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方法論記事

生体内でひと脂肪由来間葉系幹細胞が脂溶性膜の蛍光色素をラット膝関節変形性関節症モデルでの追跡

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DOI:

10.3791/56273

⸱

2017年10月8日

 ,  ,  ,  , 
1Cellular Biomedicine Group, China, 2Cellular Biomedicine Group, California, 3Department of Orthopedics, Shanghai TCM-Integrated Hospital, 4Department of Orthopedics, Shanghai East Hospital, Tongji University

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

このプロトコルでは、効率的に遠赤色蛍光 (IA) の関節内注入によるラット膝変形性関節症 (KOA) モデルで、セルの永続性とひと脂肪由来間葉系幹細胞 (haMSCs) の体内を監視する方法について説明します。

要約

膝変形性関節症 (コア)、ひと脂肪由来間葉系幹細胞 (haMSC) 療法の臨床応用を支援するため、セルの永続性の有効性と動物モデルにおける haMSCs の体内を調べた。脂溶性色素と haMSCs の細胞膜にラベルを付ける方法を示しました。その後、心術のコアを持つラットの標識細胞の関節内注入は、生体内イメージング システム動的に監視されました。我々 は、親油性を採用 carbocyanines でした (DilC18 (5))、周囲の組織から自然の緑色蛍光の励起を避けるために赤色レーザーを活用した遠赤色蛍光 Dil (dialkylcarbocyanines) アナログ。またの赤いシフトの発光スペクトルは、生きている動物の深い組織イメージングとラベリングのプロシージャは細胞毒性または haMSCs に機能障害生じなかった許可でした。このアプローチは、KOA ラットモデルにおける haMSCs の効率的な追跡方法であると示されています。最適な投与経路と前臨床試験で他のソースからの MSCs の投与量を決定するこのメソッドのアプリケーションが使えます。

概要

膝変形性関節症 (コア) は、関節軟骨の損失や世界の1のまわりの高齢者の主要な慢性疾患になった進歩的な炎症から生じる退行性疾患です。ただし、抗炎症薬、物理的なサプリメントや手術の手順を使用して現在の治療症状痛み2の一時的な救済を提供することがあります。

膝変形性関節症、軟骨の再生と免疫調節特性3、潜在的な多能性分化のための有望な再生治療薬となっているひと脂肪由来間葉系幹細胞 (haMSCs) 4。生体内でアクションのメカニズムを調査する薬理学的ルートと比べると、小さなコア動物モデルでライブの haMSCs を追跡する現在の理論的根拠と臨床応用の前に haMSC 療法の有効性を確立するために有益です。前臨床試験の内側半月 (MM) は、一貫性のある再現性5比較的実現可能なモデルを提供するラットでは, コアを誘導するために関節の機械的負荷を不安定化します。MM によるコアの発症は、膝前十字靭帯断裂単独あるいは部分内側半月6より前です。したがって、コアの病理学的微小環境と注入された haMSCs の長期的な相互作用は多くの場合8MM7,投与ラットにおける評価されます。

HaMSCs の薬効は広く報道されると、関連する知識をされているが (IA) の関節内注射による注入 haMSCs の生体内で持続性は乏しい9,10です。したがって、様々 な細胞ラベリング方法が開発されて、immunohistology11、ルシフェラーゼ12、緑の蛍光蛋白質13トランスフェクション、鉄酸化物の磁気共鳴画像 (MRI)14 のラベリングなど、および多数蛍光セル染料8,15,16。手間のかかる組織解析と比較して、生体内の非侵襲的イメージングはリアルタイム配信や蛍光信号10,17の付いた細胞の動態を検出する光学デバイスを採用しています。機能の生きているセルイメージ投射のため cytocompatible の蛍光標識、幹細胞移植18後細胞活動を明らかにする洗練された放射性無料トラッキング手法です。また、多色蛍光脂溶性色素は、アミノ反応親水性染料や蛍光蛋白質が改良されたセル透磁率および増強蛍光量子収量19を含む上の利点を所有しています。

こうして、ここで含まれるプロトコル利用赤い脂溶性 carbocyanines ラベルの付いたセルを励起するレーザーでした (DilC18(5))、遠赤色蛍光 Dil (dialkylcarbocyanines) アナログ20であります。赤いシフト励起と発光スペクトルされる干渉を回避したし、深い組織の生きている動物の8時間の長期間画像をことができます。この方法で追跡細胞の生体内での付いたでしたを理解し、現在の幹細胞再生治療の向上に不可欠な動物モデルでの haMSCs などの移植の幹細胞を監視するためです。

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プロトコル

動物を対象とする手順は動物の苦痛を最小限に抑える努力をローカル機関動物のケアと倫理委員会で承認されました。次のプロトコルは、機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) 上海 9 人によって承認された ’ プロトコルと上海交通大学医学部付属病院 s [2017] 番号 063

。

1 です Surgically-Induced ラット膝関節変形性関節症モデルの確立

  • この手術、250 と 300 g. 間体重の使用 8-12 週齢雄 SD) ラットの
      • 。
    1. 40 mg/kg チレタミンと 40 mg/kg 筋肉内注射を介してチレタミン動物を麻酔します
      2. 。
    2. は、左側臥位で加熱ステージに動物を配置します。右膝を徹底的にかみそりで剃る。70% エタノールに続いて 10 %providone ヨード溶液による外科的領域を消毒、2 回以上繰り返すと後 10 %providone ヨード溶液でペイントし、非外科的手術パッド領域をカバーします
      3. 。
    3. 、Jointcapsules を公開する膝蓋腱に沿って横方向に 2 cm の切開を行う手術のメスを使用しています
      4. 。
    4. は、内側側副靱帯のトランセクトを手術用メスを使用します。大腿骨に向かってメニスカスを反映します
      5. 。
    5. 軟骨が乾くを防ぐために操作中に関節軟骨の表面の滅菌の 0.9% 塩化ナトリウム溶液を滴下します
      6. 。
    6. は、ピンセットで内側半月板をつかむし、メス ( 図 1 a) と脛骨の添付ファイルからの狭いポイントで半月板をカットします。避けるために軟骨を負傷します
      7. 。
    7. 4-0 吸収性縫合糸と関節包を閉じます
      8. 。
    8. 彼らは意識を取り戻すまで、手術のラットを監視します
      9. 。
    9. 感染や手術後の痛みを和らげるために筋肉内のルートを通じて 0.05 mg/kg ブプレノルフィン 20 mg/kg のゲンタマイシンを挿入します
      10. 。
    10. 温度制御動物施設発症コアに 3-8 週の 12 h 明暗サイクルの下でラットを維持します。動物が痛み症状が続く場合、ブプレノルフィン (0.05 mg/kg, i. m.) とゲンタマイシン (20 mg/kg, i. m.) に限定されないなどの鎮痛薬を受け取り続けます
      11. 。

    2。ラット コア モデルの組織評価

    1. 過剰な CO 2 吸入 (動物の無意識を作るに追加商工会議所の既存の空気に二酸化炭素を 1 分あたり試験室の容積の約 30% のフィル レートとラットを犠牲に2-3 分の最低維持 CO2 流れ呼吸後 1 分以内停止します。)手術後時点 (代表コア誘導 3 から 8 週間までの 8 週間で結果が表示されます) を示した
    2. メスと膝継手を切り肌と膝の関節の周りの筋肉を解剖
      3. 。
    3. は、室温で 3 日間の 4% パラホルムアルデヒド (PFA) の膝継手を修正します。その後、4 ° C で約 4 週間 20% エチレンジアミン四酢酸 (EDTA) のサンプルをめし、EDTA を 3 日ごとに変更します
      。 注意: パラホルムアルデヒドは有毒である、手袋、眼鏡など適切な個人用保護具 (PPE) を着用します
      4. 。
    4. は、自動ティッシュ プロセッサを使用してサンプルを脱水します。フラッシュ サイクルを次のように起動するメニューを設定: 70% のエタノールの 1 h。その後 80% エタノールと 95% のエタノール 1 h のそれぞれ;1 時間の 100% エタノールの 2 サイクルが続くその後、1 h の 2 倍のキシレンのたび、たび 58 ° C 1 時間で 3 回パラフィンします
      。 注意: キシレンは有毒である、ので、適切な PPE は、手袋、眼鏡などを着用します
      。 注: 必要に応じて、Coplin Jar の使用自動ティッシュ プロセッサとして同じセットアップと手動脱水します
      5. 。
    5. そのまま接合面の内側面を下に置くし、中央に埋め込まれた組織をパラフィン ブロックに埋め込む
      。 注: 必要に応じて、パラフィン ブロックにサンプルを手動で埋め込む鉗子を使用します
      6. 。
    6. 回転式ミクロトームで 2 連続切片で 30 μ m 間隔で 5 μ m 矢状セクション内側縁から関節をカットを開始します
      7. 。
    7. は、スライド ガラス上のセクションをマウントし、キシレンでスライドを deparaffinize します。2 連続切片の間ヘマトキシリンと 1 つのスライドを染色 & エオシン (H & E) 染色: 0.1% 1%、15 分間ヘマトキシリン 10 s および 0.5% の酢酸水溶液 10 分エオシン。サフラニン O/高速の緑色の染色と他のスライドを染色: 0.1%、0.02% の 15 分間ヘマトキシリン 3 分、1% の高速グリーン酢酸溶液に 10 s および 3 分の 0.1% サフラニン O
      注意: キシレンは有毒である、眼鏡、手袋などの適切な PPE を着用します
      8. 。
    8. ラット 6 で変形性関節症の研究の社会インターナショナル (OARSI) 病理組織評価システムを使用して染色スライドをスコアします
      9. 。

    3。蛍光色素は、ヒト間葉系幹細胞をラベリング

    1. 1 mM の濃度で 100% エタノールの細胞ラベリング ソリューションの準備をしました。光から保護して細胞ラベリング ソリューションと 6 ヶ月間常温保存します
      2. 。
    2. 成長ダルベッコの標準的な細胞培養プロシージャと haMSCs ' s 変更イーグル ' s 培 (DMEM) 1% ペニシリン、ストレプトマイシンと 10% 牛胎児血清 (FCS) 10 cm シャーレで
      3. 。
    3. 1 mM EDTA 合流前の約 80% 点と 2 mL 0.25% トリプシン haMSCs をデタッチします
      4. 。
    4. 培地 4 mL のトリプシンを中和し、室温で 3 分間 800 x g でセルをスピンします
      5. 。
    5. 5 mL 無血清培地の 1 x 10 6 セル/ml の密度でセルを中断します
      6. 。
    6. 50 を追加することによって、セルのラベル μ L は 5 mL 50 分の 37 ° C で培養の無血清細胞ラベリング ソリューション
    7. 800 x g で 3 分間でラベル付きセルをスピン
    8. 5 mL リン酸バッファー生理食塩水 (PBS) 3 分間 800 x g で 2 セルを洗浄して回以上
      9. 。
    9. Cy5 のフィルター セットと蛍光顕微鏡を用いたラベル付きの haMSCs を確認してください
      10. 。
    10. トリパン ブルー染色でセルをカウントし、2.5 倍の注射用 100 μ L の PBS で 10 の 6 の実行可能なセルを取得します
      11. 。

    4。生体内で蛍光イメージング トラック haMSCs

    1. (ステップ 1)、手術後 8 週間は 25 mg/kg チレタミンとチレタミン 25 mg/kg の筋肉内投与によりコア ラットを麻酔します
      2. 。
    2. 右膝を徹底的に関節部を公開するかみそりで剃る。70% エタノールで関節部を消毒します
      3. 。
    3. 2.5 x 10 26 G 注射針を使用して注入 6 標識三角形領域の中央に 100 μ L の PBS 中に浮遊細胞は内側膝蓋靭帯、内側の大腿骨顆と脛骨の内側顆 (によって形成されます。 図 1 b).
    4. イメージング ソフトウェアを開き、体内 の発光イメージング システムを初期化します
      5. 。
    5. イメージング システムの中央ステージでの位置や部屋のドアを閉じる位置ラット臥
      6. 。
    6. チェック、" 蛍光 " 640 の設定チェック ボックスと蛍光フィルターの選択励起、nm および 680 nm の発光 ( 図 2 a) ため
      7. 。 D. 設定中 (8) にピクセルビニングに
    7. 選択フィールドのビュー 2 と露出に F/ストップの自動時間します。最適な維持します。全体の研究 ( 図 2 a) で同等の結果を取得する一貫性のある露出時間
      8. 。
    8. はステージと麻酔からの回復のためのモニターから動物を削除します
      。 注: 加熱パッド上の場所の動物のタオル地の 2-3 層で覆われている
      9. 。
    9. は、放射効率の蛍光 ( 図 2 b) 測定のための単位を選択します。利益 (率 ROI) 分析のための領域を選択し、それぞれのイメージ ( 図 2) から蛍光信号を定量化します
      10. 。
    10. は 生体内 イメージング研究 haMSCs 縦保持関節の順に各ラットのための手順を繰り返します
      。 注: 動物のイメージングを提案 ' 蛍光信号を用いたイメージング システム注入後最初の週 2 日に一度と一度毎週まで信号が検出できません
      11. 。

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    結果

    コア モデルを誘導するために MM は SD ラット (図 3) の右ひざ関節で行われました。手術後 8 週間ラットを犠牲に、膝継手の連続切片を両方 H で行った & E、サフラニン O/高速グリーン染色 (図 4)。H の & E 染色、関節軟骨の表面の展示手術膝手術をせず通常の関節よりも粗いボーダー。サフラニン-O/高速緑染色 (赤染色) 減少のプロテオグリカンを観測し、共同手術表現型コア変性の進行を示されている通常のものと比較して繊維コラーゲン (緑染色) を増加手術によって誘導されます。人間のコアの進行に似せて、3 週間、6 週間、病態を評価し、治療の時間を決定する MM 後 8 週間でラットが犠牲になった。

    ラベルは haMSCs は光で生体内イメージング システム コア ラットモデルにおけ...

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    ディスカッション

    我々 はベンチから枕元にコアの再生幹細胞治療をもたらすことができる前に、安全基準と体内の幹細胞療法の研究は必要緊急です。ただし、疾患の病理組織学的環境は、永続性と移植 haMSCs10の体内で重要な役割を果たしています。最近、私たちのグループを示した haMSCs の関節内注入の永続化をもはや病理コア環境よりも通常の条件8下注射をしました。炎症と変性微小環境が修理の間葉系幹細胞を募集し、その後注入 haMSCs1、21の保持を支持、不可能です。さらに、haMSCs の安全性と有効性のプロファイルは、実験動物の KOA の進行の最適化は臨床試験をサポートするための貴重なデータを提供できるようにコアの重要度に関する携帯配信のタイミングに左右される可能性があります。目的に似た人間のコアの中等度の軽度、3 から 8 週間まで及ぶコアを開発 MM によるラットが許可されています。本研究では軟骨の形態学的変化は、比較的実現可能なモデルの有...

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    開示事項

    孟李明浩、温王が現在の従業員と細胞生物医学グループのストック オプションの保有者 (Nasdaq: CBMG)。他の著者は利益相反を宣言しません。

    謝辞

    現在の研究は、上海科学技術委員会の上海の自治体 (CN) 博士温王に主催の革新資金 (294300 1402 H) によって支えられました。彼の技術支援とこの原稿の科学的助言のため広東省周博士 (組織工学センターの中国国家) に感謝したいと思います。我々 も感謝したい氏 Huitang 夏 (上海第九人民病院) 動物の福祉に貢献しました。

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    材料

    この記事で使用された材料の一覧
    名前会社カタログ番号コメント
    Matrx VMR動物麻酔システムMidmarkVIP3000
    4-0縫合JinhuanKC439
    みそりPritechLD-9987
    Gentamicin浙江Jindakang動物衛生製品有限公司なし
    0.9% 塩化ナトリウム溶液湖南ケルン製薬株式会社
    ペニシリン上海康府化学製薬有限公司なし
    ブプレノルフィン天津製薬研究所 Pharmaceutical Co., Ltd.なし
    パラホルムアルデヒドSigma-Aldrich16005PBS EDTAで最終濃度10%まで希釈
    Sigma-AldrichE9884で最終濃度20%まで希釈
    sSigma-AldrichMHS16
    0.5% Eosin Y 溶液、アルコールSigma-AldrichHT110116
    Safranin OSigma-AldrichS8884
    Fast GreenSigma-AldrichF7258
    Shandon Excelsior ESTM Tissue ProcessorThermo FisherA78400006
    Shandon Histocentre™ 3 組織埋め込みCenterThermo FisherB64100010
    全自動回転式ミクロトームLeicaRM2255
    DiDMolecular Probes, Life
    Technologies    		V-22887
    D-MEM High GlucoseSigma-AldrichD5648
    PBSGIBCO, Life Technologies14190-144
    0.25% Trypsin-EDTAInvitrogen25200-114
    10 cm ペトリ皿コーニングV118877
    遠心分離機ベックマンオプティマ MAX-TL
    蛍光顕微鏡オリンパスBX53
    0.4% トリパン ブルー溶液Sigma-Aldrich93595
    TitetammeVirbac (Zoletil 50)1000000188
    ゾラゼパムVirbac(Zoletil 50)1000000188
    使い捨て無菌低血清注射器 26G上海三沢医療工業なし
    IVIS Spectrum In Vivo イメージングシステムPerkinElmer124262
    Living Imaging 4.0ソフトウェアPerkinElmerなし
    糸上海かH43020455 PBS 0.1%ヘマトキシリン溶液

    参考文献

    1. Loeser, R. F., Goldring, S. R., Scanzello, C. R., Goldring, M. B. Osteoarthritis: a disease of the joint as an organ. Arthritis Rheum. 64 (6), 1697-1707 (2012).
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