方法論記事

リアルタイム細胞解析搭載アレイの金電極の再生

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DOI：

10.3791/56250

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2018年3月12日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Public Health, Nanjing Medical University, 2School of Pharmacy, Nanjing Medical University, 3State Key Laboratory of Materials-Oriented Chemical Engineering, College of Chemistry and Chemical Engineering, Nanjing Tech University, 4Department of Medical Oncology, Jiangsu Cancer Hospital, Jiangsu Institute of Cancer Research, The Affiliated Cancer Hospital of Nanjing Medical University

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

このプロトコルでは、商業配列金電極高ランニング コストの ofmicrochip ベースのアッセイの節約を目的とした無料のラベル セル アナライザーの装備を再生成する一般的な方法について説明します。再生のプロセスには、トリプシンの消化力、マイクロ チップの繰り返し使用を可能にする回転ステップと水、エタノールで洗浄が含まれています。

要約

ラベル無料セルベースのアッセイは、それのための生化学的研究は、実験動物の使用を必要としないために有利です。古典的な生化学的アッセイより細胞生理学的な条件の下でより動的な情報を提供するその能力により電気インピー ダンスの原理に基づくこのラベル無料リアルタイム細胞アッセイは過去の中にますます注目を集めてください。10 年間。しかし、その実用測定、細胞形態の高価な消耗品使い捨て金マイクロ チップを使用する比較的高価なコストのために制限があります。このプロトコルでは商用ラベル無料電池アナライザーを搭載したアレイの金電極を再生成する一般的な方法を開発しました。再生のプロセスには、トリプシンの消化力、回転ステップと水、エタノールで洗浄が含まれています。提案法テストされており、少なくとも 3 回の再生と商業の電子板の繰り返し使用に有効であることが示さ保存研究者はリアルタイムの細胞の試金の高いランニング コストを助けます。

概要

無料のラベル セル ・ ベースのテクノロジーがプロテオミクス1,2 のスクリーニングと同様、分析目的などの面での過去 10 年間の急速な成長を目撃しているおかげで、効率的ななりの手間のかかる実験プロセス、薬の配達3、等4,5に比べて、細胞解析、ジェーバーと同僚が以前開発したプロトタイプ6 ラベル無料リアルタイム細胞アッセイを目指した従来の生化学的方法は定量的な方法で細胞の成長や移行の連続測定を可能にするセル接続されたマイクロ チップの表面に電気信号の変更の記録の原則に基づきます。この戦略は、次のリアルタイム細胞センシング (RT CES) を用いた電気インピー ダンスを用いた検出原理が導入された7、8最近商業リアルタイム細胞解析 (RTCA) 電子が発売研究室の研究の9を実行します。

商業リアルタイム細胞アナライザーは主に培養細胞の細胞増殖、移行、生存率、形態、および付着を含む生理学的な変更に起因する細胞の誘発電気インピー ダンスの信号を読み取り、マイクロ チップ10,11の表面。このような電気信号は細胞の状態を評価するためにセル インデックス (CI) をという名前の無次元パラメーターにアナライザーによってさらに変換されます。マイクロ チップのインピー ダンスの変化は主に電極/溶液界面で覆われた細胞のローカル イオン環境を反映します。したがって、細胞分析装置の分析性能はコア センシング ユニット、アレイの金電極から成っている使い捨て可能なマイクロ (すなわち、いわゆる電子プレート、例えば96/16/8 ウェル) に大きく依存しています。パターニング培養ウェルの底に印刷されます。金電極ライン サークル形式 (図 1) で組み立てるし、添付のセル3,12,13 のダイナミック ・高感度の検出を可能にする培養の井戸の表面の面積のほとんどをカバー ,14。CI、チップ上のセルの表面被覆率詳細場合と増減細胞がアポトーシスで生じる毒性物質にさらされる。細胞毒性11神経毒性の15を決定し古典的なエンドポイント法より多くの運動情報を提供リアルタイム細胞解析を頻繁に使用されている、使い捨て可能な電子版は、コストのかかる消耗品。

今までは、ずっとないピラニア ソリューションまたは酢酸などの過酷な再生条件が関与する16,17,という事実のためにおそらくは電子の板の再生に使用可能なメソッド18金のマイクロ チップの電気の状態を変更するかもしれない。したがって、ゴールド チップの表面から他の物質と付着性のセルを削除する軽度かつ効率的な方法は電子板再生過程のことが望まれます。再生成されたチップは光と同様、電気化学的方法19特徴づけられたし、最近非腐食性試薬を用いる使い捨て可能な電子版の再生を目的としたプロトコルを開発しました。トリプシンとエタノールを含む容易に利用され適度な実験用試薬を使用することにより、正常に 2 つの主なタイプを再生成に適用する、副作用のない商業電子板を再生成する一般的な方法を確立した電子板の RTCA 用 (16 および L8)。

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プロトコル

一般に、再生過程にはメモ: トリプシンの消化力とエタノールと水で洗浄のステップが含まれています。消化時間を使用すると、セルの数によると変更し、種類と使用される電池の数は実験の目的によって異なる場合があります。再生条件を最適化する光・電気化学方法を使用して再生成されたチップを確認するをお勧めします。実験では、水溶性と不溶性物質が関与することが、再生手続の典型的な 2 症例の詳細ここで。

1. 再生溶液の調製

注: 準備し、無菌条件の下ですべてのソリューションを処理します。

  1. 新鮮な (g/v) の 0.25% トリプシン溶液を準備します。トリプシンを購入または新鮮な次のようにすることができます。
    1. PH 7.4 リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) の 100 mL のトリプシンの 0.25 g を溶解します。
    2. トリプシンは世話を任意の気泡を避けるために低速でソリューション 4 oC. 攪拌溶解完全にするまでは、ソリューションをかき混ぜます。
    3. バイオ セーフティ フード内 0.22 μ m のフィルターにソリューションをフィルター処理します。
  2. 無水エタノールを使用して 75% エタノールを準備します。容積測定フラスコに 75 mL の無水エタノールを注ぐし、ボリューム 100 mL に達するまで、脱イオン水を追加します。必要な場合は、さらに殺菌を実行します。

2. インキュベーションと電子板で A549 細胞の増殖

注: 電子プレート タイプ 16 および L8 両方成っているアレイの金電極パターニング培養ウェルの底に印刷します。電子板 L8 8 井戸があるとき、電子プレート 16 は 16 の井戸を持っています。電子板 16 の井戸があるラウンド電子板 L8 の井戸は角丸長方形。各電子版 8 のボリュームもは約 830 μ L、各電子板 16 も約 270 μ L。

  1. A549 細胞培養
    1. ロズウェル パーク記念研究所-1640 年培 (RPMI 1640 年) 10% 牛胎児血清 (FBS) と 1% で培養 A549 細胞ペニシリン-ストレプトマイシン細胞培養ディッシュします。
    2. 細胞密度 〜 75% に達したときに細胞を通過し、1 × PBS と付着性細胞層を洗って trypsinize 37 oC. 遠心分離機で 1 分の 0.25% トリプシン溶液によるトリプシンを削除する 5 分間 179 × g でセル。さらに文化の 10 mL の培地で細胞やその他の実験を再懸濁します。
      注: 媒体で再停止されるセルのソリューションは、細胞懸濁液バッファーとしてここに指定されています。
    3. 10 μ L を取り出して診断を使用してセル数をカウントします。さらに実験のための 30,000 80,000/mL の細胞細胞懸濁液バッファーを準備するのにセルバッファー懸濁液を希釈するのに RPMI 1640 媒体を使用します。
  2. 増殖/細胞毒性測定実験とデータ収集
    1. 平衡のフード、バイオ セーフティにおける 30 分間それを残すと電子プレート 16 のもそれぞれのインキュベーションに 50 μ L (150 μ L 電子板 L8) 細胞用培地を追加します。37 oc 以上で CO2インキュベーターでリアルタイム細胞解析に電子板 16 を手動で挿入します。
    2. コンピューター上のリアルタイム細胞解析操作プログラムを起動します。既定実験パターン セットアップ ページ「モデル実験」を選択し実行している分析の名前。
    3. そのレイアウト ページでは、実験に含まれている、エディット ボックスでセル型、数と薬名のような情報を入力して対応する井戸を選択します。そのスケジュール ページで、実験の手順を追加し、各ステップとのリアルタイム データ取得間隔の時間 (例えば、12、24、または 48 h) を選択します。
      注: ここでは、ステップ 1 と 2 の間隔は 1 分、15 分後です。
    4. ファイルを保存し、そのセルのインデックス ページ上のメディアのバック グラウンド インピー ダンスを測定する「スタート」ボタンをクリックしてください結果のデータは自動的に差し引かれます。そのグラフもページにすべてのよくカーブを訪れることができます。そのプロット ページ追加井戸および時間セル指数のグラフを示したが。
    5. 細胞増殖実験プログラムを一時停止する「一時停止」ボタンをまずクリックしてください。その後電子板を取り出して、室温でウェルあたり 100 μ L A549 細胞懸濁液バッファーを追加します。細胞培養ウェルの底に解決するようにバイオ セーフティ フードに 30 分のプレートを残します。
    6. リアルタイム細胞解析駅に電子板を手動で挿入します。実験を続行するには、「スタート」をクリックします。
      注: [印刷] ページで、アナライザー継続的に記録セルのインデックス値または実験全体に曲線。
    7. 実験が完了したら、印刷ページを入力し、実験ファイルを開きます。すべてのテストされたインキュベーション井戸と平均または医薬品の追加やアッセイ間のばらつきを減らすために媒体を変更する前に前回の正規化できる結果のセル インデックス曲線選択します。データ分析ページ EC50 または IC50 を計算できます。

3. 電子板の再生

注: 各洗浄ステップの電子板でソリューションを混ぜた徹底的に (5-10 回) は、ピペットを使用しています。

  1. ケース 1:アンチの細胞毒性評価のための癌治療薬
    1. 第 2 節で記述として電子板に種子 A549 細胞。
    2. 最初細胞培地で抗がん剤ドキソルビシン塩酸塩 (DOX) に分解します。ゆっくりと (DOX の最終濃度は 30 μ g/mL) のセルに DOX を追加ピペットを使用しています。セクション 2 の説明に従って、CI を記録します。
      注: 実験が完了した後すぐに、使用される電子板が再生成されます。このケースでは DOX は可溶性化学プロトコルに従う電子板の再生が比較的扱いやすい、追加の手順は必要ありません。
    3. 再生
      1. リアルタイム細胞解析駅からの細胞を含む電子板を取り出してください。常温無菌バイオ セーフティ フードで使用される電子プレートを置き、徹底的にピペットを使用して培養液をミックスします。すべての媒体をピペットします。
      2. 室温で 3 回 200 μ L の脱イオン水で電子平板をすすいでください。
      3. 1-2 h (200 μ L/ウェル) 37 oc 以上でインキュベーターでの作りたての 0.25% トリプシン電子板で残りのセルをダイジェストします。消化を完了すると、5-10 回常温バイオ セーフティ フード ピペット、ピペット アウトすべてのソリューションを使用して、潜伏ソリューションをミックスします。
      4. それぞれ、次のように、200 μ L エタノールと 200 μ L の水、電子板をリンス: 脱イオン水 2 回、100% エタノールの 2 倍。エタノール 75 %2 回脱イオン水 2 回。滅菌ガーゼまたは室温で残りの水をデカントするティッシュ ペーパーの電子版を反転します。
      5. 紫外線は殺菌常温バイオ セーフティ フードで 1-2 時間再生電子プレートです。
        注: 二重電子板 L8 の再生のためのすべてのソリューションのボリュームです。
  2. ケース 2: ドラッグデリバリー メソポーラス材料を使用しています。
    1. 5.6 の平均孔径ロッド状メソポーラスシリカを使用して以前に報告された20の薬剤配達行列として nm。
      注: ここでは、電子のプレートは、薬物放出に及ぼす細胞を監視する採用されました。
      1. 電子プレートの各ウェルの培養液に材料を追加します。シリカ材料が溶けると電子平板の沈殿物は、次のようにプレートをすすいでください。
    2. ケース 1 のとおり 3.1.3.1-3.1.3.3 の手順を実行します。
    3. 一度常温バイオ セーフティ フードとマイクロ チップ 200 μ L の脱イオン水ですすいでください。
    4. 室温でマイクロ チップ 200 μ L 無水エタノールと 2 回をすすいでください。
    5. 室温で 200 μ L 75% エタノールとマイクロ チップを一度すすいでください。
    6. 各ウェルに 75% のエタノールの 250 μ L を追加し、常温封止フィルム電子プレート シールします。
    7. 2 分間 114 x g でスピン電子のプレートを空にします。滅菌ガーゼまたは室温で残りの水をデカントするティッシュ ペーパーの電子版を反転します。
    8. 3.2.5-3.2.7 の手順をもう一度繰り返します。
    9. 紫外線は殺菌常温バイオ セーフティ フードで 1-2 時間再生電子プレートです。
      注: は、L8 電子版を洗うときにすべてのソリューションのボリュームを倍増します。

4. 再生効果の評価

  1. 再生電子板表面の光学特性
    1. 使用鋼は新鮮なのも孵化の底の部分を慎重に分解するスプーンし、を含む電子板を再生成は、金電極アレイ。プラスチック手袋を着用、慎重に鋼のスプーンを使用して電子版からマイクロ チップを含む部分を拭いてください。
    2. 顕微鏡スライド ガラスの中央に両方のパーツを配置し、21CCD 検出器を搭載したラマン顕微鏡による結果のラマン スペクトルを収集します。
      注: 分光計 633 nm レーザーが装備されていた、30 s レーザー露光時間 500 3500 cm-1の範囲で波長の間隔でスペクトルを記録しました。光の画像は、10 倍目レンズと 50 x 目的使用してラマン顕微鏡で得られました。図 1 a 図 1もインストールされている顕微ラマン装置に得られました。
    3. 新鮮で再生の抗癌性の薬剤吸収後添付の細胞の生存率を評価するには、電子プレート、共焦点を使用してレーザー DOX 分子吸収 A549 の自発蛍光をモニターする顕微鏡です。
      1. セル (新鮮で再生成された電子板 A549 細胞)、使用によって吸収される DOX の自発蛍光を記録するには、63 X オイル客観的かつ 485 nm の励起波長として。
  2. 再生電極の電気化学的挙動
    注: 商業電子板の手動いただいたりは難しく、チェックとして表面の電子状態の評価には適していません、プロトコルの再生効率評価した結果, 通常のゴールド/ガラス状炭素電極 (GCE) テストとしてプラットフォーム、電気化学インピー ダンス分光法 (EIS) が行われました。Au 電極と GCE の両方の直径は 3 mm 電気化学データの 3 電極を用いた電気化学アナライザーによって得られたし、インピー ダンス測定は、10 mV の振幅の交流電流 (AC) 信号を用いて行った、0.01 hz 100 kHz の広い周波数範囲。
    1. 測定前に、アルミナス ラリーの任意の粒子を除去する水で超音波処理に続いて、研磨布の上の鏡のような表面を Au 電極と GCE を磨きます。
    2. だから 0.5 M H2Au 電極をアクティブにする4。説明22として 10 mm KCl 電解質溶液 1 ミリメートル K3[Fe(CN)6] 裸の Au 電極と GCE の EIS データを取得します。
    3. 2.1.2 と 2.1.3 A549 細胞の原液を準備します。Au 電極と GCE の表面に 10 μ L 細胞懸濁液をドロップします。Au 電極と GCE 3 h Au 電極の EIS の取得データのための 37 oC インキュベーター内のセルに変更、GCE 10 mm KCl 電解質溶液 1 ミリメートル K3[Fe(CN)6] セルを使用して変更を孵化させなさい。
    4. プロトコルを使用して、EIS 測定電極を再生成します。
      1. Au 電極を浸し、GCE 変更セルで 0.5-2 の 0.25% トリプシンの h. Au 電極と GCE そっと水ですすぎ 4 回。無水エタノールでそっと電極 4 回をすすいでください。Au 電極を浸すし、GCE 〜 5 分 75% エタノールでリンス 75% エタノールをそっとチップ 4 回。
      2. 1 ミリメートル K3[Fe(CN)6] を含む 10 mM KCl 電解質溶液中の再生の Au 電極・ GCE の EIS データを取得します。

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結果

金マイクロ チップの表面特性: このプロトコルで使用される再生手順図 1で輪郭を描かれました。 図 2を示し、顕微鏡新鮮な写真を表面光学顕微鏡による電子板を再生成します。図 2 aおよび図 2、顕微鏡で観察はあった事実上示されて示すように、マイクロ チップの光学的性質に違いが新鮮な間表面し、電子平板を扱われません。便利なセルの状態の評価のための細胞に含まれるドキソルビシン分子の自発蛍光を使用して、我々 は (図 2 bと図 2 D 再生後ゴールドのマイクロ チップの培養細胞のような均質性を観察).また、培養癌細胞は、チップの再利用性を示す電子板で明確に...

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ディスカッション

我々 は、いくつかの方法17,23,24,25,26 表 1にマイクロ チップを再生のため要約。基本的には、これらのメソッドには、SPR チップに使用される免疫の複合体のような強力な分子分子相互作用の存在のためのチップの完全な再生を達成するために比較的厳しい実験条件が関与しています。しかし、これらの厳しい実験条件は RTCA で使用されるアレイのゴールド チップの表面特性のために非常に有害かもしれません。だから、穏やかな、効率的な方法だった提示再生戦略の開発の主要な考慮事項です。同様に重要な他の要因、環境の懸念されるこれらの使い捨てマイクロ チップは対象となるがん細胞と共によく使用されますので。

このプロトコルでは RTCA ...

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開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

仕事は、国家自然科学基金、中国の (U1703118)、優先度学術プログラム開発の江蘇高等教育機関 (ニュージャージー)、江蘇省 Shuangchuang プログラム、状態キーのオープン ・ ファンドによって資金を供給されたプロジェクトによって支えられました。化学療法・ バイオセンシングとケモメトリックス (2016015) と国立生体高分子研究室 (2017kf05) Jiangsu Specially-Appointed 教授プロジェクト、中国の研究所。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
ラット: Sprague-DawleyCharles RiverCat# 400
マウス アンチラット CD11b モノクローナル (クローン OX42)Bio-RadCat# MCA275Rパンニング: 1:1,000;染色:1:500
ギ多結腸抗Iba1 AbcamCat# AB5076染色: 1:500
ウサギポリクローナル抗Ki67 アブカム Cat# AB15580染色: 1:500
Alexa Fluor Donkey anti-mouse 594InvitrogenCat# 11055染色: 1:500
Alexa Fluor Donkey anti-goat 488InvitrogenCat# A-21203染色: 1:500
Alexa Fluor Donkey anti-Rabbit 647InvitrogenCat# A-31573染色: 1:500
Triton-X (ICC染色の界面活性剤)Thermo FisherCat#28313
パラン硫酸ガレン研究所用品Cat#GAG-HS01
ヘパリンシグマ Cat# M3149
乳固形物からのペプトンSigmaCat# P6838
TGF-β2PeprotechCat#100-35B
マウスIL-34R&D SystemsCat# 5195-ML/CF
Ovine wool cholesterolAvanti Polar LipidsCat# 700000P
コラーゲン IVコーニング Cat# 354233
オレイン酸ケイマンケミカルズ Cat# 90260
11(Z)Eicosadienoic (Gondoic) AcidCayman Chemicals Cat# 20606
Calcein AM dyeInvitrogenCat# C3100MP
Ethidium homodimer-1InvitrogenCat# E1169
DNaseIWorthingtonCat# DPRFS
Percoll PLUSGE HealthcareCat# 17-5445-02
トリプシン シグマCat# T9935
DMEM/F12GibcoCat# 21041-02
ペニシリン/ストレプトマイシンGibcoCat# 15140-122
GlutamineGibcoCat# 25030-081
N-アセチル システイン シグマCat# A9165
インスリンSigmaCat# 16634
アポトランスフェリン SigmaCat# T1147
亜セレン酸ナトリウムSigmaCat# S-5261
DMEM (高グルコース)GibcoCat# 11960-044
Dapi Fluoromount-GSouthern BiotechCat# 0100-20 
ポリ-D-リジン シグマキャット# A-003-E
プリマリアプレート VWRCat# 62406-456<
strong>試薬 <強い>再構成  使用濃度 保存
アポトランスフェリン10 mg/mL in PBS 1:100-20°;C
N-アセチルシステイン5 mg/mL 含有 H2O 1:1,000-20°;C
亜セレン酸ナトリウム2.5 mg/mL 含有 H2O 1:25,000-20°;C
コラーゲンIV200 μPBSのg / mL 1:100-80°;C
TGF-b220 μPBSのg / mL 1:10,000-20°;C
IL-34100 &ミュー;PBSのg / mL 1:1,000-80°;C
ヒツジウールコレステロール1.5 mg/mL 100% エタノール中  1:1,000-20°;C
ヘパラン硫酸1 mg/mL 含有 H2O1:1,000-20°C
オレイン酸/ゴンド酸ゴンドニック:0.001 mg / mL;オレイン酸:100%エタノールに0.1 mg / mL 1:1,000-20°;C
ヘパリン50 mg/mL in PBS 1:100-20°;C
<ストロング>ソリューション レシピ <strong>Comments
Perfusion Buffer50 μDPBS++ (Ca++ および Mg+ +)氷冷した
Douncing Buffer200 μ50 mLのDPBS++氷冷
パニングバッファー2mg / mLのペプトンをDPBS++
DMEM / F12の乳固形物から氷冷パニングバッファー2 mg / mLでパニングバッファー2 mg / mLを使用する場合に使用します。g/mL ストレプトマイシン、2 mM グルタミン、5 μg/mL N-アセチルシステイン、5 μg/mL インスリン、100 μg / mLアポトランスフェリン、および100 ng / mL亜セレン酸冷MGMを使用して、免疫皿からミクログリアをパンします。.
コラーゲンIVコーティングMGMは2 μg/mL コラーゲン IV
ミエリン分離バッファー9 mL Percoll PLUS、1 mL 10x PBS (Ca++ および Mg++, 9 μL 1 M CaCl2, 5 μL 1 M MgCl2を添加した後、よく混ぜてください CaCl2およびMgCl2
TGF-b2/IL-34/コレステロール含有増殖培地％％;MGM含有ヒト2 ng/mL TGF-b2、100 ng/mLマウスIL-34、1.5 μg / mLヒツジウールコレステロール、10 μg/mL ヘパラン硫酸、0.1 μg/ml オレイン酸、および 0.001 μg / mlゴンド酸37°Cに温めた培地にコレステロールを必ず追加してください。C で、1.5 &mu を超えないようにします。g / mLまたは沈殿します。コレステロール含有媒体をろ過しないでください。TIC培地を10%CO2で30分間〜1時間平衡化してから、細胞に添加して最適なpHを確保します。
ヤヘ100ユニット/ mLペニシリンを含むDPBSμ / sup)ナトリウム氷

参考文献

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