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方法論記事

生体内で予防接種モデルを用いた抗原特異的 T 細胞細胞傷害性関数の検出のための試金

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DOI:

10.3791/56255

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2017年11月28日

 ,  ,  , 
1Department of Melanoma Medical Oncology, University of Texas MD Anderson Cancer Center, 2Department of Immunology, University of Texas MD Anderson Cancer Center, 3Department of Radiation Oncology, The Second Hospital of Jilin University

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

このプロトコルの目的は、抗原特異的マウスモデルにおける標的細胞の殺害の生体内での検出を実現することです。

要約

抗原特異的殺害のための現在の方法論は生体外での使用に制限されるか伝染病モデルで利用します。しかし、抗原特異的感染せず殺害を測定する対象プロトコルではありませんがあります。このプロトコルは設計されています、特定の抗原の検出のため許可することでこれらの制限を克服する方法について説明します+ T 細胞の生体内でCD8 による標的細胞の殺害します。これは、アッセイを殺す伝統的な CFSE 分類されたターゲットと予防接種モデルのマージで。この組み合わせでは、アッセイは腫瘍の増殖や感染症に依存するないと直接かつ迅速に抗原特異的 CTL の可能性を評価するために研究者をことができます。また、読み出しはフローサイトメトリーに基づいており、ほとんどの研究者によって簡単にアクセスする必要があります。研究の主な制限は、タイムラインは、生体内でテストされる仮説に適切な見つけることです。抗原強度の変動と微分細胞傷害性機能可能性があります T 細胞における突然変異細胞収穫と評価のための最適な時間を決定するため慎重に評価する必要があります。Hgp10025-33の OVA257-264, ペプチド ワクチン接種のための適切な濃度を最適化されていますが、さらに検証が特定の調査により適切な場合があります他のペプチドの必要になります。全体的にみて、このプロトコルにより、体内の機能を殺すの迅速な評価と任意の特定の抗原に適応することができます。

概要

複数のプロトコルは、cd8 陽性の細胞傷害性 (CTL) の可能性を評価するために、+または CD4+ T 細胞。この評価は体外で制御された条件1,2,3の下で容易に行うことができます。さらに、脈絡などの感染症モデルは古典的な差動 CFSE (5-(and 6) Carboxyfluorescein ジアセテート サクシニミジルエステル) 標識ターゲット細胞を使用して CTL 機能を検討してきたところ、CFSEこんにちは-標識細胞がペプチドと CFSEloパルス-パルス成分を含まない細胞が残っているターゲット。セルが 1:1 の比率で注入し、CFSEこんにちはの損失を評価-流れ cytometry4パルス ターゲットをラベル付けします。ワクチンと拒絶反応のモデル生体内で両方 CD8 によって殺害の評価のため同様の戦略を使用しているも+と CD4+ T 細胞も NK 細胞5,6。プライム対象注入前に免疫システム感染エージェントを使用する必要が強力な試金。

このプロトコルは、他の一方で、ホストの先行感染を必要とせず、代わりにプライム対象注入前に免疫システムに予防接種戦略を利用します。このワクチン接種は免疫刺激、カクテルと呼ばれる covax7Toll 様受容体 7 (TLR7) から成るの規定を必要とするペプチド ワクチンの水ベースの製剤から成るアゴニスト (imiquimod クリーム)、アゴニスト抗 CD40抗体およびインターロイキン 2 (IL-2) ペプチドごとのプライミングと強力な免疫反応の免疫刺激剤の相乗組み合わせに 。など、この試金はワクチンが標的細胞の投与前に 3 日間だけ関数の評価のための細胞と一緒に投与は CTL 機能の迅速な読み出しを提供します。さらに、covax プライミング プライミングの抗原特異的 T 細胞の殺害容量を注入後 4 と 24 h の間見ることができる十分に強いです。

このプロトコルの主な制限は、タイムライン、生体内で抗原とテストされる仮説の両方に適している殺害の対象を検出するため見つけることです。慎重に評価を行う必要があります、遺伝的変化と同様に、抗原の強さの変動として T 細胞でテストされている可能性がありますターゲット殺害の異なるタイミング検出が必要となる微分の CTL 機能。また、一方、ペプチド濃度の適切なワクチン接種がヒトメラノーマ抗原ペプチド 100 (hgp10025-33) に最適化されています, 卵白アルブミン257-264 (OVA257-264)8,9 、が特定の調査に適している別の抗原モデルの使用はさらに検証が必要があります。アジュバントとして、covax との組み合わせで CTL エフェクター機能を刺激するためにターゲット抗原の能力の予想される違いは、希望する目標を達成するために不可欠である IL-2 投与濃度、投与頻度の最適化があります。全体的に、このプロトコルは生体内での機能を殺すの迅速な評価を可能し、任意の特定の抗原に適応することができます。

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プロトコル

ここで説明するすべての方法は、制度的動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) テキサス大学 MD アンダーソンがんセンターのによって承認されています。

1. ワクチンのペプチドの作製

  1. リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 30 の渦・適切な濃度と凍結乾燥ペプチドを溶解 s。
    注: hgp10025-33, 最終濃度が 1 mg/mL、OVA257-264, 最終濃度は 0.5 mg/mL です。注入前にペプチドを再構成します。溶解後は格納しないでください。

2. トランスジェニック マウスの脾細胞の分離

注: 脾臓からの細胞分離は、滅菌方法で実行する必要があります。

  1. メソッドを使用して、承認された CO2窒息 OT 1 トランスジェニック マウスを安楽死させるし、脾臓を削除します。
    注: 適切なトランスジェニック マウスは、このステップで選択したペプチドの特定に利用されています。
    1. 右側にマウスを置きます。スプレーの 70% エタノール (エタノール) マウスの左側にあります。鉗子を使用して皮膚をプルアップし、手術用のはさみを使用して皮膚をカット脾臓は、腹腔内に表示されます。優しくカット オープン脾臓にアクセスする腹腔内。鉗子を用いた脾臓を削除します。
  2. (1% ウシ胎児血清 (FBS) を持つ PBS) 中 2 mL をシャーレに 70 μ m フィルターにそれを置き、プランジャーの終わりと脾臓を破り、脾臓の分解および。
    1. ペトリ皿と 50 mL の円錐管の場所から脾細胞を収集します。5 ml 中のすべてのセルを収集するために 2 回のペトリ皿を洗います。25 mL に媒体までを追加し、室温 475 x g で 5 分間細胞を遠心分離します。
  3. 細胞を吸引し、脾臓赤血球 (RBC) 換散バッファー/1 mL に再懸濁します。孵化 5 分間室温で媒質 A の追加 10 mL と 475 x g に室温で遠心する媒質 A の 10 mL にペレットを再懸濁し、きれいな 50 mL の円錐形に 70 μ m のフィルターを通して細胞懸濁液をフィルタ リングによって残骸を取除きます。
  4. トリパン ブルーと診断を使用してセルをカウントします。10 の最終的な集中に PBS で細胞を再懸濁します6 - 1006セル/mL。OVA257-の264特定殺害, 106セル/mL で再懸濁し、hgp100 の25-33特定殺害, 1006セル/mL で再懸濁します。
    1. スピン 475 x g に 5 分間室温で残りのセルは、上清を吸引し、血球を洗浄する 15 mL 冷 PBS に再懸濁します。洗浄手順をもう一度繰り返します。スピン 475 x g に 5 分間室温で細胞培養上清を吸引し、ステップ 2.4 で決定した最終巻によると冷 PBS に再懸濁します。
    2. 単一細胞懸濁液を 1.5 mL 遠心チューブに転送し、受信者の C57/BL6 マウス注入まで氷の上を保ちます。

3. トランスジェニック マウスの脾細胞の注入

  1. 背側の落で受信者の C57/BL6 マウスを上に置きます。70% イソプロピル アルコールをスプレー噴射尾基本領域。27 G 針を用いた傾斜面を上向きの尾静脈に静脈内の単一細胞懸濁液 (セクション 2) 100 μ L を管理します。

4. Covax 管理

注: セルは、午後に注入される場合、covax 投与すべき細胞の注入の 18 h で次の朝。

  1. 1-3% イソフルランとクリア麻酔ボックスにマウスを配置します。マウスは麻酔が完全に後、は、麻酔室でマニホールドに接続されている鼻の円錐形にマウスを転送します。マウスを背側に拘束をしてください。
    注: Anesthetization は、撤退の応答を誘発しないことを確認する簡単なつま先ピンチによって確認されます。連邦法は、認可された獣医の順序イソフルランの使用を制限します。
  2. 70% イソプロピル アルコールをスプレー噴射尾基本領域。(セクション 1) からペプチド溶液 100 μ L を皮下注入 27 G 針を用いた注射器針ベベル面を上に向けて尻尾ベース領域に 4 ~ 5 mm を貫通します。
    注: マウス、10尾の基部皮下注射と 1 つのフランクのワクチンを接種します。
  3. ワクチン注射部位に 100 μ L 抗 CD40 抗体 (0.5 mg/mL 在庫) 横を注入します。
  4. 慎重に予防接種のサイトに imiquimod クリーム 50 mg/マウスを適用します。クリームは表示されなくなりますし、十分に吸収されるまで、imiquimod クリームを表面にこする。
  5. 100,000 IU/mL 以上より 2 蛋白質の 100 μ L を腹腔内注入 (i. p.)、下腹部の領域で。彼らは完全に麻酔から回復後、5 分間マウスを観察します。
    注: 実験が 3 日間この時点で一時停止です。

5. CFSE とラベリングのためのターゲットの脾細胞の分離

注: 脾臓からの細胞分離は、滅菌方法で実行する必要があります。

  1. 承認された CO2窒息法によると c57bl/6 マウスを安楽死させます。2.1.1 の手順と spleen(s) を削除します。脾臓の分解および、脾細胞の手順で 2.2.1 - 2.2.3 を洗ってください。手順 2.3 - 2.3.2 のように赤血球を溶解させます。
  2. 診断をカウントするための細胞を除去し、106セル/mL CFSE 分類ソリューション (手順 7 で説明) でセルの最終的な集中の計算。G. 吸引清 x 475 で 5 分間室温で残りのセルをスピンします。

6. ペプチド パルス ターゲット脾細胞の

注: ペプチド パルスは、滅菌方法で実行する必要があります。

  1. 完全なメディアで 10 の6セル/mL の細胞を再懸濁します (RPMI 1640 メディア 10% と 1% FBS L-グルタミン (L Gln)、1% ペニシリン/ストレプトマイシン (ペン/連鎖球菌))。2 チューブ (15 mL 円錐曲線) に、セルを分割します。パルスまたはパルス成分を含まないとして各チューブ ラベルを付けます。
  2. ラベルの付いた管ペプチド パルスを追加します。OVA257-264パルス、1 μ g/mL を追加し、hgp10025-33パルス、2 μ G/ml を追加します。
    注: パルス成分を含まない細胞ペプチド添加せずただパルスのセルとして同じのインキュベーションを受けます。
    1. セル + 1 h 37 ° C でペプチドを孵化させなさい。
  3. 完全なメディアの 10 mL を追加 (RPMI 1640 メディア 10% と 1% FBS L-グルタミン (L Gln)、1% ペニシリン/ストレプトマイシン (ペン/連鎖球菌)) を洗うように各管に両方パルスとパルス成分を含まない標的細胞。G. 吸引清 x 475 で 5 分間室温で残りのセルをスピンします。

7. CFSE のターゲットの脾細胞の分類のための準備

  1. 6.3; の手順で洗浄セル中に CFSE 分類ソリューションを準備します。パルスのセルは、CFSEloとして CFSEこんにちはと、パルス成分を含まないと名づけられます。10 の6セルの CFSE 分類溶液 1 mL を準備します。
    注: CFSE は、光感受性のすべての回で光から保護する必要があります。
    1. CFSEこんにちは準備-RPMI 1640 メディア 2% で 5 μ M/mL の最終濃度 1 uL/mL CFSE (5 mM 原液) を追加することによってメディアのラベル付け FBS。
    2. CFSEloの準備-最終濃度 2% と 0.5 の μ M/mL RPMI メディア 1640 1 uL/mL CFSE (原液 0.5 mM) を追加することによってメディアのラベル付け FBS。

8. CFSE とターゲットの脾細胞の分類

注: CFSE 分類は、滅菌方法で実行する必要があります。

  1. 106セル/mL CFSE 分類メディア (手順 6.3) からパルスとパルス成分を含まない標的細胞を再懸濁します。準備 CFSEこんにちはとパルスの細胞を再懸濁します-CFSElo準備メディアおよびパルス成分を含まない細胞ラベリング-メディアのラベル付け。
  2. セルと穏やかな反転または旋回 CFSE 分類メディアをミックスします。ボルテックスを混在させないでください。インキュベート細胞と 37 ° C で 15 分間でのメディアの CFSE 分類リミックス セル 5 分ごと。
  3. 475 x g で 5 分間室温で各細胞の懸濁液とスピンの細胞に完全なメディアの 10 mL を追加します。
  4. 上清を吸引し、10 mL の冷 PBS で細胞を再懸濁します。475 x g で 5 分間の 4 ° C でセルをスピンします。
  5. 8.4 手順を繰り返します。
  6. セルとミックス ペプチド パルス CFSEこんにちはカウント-パルス成分を含まない、CFSEloとラベル-受信者マウス注入の 1:1 の比率で細胞を標識します。1 x 106基準フロー フローサイトメトリー評価 (セクション 11) のために使用するセルの混合の因数を維持します。
    注: 注入の最終巻は 100 μ L/マウスです。最後のセル数は 10e6 セルです。注射器と針のボリュームの損失を考慮する必要があります、500 μ L で推定する必要があります。

9. ターゲット細胞の注入

注意: CFSE ラベル セルの前に、できるだけ多くの射出時の光から保護します。

  1. 背側の落で受信者の c57bl/6 マウスを上に置きます。70% イソプロピル アルコールをスプレー噴射尾基本領域。ベベル面を上に尾静脈に静脈内の単一細胞懸濁液 100 μ L を管理します。

10. 標的細胞の再分離

注: このステップのタイミングが重要な CTL 細胞毒性と刺激の抗原の強度に依存しています。OVA257-264のパルス ターゲットを殺すの評価、細胞は注入後収穫 4-6 h をする必要があります。以来、CFSE 分類された細胞は、暗闇の中で光の敏感なプロセスの脾臓です。

  1. 承認された CO2窒息方法に従って受信者 c57bl/6 マウスを安楽死させます。
  2. 2.1.1 の手順と spleen(s) を削除します。脾臓の分解および、脾細胞の手順で 2.2.1 - 2.2.3 を洗ってください。手順 2.3 - 2.3.2 のように赤血球を溶解させます。
  3. フローサイトメトリーによる評価 (FACs) バッファー (1 %bsa + PBS) 1 mL 蛍光活性化細胞の細胞を再懸濁します。

11. フローサイトメトリーによる CTL 活性を決定するロジックのゲート

  1. 標準的な流れ cytometry のプロトコルを使用して CTL 活性の評価を実行します。励起11488 nm レーザを用いた流れの cytometer で FITC チャンネルを使用してセルを取得します。
    1. 前方散乱 (FSC) 対側散布 (SSC) パラメーターを使用してライブのリンパ球のゲート。総 CFSE 肯定的な人口の生きているリンパ球ゲート内 subgate します。
      注: 総リンパ球の脾臓に存在の小さなサブセットを注入された CFSE 分類された細胞になります。CSFE 陽性細胞は、対数スケールで 2 つの異なる集団として表示されます。
    2. ヒストグラム形式を使用して、パルス成分を含まない (左ピーク、CFSElo) とパルス (右ピーク、CFSEこんにちは) の割合を決定する集団。CFSEこんにちは細胞の損失は、抗原特異的 CTL アクティビティを示します。

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結果

CFSE 分類されたターゲット細胞の注入前にセルの 1:1 混合物が両方、CFSEこんにちはと CFSElo標的細胞の基準周波数を決定する流れの cytometer で実行されます。図 1FSC と SSC のパラメーターを使った初期のゲート、 Aは CFSE 個体数の変化を検出するゲートの戦略を示しています。この人口はラベルのない内因性脾細胞と比較されたとき比較的小さく、合計 CFSE 陽性細胞は周波数変化を評価する前に subgated します。CFSEこんにちはCFSElo集団の相対頻度は、100% で合計 CFSE 肯定的な人口を設定計算です。この分析を行うことができますヒストグラムまたはドット プロット形式を使用します。図 1Bに注入前 CFSE 集団の相対頻度の例を示します。この比率はほと...

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ディスカッション

このプロトコルは簡単ですが、慎重に行う必要がありますいくつかの重要なステップがあります。テストされている抗原特異的 T 細胞の注入 covax プライミングはパルスのターゲットのいずれかの殺害を参照する必要。短時間の水ベースの製剤を置き換えて遅い抗原の放出性油ベースのアプローチより生じる水ベースの covax 予防接種、慢性炎症期の急性炎症性疾患を作成することが可能ですが結果7,12。

また、CFSE 分類標的細胞は、理想的な流れの cytometry 読み出しで統一する抗原パルス必要があります、次の。簡単に区別することができる人口のログの違いを提供するこのシステムに理想的であると、CFSEこんにちは 5 μ m と、CFSElo 0.5 μ m のラベルが見つかりました。

このプロトコルはテストされている特定の抗原システムを変更する簡単です。まず、ペプチド、cova...

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開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

この作品は NIH の研究によってサポートされている (A1R03AI120027 (RN) と 1R21AI20012 (RN))、機関研究グラント (RN)、スタートアップは (RN) を付与、および MD アンダーソン CIC 種子 (RN) を付与します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
6週齢から12週齢の雌C57BL/6マウス Charles River027C57 Black 6 マウス
OT-1 6-12週齢の雌マウス ジャクソン研究所003831
hgp10025–33 CPCScientific834139KVPRNQDWL
OVA 257–264 CPCScientificMISC-012SIINFEKL
イミキモドクリーム5% Fougera51672-4145-6Aldara Cream
CD40-specific mAb BioXcellBE0016-2クローンFGK4.5
rhIL-2タンパク質 Hoffman LaRoche Inc136換えヒトIL-2タンパク質
70%イソプロピルアルコール調製 ケンドールS-17474
PBSLife Technologies10010-023リン酸塩緩衝生理食塩水
FBSLife Technologies26140-079シ胎児血清
RBC溶解緩衝液 ライフテクノロジーズ A10492-01赤血球溶解バッファー
RPMI 1640 MediaLife Technologies11875119
L-グルタミン ライフテクノロジーズ 25030081
ペン/連鎖球菌ライフテクノロジーズ 15140122ペニシリン/ストレプトマイシン
CFSEライフテクノロジーズ C345545-(および6)-カルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル
ウシ血清アルブミン(BSA)シグマ A4503
1.5 mL MCT目盛り付きナチュラル フィッシャー05-408-129微量遠心チューブ
70% エタノールフィッシャーBP8201500EtOH
トリパン ブルー溶液、0.4%  Life Technologies15250-061
球計算盤フィッシャー267110
27ゲージ針BD305109
1mLシリンジBD309659
組ウ血

参考文献

  1. Liu, L., et al. Visualization and quantification of T cell-mediated cytotoxicity using cell-permeable fluorogenic caspase substrates. Nat Med. 8 (2), 185-189 (2002).
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  4. Barber, D. L., Wherry, E. J., Ahmed, R. Cutting edge: rapid in vivo killing by memory CD8 T cells. J Immunol. 171 (1), 27-31 (2003).
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