度はより光をレーザーに標本を公開しますが、高速移動物体も必要なコマ撮り動画 (例えば ミトコンドリアより頻繁とミトコンドリアよりもはるかに高い速度で移動するニューロンの合計持続時間が短いオリゴデンドロ サイト、合計 2 分 16 毎秒が通常に作成されます).
  14. コマ撮り録画を開始します
    。 注: ミトコンドリアはピント移動や録画中にイメージ化された地域からずれた場合があります。振動や動きを抑える調整とお風呂のアウトレットと必要な場合は、ポンプの速度を減らします。通常まだフォーカスの小さな変化が発生します。したがって、イメージング中に画面の継続的な監視が必要、記録中に、フォーカスの微調整と
    15. 。
  15. セルの将来の識別のため全体のセルの z スタックをキャプチャし、プロセス イメージを作成します
    。 注: より良い解像度のピンホールに z スタック 1 風通しの良いユニットをリセットする
    16. 。
  16. オプション: 無染色ミエリンを視覚化します
    。 注: でオリゴデンドロ サイト (細胞質) GFP 増殖型、ミエリン鞘通常識別できます (を参照してください 図 2 A および B) プライマリ プロセスに接続されている細胞質 (細胞質尾根) の直線として。ただし、GFP 表現があまりにも弱いまたは細胞質マーカーが使用されていない場合、ここで説明したように、共焦点反射顕微鏡 (コア) 髄鞘を視覚化することが可能です。
    1. 488 でレーザー励起とソフトウェアの新しい光パスを設定、例えば 同じ波長の周り nm と放出されるキャプチャ光 470 500 nm
      2. 。
    2. 調整レーザ出力と髄鞘が表示されるまでを得る (の例を参照してください < 強いクラス ="xfig"> 図 3)。LSM 510 メタ顕微鏡を使用して、我々 は通常 7 12 μ (目的の背面の開口部で測定) のレーザー出力を使用します
      3. 。
  17. オプション: 免疫染色のスライスの準備。
    1. 免疫染色後イメージの細胞を識別する必要がある場合は、セルの低倍率イメージ (10 倍) をキャプチャし、矢印を描画することによって、イメージ内での位置を示すまたは類似。セルの検出を支援するためにもマニュアル全体のスライスは、セルの位置を示す地図を描画することは勧めします
      2. 。
    2. 修正プログラム スライス 4% パラホルムアルデヒド (PFA) シェーカーの室温で 1 時間
      。 注意: PFA は、有害です。防護服を使用し、換気フードにのみ使用します
      3. 。
    3. 定着剤を 1:10 PBS で希釈し、免疫も 17 を開始するまで 4 ° C のまま
      。 メモ: スライスは、数週間の希釈液で残すこともできます、蛍光が衰退します。免疫組織化学固定の 10 日以内に実行することをお勧めします
      4. 。

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結果

脊髄脳スライス培養され、上記のように導入は、mito_dsred と GFP を表現する皮質のオリゴデンドロ サイトの疎な分布を示した。Olig2 および MBP 抗体で免疫染色式がオリゴデンドロ サイト (図 1) に固有であることを確認しました。

ライブ イメージングのため導入されたオリゴデンドロ サイトは並行 (図 1および図 2 a) を実行しているいくつかのミエリン鞘の彼らの特徴的な形態によって認識されました。導入されたオリゴデンドロ サイトのタイムラプス イメージングを実行すると、プライマリ プロセスとミエリン鞘 (図 2 b-D) 内のミトコンドリアの動きを監視すること...

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ディスカッション

ここで説明した切片の文化を作るためのプロトコルは・ デ ・ シモーニと優 (2006 年)5で記述されたプロトコルの修正版18です。最も重要な変更は、以下に概説されています。Tris バッファーは、ウイルス伝達の間にインキュベーター外スライスの生存率と細胞培地の変更を向上させる文化メディアに追加されます。紙吹雪の殺菌のプロシージャも変更されます。他のプロトコルは、オートクレーブに入れることによって紙吹雪を殺菌しながらお勧めしませんこのカールに紙吹雪のいくつかを引き起こすので。これらの成長のスライスは健康ではないがちとカールの紙吹雪を使用しないでください。私たちプロトコル マウスを使用して、ないラット、および海馬ではなく野の文化へ変更我々 を見つけるは薄くスライス (230 μ m 対 300 μ m) で十分に働きます。生後から作られたマウスおよびラット19文化 10-20 周辺髄鞘形成のピークとしてマウス p7 9 (と、11-14 日の培養)、ミエリンオリゴデンドロ サイトを勉強して最適です...

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開示事項

著者は利益相反を宣言しません。

謝辞

リンダ ヒルデガルト Bergersen とアクセス用 Magnar Bjørås 細胞研究室と装置、プラスミドのウイルス産生 Janelia 分子生物学共有リソース スタッフ、レーザー パワー測定について公園 Vervaeke に感謝しますノルウェーの健康協会、ノルウェーの研究評議会によって資金が供給されたこの作品、顕微鏡装置 Norbrain によって資金を供給されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
アガロース シグマ A9539
BD Microlance 19GBD301500浴室および出口に使用される針
AGA105701
ブランドのピペット電球Sigma-AldrichZ615927ピペット電球
ブンゼンバーナー(液体プロパンバーナー)VWR89038-530
ヒーターコントローラー用ケーブルアセンブリワーナーインスツルメンツ〒64-0106 温度調節器 - 温度計部品
CaCl2Fluka21100
CO2 AGA100309CO2 インキュベーター用
カバーガラス、正方形 コーニングサーモ Fischer Scientific13206778ライブイメージング用の浴槽下に取り付けます。接着剤またはワセリンゼリーで密封します。
D-(+)-グルコースシグマG7021
デリケートな鉗子ファインサイエンス11063-07解剖用
ダイヤモンドスクライバーペンテッド・ペラ社54463
使い捨てガラス パスツールピペット 230 mmVWR612-1702ガラスピペット
両刃ステンレス鋼 カミソリ刃電子顕微鏡科学#7200ビブラトーム用カミソリ刃
アールズバランス塩溶液 (EBSS)Gibco-Invitrogen24010-043
濾紙サークルシュライヒャー &Schuell300,220PFAのろ過に使用される濾紙
ファンタックロックタイト1270884バスのインとアウトレットの位置を接続/調整するために使用
ハンドタオル Cフォールド 2カトリン344388
ハープ、RC-41チャンバー用フラットワーナーインスツルメンツ 64-1418お風呂で紙吹雪を押さえるハープ。オルガノタイプスライスで使用する前に、ひもを切り取ります。1.5 mm、13mm、SHD-41/15
HEPES、FW:260.3SigmaH-7006
Holten LaminAir、モデル1.2Heto-Holten96004000M層流フード
血清、熱不活性化Gibco-Invitrogen26050-088
KClSigmaP9541
LCRメンブレン、PTFE、 ミリポアFHLC0130コンフェッティ 
ライカ VT1200ライカ14048142065ビブラトーム
MEM-グルタマックス with HEPESサーモ Fischer Scientific42360024
MgCl2R.P. Normapur25 108.295
マイクロスプーン Heyman Type B電子顕微鏡 Sciences62411-B解剖用の先端が鋭利な小型の丸みを帯びたスパチュラ
Millex-GPフィルターユニットMilliporeSLGPM33RAシリンジフィルターユニット
ミリセル細胞培養インサート、30 mmミリポアPICM03050細胞培養インサート
Minipuls 3 速度制御モジュールGILSONF155001ライブイメージング用蠕動ポンプ - 制御モジュール部 (2 カネルヘッドに接続)
Na2HPO4Sigma-AldrichS7907
NaClSigma-AldrichS9888
NaH2PO4Sigma-AldrichS8282
NaHCO3Fluka71628
Nunclon Delta SurfaceThermo フィッシャーサイエンティフィ140675培養プレート
ナイスタチン懸濁液Sigma-AldrichN1638
Objective W "Plan-Apochromat" 40x/1.0 DIC ツァイス441452-9900-000 ライブイメージングに使用される水浸対物レンズ。(WD=2.5mm)、VIS-IR
ParafilmVWR291-1211
パラホルムアルデヒド、粒状電子顕微鏡 Sciences#19208
PC-R 灌流チャンバーSiSkiYou 15280000E
ペニシリン-ストレプトマイシン、液体Invitrogen15070-063
シャーレ 140 mm ヘーガー1075大型シャーレ 
シャーレ 92x16 mm ザルシュテット 82.1473ミディアムシャーレ 
ペトリディッシュ 55x14,2 mmVWR391-0868小型ペトリ皿
リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)シグマP4417PBS 錠剤
R2 2 チャネル ヘッド ギルソンF117800ライブイメージング用蠕動ポンプ - 2チャンネルヘッド部(制御モジュールが必要)
ラウンド/フラットスパチュラス、ステンレススチールVWR82027-528解剖用大型スパチュラ
サンドペーパーVWRMMMA63119オプションで、割れたガラスのピペットを滑らかにするための
さみ,  17,5 cmファインサイエンス14130-17解剖用大型はさみ
はさみ、8,5 ファインサイエンス14084-08小さくて鋭いはさみ for  解剖
シングルエッジ、宝石ブレード電子顕微鏡科学#71972シングルエッジカミソリブレード
シングルインライン溶液ヒーター SH-27Bワーナーインスツルメンツ64-0102温度コントローラー - ヒーター部
Steritop-GP フィルターユニット、500 ml、45mmミリポアSCGPT05RE滅菌するフィルターソリューション
:瞬間接着剤、精密、ロックタイト、1577386
外科用メスブレード、No.22Swann Morton Ltd.209丸みを帯びたメスの刃
温度調節器 TC324Bワーナー・インスツルメンツ64-0100ライブイメージング用温度調節器(溶液ヒーターとケーブルアセンブリが必要)
Trizma baseSigma T1503
Trizma HClシグマT3253
ウォータージャケットインキュベーターシリーズIIフォーマサイエンティフィック78653-2882インキュベーター
二酸化ガスAGAの、馬ック は、

参考文献

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可視化とアデノ随伴ウイルスと共焦点顕微鏡を用いた脊髄脳スライスにおけるオリゴデンドロ サイト オルガネラのライブ イメージング
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