このプロトコルでは、効率的に遠赤色蛍光 (IA) の関節内注入によるラット膝変形性関節症 (KOA) モデルで、セルの永続性とひと脂肪由来間葉系幹細胞 (haMSCs) の体内を監視する方法について説明します。
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方法論記事
生体内でひと脂肪由来間葉系幹細胞が脂溶性膜の蛍光色素をラット膝関節変形性関節症モデルでの追跡
* These authors contributed equally
この記事について
サマリー
要約
膝変形性関節症 (コア)、ひと脂肪由来間葉系幹細胞 (haMSC) 療法の臨床応用を支援するため、セルの永続性の有効性と動物モデルにおける haMSCs の体内を調べた。脂溶性色素と haMSCs の細胞膜にラベルを付ける方法を示しました。その後、心術のコアを持つラットの標識細胞の関節内注入は、生体内イメージング システム動的に監視されました。我々 は、親油性を採用 carbocyanines でした (DilC18 (5))、周囲の組織から自然の緑色蛍光の励起を避けるために赤色レーザーを活用した遠赤色蛍光 Dil (dialkylcarbocyanines) アナログ。またの赤いシフトの発光スペクトルは、生きている動物の深い組織イメージングとラベリングのプロシージャは細胞毒性または haMSCs に機能障害生じなかった許可でした。このアプローチは、KOA ラットモデルにおける haMSCs の効率的な追跡方法であると示されています。最適な投与経路と前臨床試験で他のソースからの MSCs の投与量を決定するこのメソッドのアプリケーションが使えます。
概要
膝変形性関節症 (コア) は、関節軟骨の損失や世界の1のまわりの高齢者の主要な慢性疾患になった進歩的な炎症から生じる退行性疾患です。ただし、抗炎症薬、物理的なサプリメントや手術の手順を使用して現在の治療症状痛み2の一時的な救済を提供することがあります。
膝変形性関節症、軟骨の再生と免疫調節特性3、潜在的な多能性分化のための有望な再生治療薬となっているひと脂肪由来間葉系幹細胞 (haMSCs) 4。生体内でアクションのメカニズムを調査する薬理学的ルートと比べると、小さなコア動物モデルでライブの haMSCs を追跡する現在の理論的根拠と臨床応用の前に haMSC 療法の有効性を確立するために有益です。前臨床試験の内側半月 (MM) は、一貫性のある再現性5比較的実現可能なモデルを提供するラットでは, コアを誘導するために関節の機械的負荷を不安定化します。MM によるコアの発症は、膝前十字靭帯断裂単独あるいは部分内側半月6より前です。したがって、コアの病理学的微小環境と注入された haMSCs の長期的な相互作用は多くの場合
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プロトコル
動物を対象とする手順は動物の苦痛を最小限に抑える努力をローカル機関動物のケアと倫理委員会で承認されました。次のプロトコルは、機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) 上海 9 人によって承認された ’ プロトコルと上海交通大学医学部付属病院 s [2017] 番号 063
。1 です Surgically-Induced ラット膝関節変形性関節症モデルの確立
- 。
- 40 mg/kg チレタミンと 40 mg/kg 筋肉内注射を介してチレタミン動物を麻酔します 。
- は、左側臥位で加熱ステージに動物を配置します。右膝を徹底的にかみそりで剃る。70% エタノールに続いて 10 %providone ヨード溶液による外科的領域を消毒、2 回以上繰り返すと後 10 %providone ヨード溶液でペイントし、非外科的手術パッド領域をカバーします 。
- 、Jointcapsules を公開する膝蓋腱に沿って横方向に 2 cm の切開を行う手術のメスを使用しています 。
- は、内側側副靱帯のトランセクトを手術用メスを使用します。大腿骨に向かってメニスカスを反映します 。
- 軟骨が乾くを防ぐために操作中に関節軟骨の表面の滅菌の 0.9% 塩化ナトリウム溶液を滴下します 。 ....
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結果
コア モデルを誘導するために MM は SD ラット (図 3) の右ひざ関節で行われました。手術後 8 週間ラットを犠牲に、膝継手の連続切片を両方 H で行った & E、サフラニン O/高速グリーン染色 (図 4)。H の & E 染色、関節軟骨の表面の展示手術膝手術をせず通常の関節よりも粗いボーダー。サフラニン-O/高速緑染色 (赤染色) 減少のプロテオグリカンを観測し、共同手術表現型コア変性の進行を示されている通常のものと比較して繊維コラーゲン (緑染色) を増加手術によって誘導されます。人間のコアの進行に似せて、3 週間、6 週間、病態を評価し、治療の時間を決定する MM 後 8 週間でラットが犠牲になった。
ラベルは haMSCs は光で生体内イメージング システム コア ラットモデルにおけ.......
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ディスカッション
我々 はベンチから枕元にコアの再生幹細胞治療をもたらすことができる前に、安全基準と体内の幹細胞療法の研究は必要緊急です。ただし、疾患の病理組織学的環境は、永続性と移植 haMSCs10の体内で重要な役割を果たしています。最近、私たちのグループを示した haMSCs の関節内注入の永続化をもはや病理コア環境よりも通常の条件8下注射をしました。炎症と変性微小環境が修理の間葉系幹細胞を募集し、その後注入 haMSCs1、21の保持を支持、不可能です。さらに、haMSCs の安全性と有効性のプロファイルは、実験動物の KOA の進行の最適化は臨床試験をサポートするための貴重なデータを提供できるようにコアの重要度に関する携帯配信のタイミングに左右される可能性があります。目的に似た人間のコアの中等度の軽度、3 から 8 週間まで及ぶコアを開発 MM によるラットが許可されています。本研究では軟骨の形態学的変化は、比較的実現可能なモデルの有.......
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開示事項
孟李明浩、温王が現在の従業員と細胞生物医学グループのストック オプションの保有者 (Nasdaq: CBMG)。他の著者は利益相反を宣言しません。
謝辞
現在の研究は、上海科学技術委員会の上海の自治体 (CN) 博士温王に主催の革新資金 (294300 1402 H) によって支えられました。彼の技術支援とこの原稿の科学的助言のため広東省周博士 (組織工学センターの中国国家) に感謝したいと思います。我々 も感謝したい氏 Huitang 夏 (上海第九人民病院) 動物の福祉に貢献しました。
....アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| Matrx VMR動物麻酔システム | Midmark | VIP3000 | |
| 4-0縫合 | Jinhuan | KC439 | |
| みそり | Pritech | LD-9987 | |
| Gentamicin | 浙江Jindakang動物衛生製品有限公司 | なし | |
| 0.9% 塩化ナトリウム溶液 | 湖南ケルン製薬株式会社 | ||
| ペニシリン | 上海康府化学製薬有限公司 | なし | |
| ブプレノルフィン | 天津製薬研究所 Pharmaceutical Co., Ltd. | なし | |
| パラホルムアルデヒド | Sigma-Aldrich | 16005 | PBS EDTAで最終濃度10%まで希釈 |
| Sigma-Aldrich | E9884 | で最終濃度20%まで希釈 | |
| s | Sigma-Aldrich | MHS16 | |
| 0.5% Eosin Y 溶液、アルコール | Sigma-Aldrich | HT110116 | |
| Safranin O | Sigma-Aldrich | S8884 | |
| Fast Green | Sigma-Aldrich | F7258 | |
| Shandon Excelsior ESTM Tissue Processor | Thermo Fisher | A78400006 | |
| Shandon Histocentre™ 3 組織埋め込みCenter | Thermo Fisher | B64100010 | |
| 全自動回転式ミクロトーム | Leica | RM2255 | |
| DiD | Molecular Probes, Life Technologies | V-22887 | |
| D-MEM High Glucose | Sigma-Aldrich | D5648 | |
| PBS | GIBCO, Life Technologies | 14190-144 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200-114 | |
| 10 cm ペトリ皿 | コーニング | V118877 | |
| 遠心分離機 | ベックマン | オプティマ MAX-TL | |
| 蛍光顕微鏡 | オリンパス | BX53 | |
| 0.4% トリパン ブルー溶液 | Sigma-Aldrich | 93595 | |
| Titetamme | Virbac (Zoletil 50) | 1000000188 | |
| ゾラゼパム | Virbac(Zoletil 50) | 1000000188 | |
| 使い捨て無菌低血清注射器 26G | 上海三沢医療工業 | なし | |
| IVIS Spectrum In Vivo イメージングシステム | PerkinElmer | 124262 | |
| Living Imaging 4.0ソフトウェア | PerkinElmer | なし |
参考文献
- Loeser, R. F., Goldring, S. R., Scanzello, C. R., Goldring, M. B. Osteoarthritis: a disease of the joint as an organ. Arthritis Rheum. 64 (6), 1697-1707 (2012).
- Lane, N. E., Shidara, K., Wise, B. L. Osteoarthritis year in review 2016: clinical. Osteoarthritis Cartilage. 25 ....
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再版と許可
