キトサンを用いた注射ゲルおよび 3 D 細胞培養への応用の準備

Summary

ここで動的イミン化学を用いたキトサン ベース注射ゲルの作製について述べる。ハイドロゲルの機械的強度と 3 D 細胞培養への応用を調整する方法が掲載されています。

Abstract

プロトコルは、動的イミン化学を用いたキトサン ベースのゲルを準備する安易な効率的、かつ汎用性の高い手法を提案します。終了合成ベンズアルデヒド高分子ゲル化剤とグリコール キトサンの溶液を混合することによって、ハイドロゲルを用意し、ヒドロゲルは室温で数分間で効率的に得られます。グリコール キトサン、高分子ゲル化剤、含水量の様々 な比率によって異なるゲル化時間と剛性の多彩なゲルが得られます。破損して、その外観と係数、crosslinkages として動的なイミン結合の可逆性ヒドロゲルを回復できます。この自己 healable プロパティにより、注入処理後整数一括ハイドロゲルに絞りの部分から自己治癒があるので注射するハイドロゲルです。ヒドロゲルも多動的イミン結合の別の平衡状態のため多くの生物活性の刺激に応答するものです。このハイドロゲルが生体適合性として確認された、L929 マウス線維芽細胞が埋め込まれた次の標準的な手順と細胞の増殖は簡単に 3 D 細胞培養プロセスによって評価されました。ヒドロゲルは細胞のための 3 D 環境の生理学的な模倣は利益を得た別の研究のための調節可能なプラットフォームを提供できます。そのマルチ応答性、自己 healable と注射のプロパティと共に、ヒドロゲルは薬と将来の生物医学アプリケーションのセルに複数のキャリアとして可能性があります適用できます。

Introduction

ヒドロゲルは大量の水と柔らかい物性を架橋高分子材料と彼らは多くの生物医学応用^1,2で使用されています。ゲルは、生体内で細胞の生理学的環境に非常に類似している柔らかく、ぬれた環境を提供できます。したがって、ヒドロゲルは 3 D 細胞培養^3,4の最も人気のある足場になっています。2D ペトリ皿培養に比べると、3 D 細胞培養細胞外マトリックス (ECM) 模倣し、増殖・分化のための⁵のための組み立てる細胞の微小環境を提供する迅速に進んでいます。さらに、天然高分子を含むゲルは、細胞が増殖し、³を区別するための生体適合性と促進環境を提供できます。由来の合成高分子ヒドロゲルは動物由来タンパク質またはウイルスのような複雑な影響を排除する、そのシンプルかつ明確なコンポーネントに適しています。3 D 細胞培養のためのすべてのハイドロゲル候補では、中でゲルが容易に作製し、一貫性のあるプロパティを持つが常に優先されます。異なる研究要件に合わせてハイドロゲルのプロパティを調整する施設は、よく⁶として重要です。

3 D 細胞培養⁷のための汎用性の高いハイドロゲル プラットフォームとなる動的なイミン化学を使用してリコール キトサンによるハイドロゲルの安易な準備をご紹介します。このメソッドでは、よく知られているバイオ セーフティー リコール キトサンを使用ヒドロゲルのネットワークのフレームを確立します。そのアミノ基は、ヒドロゲル⁸crosslinkages として動的なイミン結合を形成する高分子ゲル化剤として終了ベンズアルデヒド ポリエチレングと反応しました。動的なイミン結合を形成し、機械的に調節可能な架橋ネットワーク^9,10,11ヒドロゲルを endowing 周囲に可逆的かつ responsively を分解します。高含水、生体適合材料と調節可能な機械的強度のため、ハイドロゲルが正常に 3 D 細胞培養^12,13L929 細胞の足場として適用されます。ここのプロトコルは、高分子ゲル化剤合成、ハイドロゲルの準備、セルの埋め込み、3 D 細胞培養など、手順を詳しく説明します。

ヒドロゲルはまたその動的なイミンの crosslinkages、その多様々 なバイオ刺激(酸/pH、ビタミン B6 誘導体ピリドキサール、タンパク質パパイン等)への応答を含む、ヒドロゲルへことができることを示すための他のいくつかの機能を示しています⁸生理学的条件下で分解を誘導しました。ヒドロゲルはまた自己 healable と注射、ヒドロゲル最小限の侵襲的な注入法で投与できる薬剤と細胞の配達^14,15では優位します。ヒドロゲルは磁気、温度、pH 応答性など^16,17を満たすことができるような特定のプロパティを獲得する互換性のある機能性添加剤や特定のあらかじめデザインされた高分子ゲル化剤を追加することによって、幅広い研究要件。これらのプロパティでは、注射をするハイドロゲルの潜在的な能力薬の細胞in vitroとin vivoの生物医学研究とアプリケーションの両方で複数のキャリアを明らかにします。

Protocol

警告: 使用前に関連するすべての材料安全データ用紙 (MSDS) を参照してください。ヒューム フードと保護具 (保護メガネ、保護手袋、白衣、等) の使用を含む化学実験を行う際は、適切な安全対策を使用してください。プロトコル標準セル処理テクニック (殺菌、細胞回復、細胞継、細胞凍結、細胞染色、等) が必要です

。

1 準備のヒドロゲル

1. 1. 1. PEG の事前乾燥を ベンズアルデヒドの合成終了・ ディ ・修飾ポリエチレング リコール (PEG DF) のポリマー重量 4.00 g ペグ (4,000 MW、1.00 モル)。丸底フラスコ (250 mL) にそれを転送し、トルエン (100 mL) を追加します
         。 注: 異なる分子量とその他のペグ ハイドロゲル形成のために働くことができますが、異なる剛性につながる
      。
      2. 熱熱銃 (またはホット プレート 40 ° C 付近) によって軽度すべてのポリマーを溶解するためにソリューションです。すべてのポリマーは、溶解後は、蒸発器を使用して、すべての溶剤を削除します。乾燥のペグを高分子にするこのディゾルブとドライ プロセスを 2 回繰り返します
         。 注意: これは発煙のフード細心の注意を実行する必要があります。トルエンは可燃性
      。
   2. PEG のベンズアルデヒド終了反応
      1. フラスコに電磁攪拌機及びテトラヒドロ フラン (THF、100 mL) を追加し、攪拌を使用してペグを解散。すべての固体を完全に解消するソリューション (0.90 g, 6.0 mmol) 4-carboxybenzaldehyde、4-ジメチルアミノピリジン (0.07 g、0.6 モル) を順に追加します
      。
      2. 追加 N, N '-ヒドロキシサクシンイミド (DCC, 1.25 g, 6.0 mmol) ソリューションには満ちているフラスコに無水 CaCl ₂ 乾燥管を追加。室温で攪拌しながら、反応を維持 (~ 20 ° C) 約 12 h. の
   3. 後反応プロセス
      1. 反応が完了したら、真空による溶液生成白色固体をフィルターで除外します。冷たいジエチル エーテル (500 mL) に白色の固形物を沈殿させる攪拌下の溶液を注ぐ。フィルターによりすべての白色固体を収集し、ヒューム フード中の固形物を乾燥します
      。
      2. 再び白色固体を THF に溶解する、任意の不溶性の白色固体を除外、白色固形物を沈殿させる新鮮な冷たいジエチル エーテルに溶液を注ぐ、それを乾燥します。2 ~ 3 回、この手順を繰り返し、真空乾燥オーブン (20 ° C、0.1 mbar) 完全にそれらを乾燥するために白色の固体。最終製品として白い粉を収集: ベンズアルデヒド終了 DF ペグ
      。
2. ハイドロゲルの調製
   1. チューブ (10 mL) で DF ペグ (0.11 g、0.028 ミリ モル 0.22 g、0.055 モル; 0.44 g、0.110 mmol) のさまざまな量の重量を量る脱イオン水 (5.0 mL) を追加して、支援する渦や磁性攪拌器使用 ポリマーを溶解します
   。
   2. リコール キトサン (0.495 g, x 10 ^-3 m モル 6.18) 管内 (50 mL)、脱イオン水 (15.0 mL) を溶解し、キトサン溶液 (3 wt %) を均質化するため、数分間渦を使用します
   。
   3. は、チューブ (2.0 mL) で順次リコール キトサン溶液 (0.2 mL、3 wt %) と DF PEG 溶液 (0.2 mL) を追加します。数分で均一フォーム ヒドロゲルへの解決策を混合するのに渦を使用します。表 1 異なる機械的強度のヒドロゲルの比に従ってください
      。 注: は、すでにヒドロゲルを形成するかどうかを決定するため管反転方法を使用します
   。
3. レオロジー解析
   1. パラレル鋼板回転レオメータのレオロジー解析を実施 (径: 20 mm)。ゲル化テストの下のプレートにリコール キトサン溶液 (0.2 mL、3 wt %) を広がってください。キトサン溶液の表面に均等に滴下 DF PEG 水溶液 (0.2 mL、2 wt %) を追加し、ピペットで手早く混ぜます。低いアッパー プレートをしてテストを開始
   2. ハイドロゲルの ' s 剛性テスト カット ハイドロゲル円 (直径: 20 mm) 貯蔵弾性率を測定し、(G ') 1% ひずみ時の周波数解析に対する値。典型的な G ' 6.3 rad s 値 ^{− 1} 表 1 に示す
      。 注: はヒドロゲルの動的結合の安定化を確保するためハイドロゲル形成後 0.5 h ゲルのレオロジー解析を実施します
   。
   3. ヒドロゲルの ' s の自己 healable 特性テスト、切りにするハイドロゲルおよび整数部分に自動修復する作品が集まります。輪を作ってヒドロゲル部分で切って (径: 20 mm) レオロジー解析を行うレオメータの上に置くと
   。

2 ゲルの 3 d 細胞培養

1. ゲル ゲル溶液の調製
   1. の細胞培養媒体 (RPMI 1640 年 2.0 で追加の重量を量る DF ペグ (0.44 g、0.11 ミリ モル) (4.0 mL)、生殖不能の管に。mL) と高分子溶液 (20 wt %) を取得する高分子を溶解するために渦や撹拌機を使用します。注射器 (10.0 mL) でソリューションを読み込むし、ミクロンの細菌保フィルター (0.22 μ m) を通すことで消毒します
   。
   2. はリコール キトサン (0.165 g, x 10 ^-3 m モル 2.06) 生殖不能の管 (15.0 mL) で重量を量る、細胞培養媒体 (RPMI 1640、4.0 mL)、そしてリコール キトサン溶液 (4.0 wt %) を取得する高分子を溶解するために渦を追加します。注射器 (10.0 mL) でソリューションを読み込むし、0.22 μ m 保細菌フィルターとフィルターします
   。
2. ゲルの細胞培養
   注意: 実行すべてのセルのティッシュ文化フードに関連する手順。生殖不能の技術の基本的な知識が期待されます。 10%
   1. 細胞懸濁液
      1. RPMI 1640 培養 L929 細胞の調製培 FBS、ペトリネットの 5% ペニシリン (10 mL) 皿 (直径 10 cm)、37 ° C、5% CO ₂ で孵化させなさいと。媒体は使用する前に毎日変更します
      。
      2. は、トリプシン (0.025 w/v %) および EDTA を含む PBS で L929 細胞を収穫 (0.01 %w/v)、遠心分離 (70 x g、5 分) と再 RPMI 1640 培地 (1.0 mL) で細胞を中断します。血液カウント ボードの標準操作を使用してセルのカウントを実行します。細胞濃度を調整する細胞を再停止 〜 3.75 × 10 ⁶ セル/mL
      。
   2. ヒドロゲルの電池を封止材
      1. L929 細胞懸濁液 (0.4 mL、10 ⁶ セル mL ^-1 x 3.75) を混ぜて渦による管内 (4.0 mL) リコール キトサン溶液 (0.4 mL)。ピペットの共焦点シャーレの中央に L929/リコール キトサン溶液 (0.8 mL) (直径 2.0 cm)。同じ皿にピペットの DF PEG 溶液 (0.2 mL)、ソリューションをミックス、ハイドロゲル形成を誘導してゆっくりピペットします
         。 注: は、ペトリ皿を傾けることによってハイドロゲル形成を評価します
      。
      2. 直接細胞培養、ゲルの上に RPMI 1640 培養媒体 (1.0 mL) の追加額を追加。インキュベーター (37 ° C、5% CO ₂) に埋め込まれた携帯ハイドロゲル (1.0 mL、1.5 wt % グリコール キトサン、4.0 wt %df ペグ 1.5 × 10 ⁶ セル mL ^-1) を入れ、毎日媒体を変更します。セル封止後日 1、3、5、および 7 にセルイメージ投射のための準備します
      。
   3. 注入後ゲルの後 3 D 細胞培養の準備ロード携帯ハイドロゲル (1.0 mL ステップ 2.2.2 を参照) (10.0 mL、48 G 針) の注射器。ハイドロゲル フォーム後共焦点イメージング用シャーレにヒドロゲルをゆっくりと注入します。ヒドロゲルの上に培地 (1.0 mL) の追加量を追加し、それは毎日変更します。インキュベーター (37 ° C、5% CO ₂) にペトリ皿を置くし、その後にイメージングのための準備します
      。 注意: を確認し、注射器の安全操作プロトコルに従ってください
   。
3. 細胞生存率解析
   1. 共焦点観察
      1. は、2 回の PBS (1.0 mL) でゲルをすすいでください。フルオレセイン ・ ジアセテート (FDA、0.5 mL, 0.05 mg/mL) と propidium (PI、0.5 mL、0.08 mg/mL) はヨウ化ソリューションの 15 分のゲルを染色します。染色後、すべての溶剤を削除します
      。
      2. 観察励起波長 488 の下共焦点顕微鏡を用いたゲル nm のライブを視覚化する nm と死者の 543 細胞、それぞれ。中の細胞の均一な分布を検証するゲルの 2 μ m 深さごとを通して z スタックを取る
         。 注意: FDA の汚れの生きているセル PI 汚れ死んだ細胞中です
      。
   2. チューブ (4.0 mL) に酢酸 (拍、3 v %、1.0 mL) 5 分のピペットでハイドロゲル (1.0 mL) が低下します。遠心分離機 (70 x g、5 分) による細胞を収集し、再 RPMI 1640 培 (1.0 mL) で細胞を中断します。細胞カウント ボードを数える血を使用してを実行します
   。

Results

ゲルの調製とその 3 D 細胞培養上でこのプロトコルの図式は、図 1で提供しています。ハイドロゲルの内容と異なる機械的強さの準備率の情報は表 1のとおりです。ヒドロゲルの自己 healable とレオロジー特性図2 周波数テスト対貯蔵弾性率によるハイドロゲルの剛性をプレゼントします。細胞の共焦点画像とヒドロゲルの文化の日と携帯電話の番号は、図 3、3 D 細胞培養による細胞増殖と細胞生存率を確認するのに提示されます。図 4は、顕微鏡、共焦点イメージ、および注入後文化に苦しんだヒドロゲルに埋め込まれた細胞の細胞増殖率の分析を示します。高細胞生存率、細胞増殖を示し、ハイドロゲルに埋め込まれた細胞破壊の被害を被っていない、ハイドロゲルの injectability を示す後の文化によって回復する可能性が。

Discussion

このプロトコル (図 1) で発表したハイドロゲルは 2 つの主要なコンポーネント: 天然高分子グリコール キトサンおよび合成ベンズアルデヒド終了高分子ゲル化剤 DF ペグ、両方の生体適合性材料であります。DF ペグの合成は、ワンステップ改質反応を使用して提示されます。分子量 4,000 のペグは、溶解度、変更効率、ハイドロゲルの剛性の問題でこのプロトコルに選ばれました。固形物が異なるとグリコール キトサンと DF PEG の比率を使用して一連の機械の強みを持ったゲルを調製しました。ゲル化速度が希薄溶液によって低下するも、分で、常温ゲル化ソリューションを混合することによって、均質なゲルによってすぐに形作られました。レオロジー試験は異なるヒドロゲルの機械的強度を評価するために採用されました。貯蔵弾性率 (G') それらのヒドロゲルの約 900 とは異なることがわかった Pa (ソフト) 2,100 4,700 (中) Pa Pa (硬い) (表 1と図 2 a)。これはより高い貯蔵弾性率...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
グリコールキトサン	和光純薬工業	39280-86-9	90%の脱アセチル化度
4-カルボキシベンズアルデヒド	上海アラジン Bio-Chem Technology Co.、LTD	619-66-9	99%
N、N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド	上海アラジン Bio-Chem Technology Co.、LTD	538-75-0	99%
塩化カルシウム無水上海	アラジン Bio-Chem Technology Co.、LTD	10043-52-4	96%
4-ジメチルアミオプリージン	上海アラジン Bio-Chem Technology Co.、LTD	1122-58	99%
ポリエチレングリコール	Sino-pharm化学試薬	5254-43-7	99%
テトラヒドロフラン	Sino-pharm化学試薬	109-99-9	99%
トルエン	Sino-pharm化学試薬	108-88-3	99%
エチルエーテル	Sino-pharm化学試薬	60-29-7	99%
酢酸	Sino-pharm化学試薬	64-19-7	99%
無水CaCl2	Sino-pharm化学試薬	10043-52-4	99%
フルオレセインジアセテート	Sigma	596-09-8	99%
ヨウ化プロピジウム	Sigma	25535-16-4	94%
RPMI-1640 培地	Gibco
ウシ胎児血清	Gibco
トリプシン-EDTA	Gibco		0.25%
PBS	Solarbio		0.01 M
ペニシリン ストレプトマイシン溶液	Hyclone		10,000 U/mL
レオメーター	TA 機器		AR-G2
共焦点顕微鏡	ツァイス		710-3チャンネル
L929 細胞	ATCC		NCTC クローン 929;L細胞、L929、Lひずみの派生物
バポレーター	EYELA		N-1100
48ゲージ針	ShanghaiZhiyu Medical Material Co., Ltd		48ゲージ
顕微鏡	ライカ		DM3000 B
顕微鏡ソフトウェア	イマリス
ヒートガン	Confu		KF-5843
ペトリ皿	NEST