方法論記事

ショウジョウバエの胚とパスチラミドシグナル信号増幅を利用した生体表面の高解像度蛍光In Situハイブリダイゼーション

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DOI：

10.3791/56281

⸱

2017年10月19日

 ,  ,  , 
1The Terrence Donnelly Centre for Cellular and Biomolecular Research, University of Toronto, 2Department of Molecular Genetics, University of Toronto

この記事について

サマリー

記載されている RNAその場で交配のプロトコルでは、全体のショウジョウバエの胚または切り裂かれたティッシュで RNA の検出をことができます。96 ウェル マイクロ プレートとパスチラミドシグナル信号増幅を使用して、高解像度、感度、および、スループットと比較的低コストで成績証明書が検出できます。

要約

当社オリジナル蛍光原に数多くの修正および改善を開発した式のパターンとショウジョウバエゲノムに基づいて Rna の細胞内の局在を決定するための努力と様々 な組織では、の交配 (魚) のプロトコル。スループットと費用対効果を容易にするには、プローブ信号検出、世代から、すべての手順は、エクソンの 96 ウェル マイクロ プレートを使用して実行されます。Digoxygenin (掘る)-ラベル アンチセンス RNA プローブは、テンプレートとして cdna やゲノム DNA を使用して生成されます。ティッシュの固定、透過後興味のトラン スクリプトにプローブを交配し、ビオチン、西洋ワサビペルオキシダーゼ (HRP) に共役し、蛍光標識ストレプトアビジンに共役抗 DIG 抗体の連続を使用して検出されました。パスチラミドシグナル、HRP の存在下ですぐに隣接する蛋白質の電子密度の高い領域に結合する反応性の高い中間体を生成します。増幅およびローカリゼーション手順は、両方の細胞および細胞内局在のトラン スクリプトのローカライズを容易にする堅牢で非常にローカライズされた信号を生成します。提供されるプロトコルは、さまざまな組織や発達段階に特異性の高い信号を生成する最適化されています。参照は同時に複数の成績証明書または成績証明書と蛋白質の同時検出を許可する追加のバリエーションもあります。

概要

RNA シーケンスなど新たなゲノム RNA 検出方法は大きく何レベル1いつ、どこの遺伝子の表現の知識を拡大しています。ただし、これらは時間的・空間的解像度が比較的低いを提供します。In situ ハイブリダイゼーション RNA は、こうして細胞および細胞レベル下のローカリゼーション2の詳細を明らか固定組織で観察される視覚的に成績の分布をことができます。蛍光そのままの交配 (魚) を使用すると、さらに多くの空間分解能共焦点と光シート顕微鏡3などの強力な顕微鏡の技術の使用をことができます。4細胞の関係を確立するなど DAPI の蛍光マーカーが使えます。魚も細胞レベルで重複の明確な兆候と同時に複数の Rna とタンパク質の観察が容易になります。ユニークな試薬および二重分類に必要な手順は、次の参照3,5で見つけることが。

ここで説明する手順は、cDNA テンプレート制作 (コロニー PCR)、RNA プローブ生産 (T7、T3 または SP6 ポリメラーゼ依存流出転写を使用して)、 in situハイブリダイゼーションを含むすべての手順については、96 ウェル マイクロ プレートを利用し、蛍光信号開発。胚または組織の十分な数がそれぞれに追加されます一貫性そして可変性の評価を許可する 96 ウェル プレートのも。それぞれはそれでは異なるプローブを受け取ります。信号開発後胚または各ウェルから組織を顕微鏡分析のための個々 の顕微鏡スライドで配列します。

プローブ検出のためのパスチラミドシグナル信号増幅 (TSA) の使用は、細胞内に優れた分解能5,6,7,8堅牢な信号を生成します。Rna の細胞内の局在が事実上すべて Rna 4,,1011で発生することが表示されます重要な規制メカニズム9 。これらの解析では、RNA シーケンスで検出されない多くの転写産物が魚8によって容易に検出されたことが示されています。96 ウェル プレートに交配その場でRNA の適応一度に興味の最大 96 遺伝子の解析 (出来れ追加プレート使用)、大規模なデータセットの分析を可能します。小さいセクションにプレートを切断することによってメソッドも簡単にいくつかのサンプルに適応されます。提供されるプロトコルは、組織のほとんどの種類の RNA の分布の解析に適しています。示されていませんが、非 -ショウジョウバエのティッシュと同様に適応されます。

プロトコル

1。 cDNA テンプレート プラスミドからの PCR 増幅

注: 高品質プラスミドを使用または rna DNA の PCR 生成テンプレート プローブ合成。バークレーの ショウジョウバエ のゲノムのプロジェクトによって生成された ショウジョウバエ 遺伝子コレクション (DGC) ライブラリは、ショウジョウバエ ゲノムで見つけられたほとんどのコーディングの遺伝子のカバレッジを提供します (表 1 a を参照してください)。これらの cDNA の挿入の増幅のため普遍的なプライマーの使用ができます。これらの PCR の拡大は、プラスミド Dna のプラスミッドを含んでいる細菌文化の lysates の存在で行われます。DNA 製品はアンチセンス RNA プローブ (表 1 b 参照) を生成する 生体外 のトランスクリプションのためのテンプレートとして使用されます

。
  1. PCR による興味の遺伝子の特定のエクソン領域を増幅するプライマーを設計 (e.g genomic DNA から)、アンチセンス側 T7 ポリメラーゼ認識サイトが好ましいと。
    2. 。
  2. 未満 96 サンプルと実験、96 ウェルのプレートの不要部分をカットします。カバー プレート シールとテープのすべての孵化とストレージ (マテリアルを参照してください)。マイクロ遠心チューブ用を使用している場合は、それに応じてボリュームを調整します
    。 注: 96 ウェル プレートは、コスト削減のためのより小さいボリュームと同様に、スループットを向上させるためマルチ チャンネル ピペットの使用を許可します
    3. 。
表 1 a

ベクトル		抗生物質
濃度 1: 1000 の作業
プライマー		RNA ポリメラーゼ
の
アンチセンス		RNA ポリメラーゼ
。
センス
pFLC-私アンプpBst_SK (-) _F/RT3T7
pBSt(-)アンプpBSt_SK(-)T7T3
pOT2クロルpOT2_F/RSP6T7
pOTB7塩素pOT2_F/RT7SP6
表 1 b
プライマーシーケンス
pOT2_Forward 5 '-AAT-GCA-GGT-TAA-CCT-GGC-TTA-TCG-3 '
pOT2_Reverse 5 '-AAC-GCG-GCT-ACA-ATT-AAT-ACA-TAA-CC-3 '
pBst_SK (-) _Forward 5 '-GAA-ACA-GCT-ATG-ACC-ATG-ATT-ACG-CC-3 '
pBst_SK (-) _Reverse 5 '-CGG-CCA-GTG-AAT-TGT-AAT-ACG-ACT-C-3 '

テーブル 1: A) プラスミドに cDNA を増幅するための一般的な DGC クローン情報を挿入します。B) DGC のプラスミッドのための普遍的なプライマーの配列

。
  1. プラスミドを含む成長の 250 μ L と適切な抗生物質選択 (1000 X 抗生物質株式の 1: 1000 希釈) ウェルあたり LB 媒体の 240 μ L と元の 10 μ L の追加によって 96 ウェル培養皿で培養(グリセロール ストック) からのプラスミッドを含んでいる細菌。シーリング テープでシールします
    2. 。 37 ° c 一晩 215 rpm (O/N) を揺することによって
  2. 加温します
    。 注: は、細菌のグリセロール cDNA プラスミド クローン元を交換する株式の新しいコピーを作成します。これは細菌を殺すことができる、元の細菌の在庫は再冷凍しないでください
    3. 。 PCR テンプレートを生成する
  3. は、O/N 培養 90 μ L オートクレーブ ddH 2 O 新しい 96 ウェル PCR プレートの各ウェルに 10 μ L を希釈します。たちの 95 ° C で 5 分間 DNA を変化させなさい。すぐに、少なくとも 5 分間氷の上プレートを置き
  4. 表 2 に従って適切な普遍的なプライマーを用いた PCR の準備反応
    5. 。
試薬50 μ l サンプル反応96 をよく混ぜ合わせて
(112 x反応)		最終濃度
2 X PCR のポリメラーゼ ミックス25 μ l2800 μ1 X
Primer_For (25 pmol/μ l)0.5 μ l56 μ l0.25 pmol/μ l
Primer_Rev (25 pmol/μ l)0.5 μ l56 μ0.25 pmol/μ l
ddH2O22 μ l2464 μ
合計48 μ5376 μ l

テーブル 2: PCR マスター ミックス

。
  1. 、新しい 96 ウェル PCR プレートの各ウェルに PCR マスター ミックスの 48 μ L 分注ピペットを使用しています。2 μ L/ウェル各変性プラスミド DNA のテンプレートの追加
    。 注: 1 ナノグラム (ng) プラスミド DNA を 1 picogram (pg) の間に使用します。過剰な DNA テンプレート PCR の収穫と特異性を低減します
    2. 。
  2. 表 3 に従って 96 ウェル PCR 機械をプログラムし、増幅を実行します
    。 注: 72 ° C で延長時間、PCR の製品のサイズによって決まります (45 秒 ≤ 2.0 kb、1.5 分の ≤ 3.0 kb、3 分の ≤ 4.0 kb と 3.5 4.0 5.0 kb 分)。アニーリングの温度 (Tm) は、プライマーの順序によって決まります。プライマーが等しいまたは 20 を超える場合 nt、Tm として計算されます:
    Tm (° C) = (4 X CG 数) + (2 X AT 数)-4
。 < td 行スパン =「3」> 30 サイクル
ステップ温度時間サイクル
初期変性95 ° C3 分1 サイクル
増幅
変性、アニーリングをおよび拡張		95 ° C45 秒
54-58 ° C45 秒
72 ° C45 秒から 3.5 分
最終的な拡張72 ° C7 分1 サイクル
ストレージ4 ° Cを保持

表 3: PCR のプログラムをお勧めします

。
  1. PCR 製品沈殿エタノール (エタノール) とナトリウムのアセテート (NaOAC) (表 4 参照).
    注: 場合、PCR の反作用ボリューム未満 50 μ L、ddH 2 O を 50 μ L を記入します。 DNA の沈殿物、ミックス表 4 とストアのサンプルから O/N-20 ° c または-80 °C.Centrifuge で 30 分のコンポーネント c に 4 ° c. の使用 8 チャネル マニホールド ピペットで 2,250 x g で 45-60 分の 96 ウェル プレート
    1. 上清を完全削除します。冷たい 70% の 160 μ L で一度洗って 4 2,250 x g で 30 分間 (RNase フリー) 江藤 ° C
      注: ウェルの底に沈殿した DNA を見ることができます。短い PCR の製品を必要と長く遠心します
      2. 。 各ウェル内の液体の最後の滴を削除するペーパー タオルの上の 96 ウェル プレートをやさしく転倒させる
    2. (可能な限り)。エアコン室内温度 (RT) で 1 時間乾燥 DNA の餌。25 μ L RNase 自由水に沈殿した DNA を再懸濁します
      。 注: 1 h 空気乾燥エタノールを蒸発させるためのすべてのトレースできるようになります。ただし、液体 (約 1 μ L) の非常に小さい量は DNA の餌が完全に乾燥するを防ぐために各ウェルに残しておきます。50 μ L の PCR 反応に 25 μ L を使用します。次の手順で の in vitro 転写との干渉を避けるためにこの段階で DEPC 処理水を使用しないでください
      3. 。
の の の
コンポーネント容積部分
PCR50 μ l
100% エタノール125 μ lPCR の 2.5 X 巻
3 M NaOAc (pH = 5.2、RNase フリー)5 μ lの PCR の巻 10%
合計180 μ l

表 4: 50 μ L の PCR 反応の例

。
  1. 1 X TAE バッファーに 1% の agarose のゲルの再懸濁の DNA 溶液の 5 μ L を実行して、サイズおよび PCR 産物の収量を確認します
    。 注: 合計 250 500 ng の DNA のテンプレートの転写反応 の in vitro 15 μ L 必要です。生産性の高いサンプルは、さらに希釈することができます。RNA の収穫はシーケンスと DNA テンプレートの長さによって異なります。T7 RNA ポリメラーゼと掘る RNA の分類のための一般的なガイドによると DIG 標識 RNA の約 10 μ g は、1 μ の線形化されたテンプレートから生成されます
    2. 。

2。アンチセンス プローブを生成する in vitro 転写

。

注: RNase フリーの環境で働くことが重要です。すべての試薬、実験器具は RNase 無料 (認定 DNase/RNase フリー プラスチック製品) などをする必要があります

。
コンポーネント在庫濃度ボリューム最終濃度
ATP100 mM7 μ10 mM
CTP100 mM7 μ10 mM
GTP100 mM7 ・ #956; l10 mM
UTP100 ミリメートル4.5 μ l6.5 mM
掘る 11 UTP10 mM25 μ l3.5 mM
RNase フリー水19.5 μ l
合計70 μ l

表 5: 掘る NTP ミックス準備

< テーブル。国境 =「1」fo:keep-together.within-ページ =「1」fo:keep-と-next.within-ページ「常に」= > コンポーネント 15 μ l 反応 96 をよく混ぜ合わせて
(112 x 反応) 最終濃度 5 X 転写バッファー μ l 3.00 3.00 μ 1 x 0.75 μ l 0.75 μ l の掘る NTP ミックス (10 mM) 0.5 mM RNase 阻害剤 0.25 μ l 0.25 μ l 0.67 U/μ l RNA ポリメラーゼ (T7 または SP6 T3) μ l 2.00 2.00 μ 2.67 U/μ l RNase フリー水 1.50 μ 1.50 μ l 合計 μ l 7.50 7.50 μ l

表 6:2 X 転写マスター ミックス

。 表 5 に従って
  1. 準備掘る NTP ミックス
    。 注: 間違いを避けるためには、常にように合わせますプレート プレートの左上の隅は A1
    2. 。
  2. 、新しい 96 ウェル PCR プレート (プローブ) の各ウェルに表 6 に示すコンポーネントを追加します。対応する、マルチ チャンネル ピペットを使用してそれぞれ 7.5 μ L の PCR の製品 (DNA テンプレート) を追加します。シーリング テープでプレートをカバーします
    。 注: 転写反応あたり追加の PCR の製品の最適な量は 0.5 〜 1 μ g 間する必要があります。大幅に弱いゲルのバンドより強烈な DNA 反応に追加のボリュームが調整できます。正確な量は重要ではありません
    3. 。 3.5 4 h. ミックス 15 μ L 合成プローブの 35 μ L の DEPC 処理 ddH 2 O、125 μ L 100 のため、
  3. は 37 ° C でプローブ プレートを孵化させなさい %etoh と 5 μ L の 3 M NaOAC (pH = 5.2、RNase フリー)。少なくとも 30 分遠心分離機-80 ° C で保存や洗い場として手順 1.10.2 および 1.10.3
    4. 。 25 で沈殿したプローブを再懸濁します
  4. μ L の DEPC 処理 ddH 2 O を実行 5 μ L 1% アガロースゲル (実行時間 < 20 分) プローブ ( 図 2) の整合性を確認するためです
    。 注: agarose のゲルは、DEPC 処理 ddH 2 O および TAE バッファーを行わなければなりません。RNA のゲルの電気泳動装置を割り当てる必要がありますのみ動作します。電気泳動の間に RNA の劣化につながることができます長いゲルの低速で時間を実行します
    5. 。
  5. は、100 μ L 交配ソリューション (表 7)-80 ° c まで必要なストアと合成プローブの残りの 20 μ L をミックスします
    。 注: プローブの濃度は、バンドが特に堅牢な ( 図 2 を参照の例) 場合より希釈することができます。交配の解決策は、RNase の混入の防止に非常に効果的です。すぐに RNA の劣化を避けるために再懸濁のプローブをハイブリダイゼーション ソリューションを追加します。交配ソリューションは、0.2 μ m フィルターで濾過します。組織サンプルのトリトン X 100 を 0.3% の最終的な集中に追加してハイブリダイゼーション液の洗剤濃度を向上します
    6. 。
の の
コンポーネントボリューム最終濃度
DEPC 処理 ddH2O11.85 ml23.7%
20 X SSC12.5 ml25% (5 X)
50%ホルムアミド25 ml
ヘパリン (50 mg/ml)0.1 ml0. 2% (0.1 mg/ml)
サケの精子単一鎖 DNA0.5 ml1.0%
トゥイーン 200.05 ml0.1%
合計50.00 ml100%
< p クラス ="jove_content"fo:keep-together.within-ページ =「1」> 表 7: 交配ソリューション

。

3. ショウジョウバエ 飼育し胚, 幼虫および成虫の組織コレクション

。

注: 小規模 (ボトル)、質量 (ボックス) 飼育を飛ぶ、25 ° C を維持適切な成虫・幼虫密度で基づくコーンミール料理に飛ぶ実験室の標準のプロトコルを使用して、食品に追加アクティブな酵母粉末を提供サーフェス

。
  1. 収集胚次の標準的なプロトコル。胚のコレクションの主な手順は、 図 3 に示す.
    注: devitillinized 胚をメタノールで洗浄後、固定胚保存できます-20 ° C で 1 年間。魚のプロトコルの 1 日目に胚の透過とポスト固定が実行されます
    2. 。
  2. PFA 準備新鮮な 40% 原液。 DEPC の 10 mL を混合することによって 40% パラホルムアルデヒド (PFA) の
    1. をたて準備原液処理 ddH 2 O PFA と小さな攪拌バーを含む 20 mL バイアル シンチレーションで 2 n 島の 70 μ の 3.68 g
      注意: PFA は潜在的な急性および慢性の健康への影響と毒性の高いです。MSDS (安全データシート) を読むし、目、皮膚、気道に適切な保護を使用します
      2. 。
    2. ヒューム フード熱し、PFA は完全に溶解するまで、200 ° C で加熱プレート上で 3-5 分間バイアルをかき混ぜます。PFA は解散し同時に暑さから PFA 原液を削除 (過熱しない).
    3. 40 %pfa の原液の氷上で 5 分間溶解を冷却し、0.2 μ m フィルターと 10 mL の注射器にフィルターを適用します
      4. 。
  3. 3 令幼虫 (L3) または大人のティッシュの固定、焼入れ、透過
    注: このプロトコルは 1 日で完了する必要があります。それはティッシュを含んでいる解剖、固定、内因性の HRP、透過およびポスト固定の焼入します。
    1. 準備の固定解決 (修正-私は、修正プログラム II) 表 8 に従って
      。 注: 組織が保持する必要がある繊細な構造を持つ場合、ピクリン酸が追加の定着剤として使用をされます。組織の微細構造は、電子顕微鏡検査 (EM) のために保持する必要がある場合よい定着剤ではありません
      。 警告: ピクリン酸は不安定なので、他の材料と反応して爆発性化合物を作成する機能があります。使用し、安全性のガイドラインに従って格納します
      2. 。
    2. 場所の幼虫や成虫 10 mL の PBS X 冷 1 と修正プログラムの 100 μ L を含む 50 mL プラスチック チューブに-私のソリューションです。チル幼虫や大人のフライ運動を減らすために 2 分間氷の上
      3. 。
    3. 2-3 mm の開口部を作成する 1 mL プラスチック チップの先端をカットします。10-30 幼虫を転送したり、大人は 50 mL のチューブ (ステップ 3.3.2) から 1 × PBS の浅い層でシャーレ (直径 9 cm) に 1 mL 先端で飛ぶ。PBTT のビットを追加すると、表面張力を減らすことができます。慎重に解剖幼虫 (前方から開き、前方に後方からのティッシュを絞る) または切り裂くスコープ下でシャープな鉗子のペアと利子の成体
      。 注: 約 200-300 の幼虫または成人精巣解剖でき経験豊富な個人によって 1 日で固定します
      4. 。
    4. 転送 1.5 mL チューブに氷上店 (開く直径 2 mm を作成するカットの先端) を 200 μ L ピペットを持つ組織を解剖しました。次のステップに進む前に 10-15 分以内の郭清の各ラウンドを完了します
      。 メモ: は十分な材料を生成するために必要 (2 h 時間ウィンドウ) 内の追加のラウンドに進みます
      5. 。 修正プログラムの
    5. 修正組織 800 μ L-私ベンチ トップ ミキサー上で 30 分のためのソリューション。リンス組織 800 μ L で 1 PBTT を X し、2.5 h の 30 分のための最大の氷の上の管を保つ制限、このニーズに十分な組織が収集されるまで、batch-wise になります
      6. 。
    6. ふたにメッシュを含む単一の 15 mL プラスチック チューブにすべて解体、固定組織のプール (管の設計は、 図 4 を参照)。チューブのふたにメッシュを通して余分な液体を吸引します。3 X 5 分各 10 mL で 1 X PBTT を洗ってください。1x PBS 洗浄剤 10 mL で 2 回すすぎます。これは次のステップでの過剰な泡を防ぐことができます
      。 注: 切り裂かれたティッシュは、管の底に沈む場合の手順で行えるように正規のマイクロタイター プレートまたは 0.5 1.5 mL 容マイクロ チューブ (管あたり 300 800 μ L のボリューム).
    7. は、もう一度 0.3% H 2 O 2 PBS で RT。 の繰り返しで 15 分間 5 mL で内因性の HRP 活性をクエンチします。混合せずこのステップの間に開く蓋をしてください。1 X PBTT の 10 mL を 2 回使用してリンスします。1 X PBTT の 10 mL で 5 分間 2 回洗って
      8. 。
    8. は潜伏期間中に 2 回 10 分反転-20 ° C で 10 ml のアセトン 80% (-20 ° C、中古冷蔵) の組織をチューブを permeabilize します。組織の水分補給を 1 X PBTT の 10 mL で 10 分を 2 回洗浄します
      9. 。 ソリューション 5 ml PBTT プラス 5 ml 交配の 10 mL の混合物
    9. リンス (1:1). ミックスを破棄し、10 ml の交配によるソリューションに置き換え。サンプルは、必要になるまでの-20 ° C で保存できます。最高の結果を得るには、1 週間以上のサンプルを保存しない
      10. 。
は、 する
コンポーネントII (10 ml) を修正私 (10 ml) を修正
PFA 株式 40%1 ml1 ml
PBTT8.99 ml9 ml
ピクリン酸溶液10 μ l-
< p クラス ="jove_content"fo:keep-together.within-ページ =「1」> テーブル 8: 組織のソリューションを修正します

。

4 in situ ハイブリダイゼーション

注: プロトコルのこの部分サンプル準備と 2 日の最小値が必要です、前の雑種と交配を取って日 1 とプローブの検出に。2 日目。サンプル数は、プロトコルに不慣れな場合、比較的高い場合、丸一日では不可能なプロトコルはプローブ検出と信号増幅の 2 日間に分かれての手順を 3 日以内に行わなければなりません。多数の胚または解剖組織サンプルを処理する追加の日もあります。切り裂かれたティッシュのサンプル、特に明記しない限りすべての手順で 1 X PBTT と 1 X PBT を置き換えます。余分な洗剤が、脳や精巣など多くの幼生及び成体組織の浸透のため必要です。ただし未テスト、1 X PBTT も胚の使用可能性があります。96 ウェル プレート、1.5 mL チューブ用 800 μ L/ウェル 100 μ L を使用します

。
  1. 前の雑種と交配
    注: 手順 4.1.1-4.1.6.2 は、胚 の in situ ハイブリダイゼーション。交配 その場で 幼虫や大人のティッシュのこれらの手順をスキップします。
    1. 新しい 15 mL チューブに固定胚 (-20 ° C でメタノールに格納) の削除 2 mL。洗うたびにメタノール 10 mL で 7 分のため 2 回の胚を洗います。ワシントン州sh 7 分 10 mL メタノールと 1 X PBTT (1:1) の混合物のための胚。水分補給を 1 X PBTT の 10 mL で 7 分のため 2 回の胚を洗うです
      2. 。
    2. 胚の透過性、希釈原液 (20 mg/mL) から 1: 500 で中間プロティナーゼ K 液 (40 μ L/mL) を準備します。-20 で店 ° C. 作る中間プロティナーゼ K ソリューション 1/15 2.667 ug/mL の濃度に最終的な作業のための 1 X PBTT で希釈することによって作業プロティナーゼ K ソリューションです
      3. 。
    3. 作業プロティナーゼ K ソリューション (以下、胚数の少ない使用) 10 mL を Permeabilize 胚。13 分軽く反転チューブ 4 回孵化中の RT でチューブを孵化させなさい。混合せず 1 時間氷上プロティナーゼ K ソリューションのサンプルをインキュベートします
      。 注: 希薄プロティナーゼ K のこの比較的長い孵化により再現性をもって均一透過しその後染色します
      4. 。
    4. 胚を permeabilize 中に、は、2 mg/mL 10 X の在庫 (20 mg/mL) からグリシン ソリューション 30 mL の容量の 1 X PBTT.
    5. 削除, プロテイナーゼ K ソリューションはグリシン溶液 (2 mg/mL) 10 mL で洗い、2 分を 2 回洗浄します。グリシンを削除する 1 X PBTT 10 mL で 3 回すすぎ
      6. 。
    6. 胚のポスト固定。
      1. 10 ml 4% の PFA (40 %1 mL PBTT、9 mL に PFA を 0.45 μ m のフィルターを通してフィルター).
      2. 4% のサンプルをインキュベート PBTT と 2 分 20 分洗浄 3 X PFA
        3. 。 変性交配ソリューションを準備する
      3. は、ハイブリダイゼーション溶液 5 分間ゆでます。全 96 ウェル プレート 12 mL の 3 本のチューブを使用します。すぐに 5 分間氷の上クールな
        4. 1 X PBTT 10 mL で一度
      4. リンス胚: 交配ソリューション (1:1)。ハイブリダイゼーション溶液 5 mL で 2 回すすぎます。Μ L 〜 20 分注の井戸あたり胚 (胚 30-40) を解決または氷の上 96 ウェル PCR プレートに組織を固定します。組織または 8 チャネル マニホールド ピペット ( 図 1 /ビデオ) を用いた胚から交配ソリューションを削除します
        。 注: マニホールドのピペットは、‘ 停止 ’ 井戸の底に行くと削除のサンプルからヒントを防止します。フロート部組織を用いた実験、上から 100 μ L ピペットと慎重に液体を削除します
        5. 。
    7. 各ウェルに変性交配ソリューションの追加 100 μ L。金属ビーズ (材料と 図 1 を参照) を含む乾燥浴室暖房ユニットを使用して 56 ° C で 2.5-3 h の最小値のための胚を交配済み
      8. 。
    8. 変性 100 μ L 準備の 5 分間 5 分間氷の上の 80 ° c. すぐにクールで、たちを使用して 96 ウェル PCR プレートにプローブ。胚または組織から事前交配ソリューションを削除します。変性遺伝子特異的プローブ各サンプル、シーリング テープでカバーし、ユニットを加熱乾燥風呂に金属ビーズの下で 16-18 h O/N、56 ° C で交配を追加

5。プローブの検出

  1. 前暖かい 56 ° C 加熱装置に表 9 のソリューション。プレートからプローブを削除します
    。 注: と、プローブは間再利用することができます 2 〜 3 回-80 ° C (-20 ° C の任意の RNA のサンプル ストア決して) で格納されている場合。交配後二重鎖 RNA は一本鎖 RNA より安定して、RNase の混入による劣化を受けにくいします
    。 使用して場合、ウェル プレート真空ろ過システム プローブ (アセンブリの詳細については、ビデオを参照してください) を収集するためにフィルター プレートの下の組織までコレクション プレートを含める必要があります。交配させられた組織は、各井戸の底に 1.2 μ m 孔サイズ PVDF 膜に交配に使用通常 96 ウェル マイクロ プレートから転送する必要があります
    2. 。
< tr >
ステップソリューション (56 ° C) で加温時間井戸あたり量
1交配ソリューション: PBTT (3:1)15 分100 μ l
2交配ソリューション: PBTT (3:1)15 分100 μ l
3交配ソリューション: PBTT (1:1)15 分100 μ l
4交配ソリューション: PBTT (1:3)15 分100 μ l
5PBTT 3 洗浄5 分100 μ l

テーブル 9: プローブをハイブリダイゼーション後洗浄します

。
  1. 通常版、56 で加熱装置のテーブル 9 に従って洗浄サンプルを使用して場合 ° C [真空マニホールド システムを使用してベンチ上の真空システムと温水のソリューションを使用して、真空によって下からすぐにソリューションを削除します。1 X PBTT で第 3 回洗浄後通常のプレートを加熱から削除できるユニット
  2. 準備抗体。
    1. 準備 11 mL の在庫 (1 mg/mL) ビオチン化マウス モノクローナル抗 DIG 抗体を希釈してから一次抗体溶液 (2.5 μ g/mL) (マテリアル リストを参照してください) で PBTTB (1: 400)。少ないサンプルを処理している場合は、それに応じてボリュームを調整します
      2. 。
    2. 準備 11 mL の在庫 (1 mg/mL) 1: 1000 ストレプトアビジン-HRP を希釈してからストレプトアビジン-HRP 溶液 (1 μ g/mL) は共役 PBTTB で (マテリアル リストを参照してください)。少ないサンプルを使用している場合は、それに応じてボリュームを調整します
      3. 。
  3. 胚または室温ベンチ トップ ミキサー上で 20 分間 PBTTB (1 X PBTT で 1% スキムミルク) 組織ブロック
    注: フィルター PBTTB 96-well プレートでフィルターの目詰まりを避けるためにそれを使用する前にフィルター紙 (グレード 3、6 μ m) を使用します。PBTB、PBTTB ではなく (0.3% の追加と PBTB トリトン X 100) プロトコルの中にすべての組織の使用します
    4. 。
  4. 加温胚または組織抗体溶液 (100 μ L/ウェル) ベンチ トップ サンプル ミキサー上で 2 時間。1 で二回リンス x PBTTB。3 を洗って 5 分、5 X PBTTB と 10 分間 X。ストレプトアビジン-HRP 溶液 (100 μ L/ウェル) ベンチ トップ サンプル ミキサーを使用して 1.5 時間で組織または胚孵化させなさい。洗って 2 PBTTB 5 分 X。このポイントから暗闇の中でサンプルを保つ
    。 注: すべての抗体の洗浄中にミルクによって生成される不透明度による組織が失われている、なら、ミルク (PBTTB ではなく PBTT) なし洗濯
    5. 。
  5. 希釈 100 DAPI 溶液を調製 PBTTB (1: 100) で X DAPI です
    6. 。
  6. 加温胚または DAPI 溶液 (100 μ L/ウェル) ベンチ トップ サンプル ミキサーで 15 分間で組織。4 を洗って 10 分 X PBTT と。サンプル O/N 4 ° C で 96 ウェル プレートを保存したり、次のステップに進んでください
    。 注: 手順ここで休止できます
    7. 。

6。パスチラミドシグナルを使用して抗体の検出 ( 図 5 参照)

注: ここで自家製シアニン 3 共役パスチラミドシグナル、使用されたに記載されているプロトコルによると、準備された 12.場合は、多くのサンプルをテストまたは多くの実験を実行これはお金のかなりの量を保存、商業試薬と比較した効果的な (経験) から。少ない実験、サンプル、市販のシアニン 3 パスチラミドシグナルを使用できます (マテリアルを参照してください).

  1. 洗浄サンプル鋼板 5 分 3 X 1 X PBTT.
  2. PBTT (希釈 30% (w/w) H 2 O 2 ストック 1: 5000) で H 2 O 2 の 0.006% を含む準備パスチラミドシグナル活性化バッファー (活性化バッファー).
    3. < l私 > 活性化バッファーでプレートをすすいでください。
  3. 15 mL チューブに活性化バッファーで希釈して準備シアニン 3 パスチラミドシグナル ソリューション。
    1. 胚、ホームキット希釈 (11 mL の活性化バッファーのシアニン 3 パスチラミドシグナルの 137 μ L) を使用します。幼虫組織希釈 1: 150 (11 mL の活性化バッファーのシアニン 3 パスチラミドシグナルの 73 μ L) を使用します。成人の精巣、希釈 1: 200 (11 mL の活性化バッファーのシアニン 3 パスチラミドシグナルの 55 μ L) を使用します。大人の卵巣、希釈 1: 300 (11 mL の活性化バッファーのシアニン 3 パスチラミドシグナルの 36 μ L) を使用します
      2. 。
  4. ベンチ トップ サンプル ミキサー上で 2 時間シアニン 3 パスチラミドシグナル ソリューションのサンプルをインキュベートします。PBTT で 4 倍を洗い流してください。6 を洗って 10 分 X PBTT と。洗浄 3 X 5 分洗剤を削除する PBS と
    5. 。
  5. 耐フェードの追加 150 μ L/ウェルは、メディアをマウントします。組織または胚はチューブの底に沈むことを許可する 4 ° c O/N のサンプルを保ちます。(の下で組織の範囲を切り裂く) 顕微鏡のスライドのサンプルをマウント、coverslip でカバーします。透明なマニキュアでカバーガラスの端を密封します
    6. 。
  6. 蛍光顕微鏡を用いたイメージ
    。 注: 分析のアイデアを取得する最初のネガティブ コントロール ‘ 非特異的 ’ 背景。

結果

図 6は、この手順を使用して得られた結果の例を示します。トップ 3 のパネルを表示初期ショウジョウバエ胚 (図 6A ~ C のパネル)、次の 3 の例パネル例後半の信号とショウジョウバエの胚 (amnioserosa、筋肉、中枢神経系の各組織のそれぞれ (図 6、パネル D F)。次に、3 日齢から例幼虫組織 (図 6パネル G J)。K と L パネル表示アダルト生殖腺から代表的なイメージ (卵巣と精巣、それぞれ)。画像の数百をアップロードして注釈を検索私たちの '蛍光その場でフルーツ フライ database' (FlyFISH (http://fly-fish.ccbr.utoronto.ca))。

figure-results-1
図 1。その場で蛍光交配 (魚の) プロトコルおよびキー装置の概要。(A) cDNA の PCR の拡大。特定遺伝子のアンチセンス掘る-を生成する(B) の in vitro転写 96 ウェル プレート (b に示すようにプレートの写真) の RNA プローブを分類しました。(C)および(D):大人 (女性: 男性比率 2:1. 300-400 ハエ/ボトル) ハエの 3-4 日間チームメイトに同伴します。25 ° C で標準的なコーンミール料理に一晩コレクションから胚は換気の良いプラスチック ボックスに転送されます (1 L サイズのコンテナーにコーンミール料理: 8"X 8"× 3"LWH) または適切な幼虫の密度を維持する新しいボトルに。組織コレクションのアクティブな酵母粉末は 24、48 h (AEL) 産卵後に食品の上に振りかけられる必要があります。(H E):蛍光の in situハイブリダイゼーション実験では、以上 3 日間連続実行されます。8 ch 吸引 (写真 c)、写真 b のように胚またはフロートしない組織は、96 ウェル PCR プレートを使用します。フロート、幼虫のほとんどのティッシュのような組織フィルター底プレート (写真 d) を使用し、低圧 (写真 e) を使用して吸気アスピレータで下から液体を削除します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

figure-results-2
図 2。RNA プローブの収穫の決定。1% の agarose のゲル (5 μ L/レーン) に観察されるアンチセンス RNA プローブを合成しました。収量は、(バンドの強度に基づいて) 分類できます '低収量' 3 と 10 レーン、レーン 1、4、5、6、8、' 典型的な収量' または '高収率の 2、7、9、11、および 12 の車線として。'典型的な収穫」のサンプル、各現場で実験のため交配ソリューションの 100 μ L で希釈したプローブの 10-15 μ L を使用します。'プローブ' 強度に対するバンド強度に従って追加交配ソリューションとプローブの '高収率」でサンプルを希釈します。各ウェル内のほぼ最終的なプローブ濃度を持って目指してください。矢印は RNA プローブの 1 つ、各レーンに高いバンドは元の DNA のテンプレートです。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

figure-results-3
図 3。主要な大規模な胚のコレクションおよび固定のための手順を実行します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

figure-results-4
図 4。幼虫または浮動の組織から液体を除去するため自家製管します。いくつかの幼生及び成体組織固定中のソリューションのフロートします。このシンプルなツールは、続いて 1 mL 先端を吸引器に接続するアダプターとして先端をカット 200 μ L で開催されたナイロン メッシュで構成されます。液体は、任意の組織を失うことがなく安全に削除できます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

figure-results-5
図 5。パスチラミドシグナル信号増幅します。(アンチセンス RNA プローブを 1) 掘るラベルは、内因性感覚 RNA と交配させます。(一次抗体のビオチン化と掘る UTP 2) 免疫親和性結合。(3) HRP 標識ストレプトアビジンビオチン バインド。(HRP 4) は、短命のシアニン 3 パスチラミドシグナル ラジカルを形成するシアニン 3 パスチラミドシグナルと過酸化水素の反応を触媒します。(シアニン 5) 3 パスチラミドシグナル ラジカルは、近く蛋白質チロシン残基にバインドします。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

figure-results-6
図 6。代表の in situハイブリダイゼーション画像。各パネルは、異なる RNA (シアンで表示) と核の染色 DAPI (赤色で表示) の例を示します。(A ~ C)ショウジョウバエの初期胚の例です。(D, F)ショウジョウバエの後期胚の例です。(G J)第 3 の例はショウジョウバエ幼虫組織令 (malphigian 細管、腸、唾液腺、筋肉それぞれ)。(K) 大人の卵巣。(L) 成人の精巣。各パネルにプローブを交配遺伝子の名前が表示されます。スケール バー = 10 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

ディスカッション

記述のプロトコルは、固定のショウジョウバエの胚または組織のほとんどの Rna の検出のための再現性、高感度、・経済的な方法を提供します。もっと昔からアルカリホスファターゼ プローブ検出法より少し複雑、魚によって得られる解像度がはるかに大きいと感度が同等または強化された7,8。全体または部分的なマイクロタイター プレートを使用して、プロトコルは、大規模なまたは限られた興味の遺伝子解析に使えます。生成されたプローブで検出可能性があります、複数のトラン スクリプト スプライス フォーム プローブは具体的には設計されていない限り、それは注意してください (すなわち、単一エクソン)。我々 は合理的な成功を収めて 200 ヌクレオチドのような小さなプローブをテストしている、小さいプローブをより少なく有効にする傾向がある、特定性の低い可能性があります。明らかに、このプロトコルは、エクソン、小さなイントロンの検出には適していませんまたはマイクロ Rna を処理します。

このアプローチでは、酵素のステップを使用して、信号の強度を高めるが、ターゲット遺伝子の発現発現レベルの比較的線形および広い範囲に比例すると信号強度が表示されます。高倍率で信号が涙点や斑点として見られている細胞や組織内。比較的まれな成績のためだけにいくつかの小さな涙点が見られています。トラン スクリプト豊富なるにつれて、これらは、数とサイズに成長します。単一分子魚 (smFISH) と同様単一の小さな涙点は単一の Rna に対応するものがまた容易に定量化するイメージングおよび情報ソフトウェアを使用しています。同じターゲットのキュレーションが我々 の画像と smFISH を使用して得られる公開された画像の比較では、これはより厳密な比較によってテストされる必要がありますが全体的に、感度と解像度の 2 つのメソッドは比較的同様に、示唆しています。SmFISH の非常に高い出費を考えると、ここで用意されているメソッドは、コストのほんの一部で同様の結果を与える必要があります。しかし、目標を小さな成績証明書または成績証明書の異なる部分を検出する場合は、smFISH をお勧めします。

いくつかの魚のプローブの小さなサイズのため、このメソッドは大規模なまたは重要な障壁貫通の組織の方もあります。ただし、高い洗剤レベルと組織の固定・透過の引っ張ることの私達の使用はこの問題を解決しているに表示されます。最後に、ショウジョウバエのティッシュの開発が、切り裂かれたティッシュのここで説明した高洗浄バッファーもショウジョウバエの胚と同様に他のほとんどの生物や組織のために動作するはず。

開示事項

著者は競合する金融興味を持ってないです。

謝辞

HMK (モップ 133473 付与) 健康研究のカナダの協会に助成金によって提供されたサポートはこのプロジェクトのための資金調達。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
15 ml ポリプロピレン円錐形遠心分離管Frogga BioTB15-500認定 DNase および RNase フリー
2x PCR マスターミックス 染料 (Ambiogene)Biomart (カナダ)141106-1K認定 DNase および RNase フリー
50 ml ポリプロピレン円錐形遠心分離管Frogga BioTB50-500認定 DNase および RNase フリー
96 ウェルろ過プレート (1.2 um、親水性 PVDFメンブレンEMD MILLIPOREMSBVS1210フロッティングティッシュ
96ウェルPCRプレート(200 μl)デンビルC18096-10
アクロディスク シリンジ フィルター (0.2 u)PALLPN4612
アクロディスク シリンジ フィルター (0.45 u)PALLPN4614
アガロースバイオショップAGA002.500
AXYGEN 96 ウェル アッセイ ストレージ プレートUltiDent Scientific24-P96-450V-C細菌性グリセロール ストック
AXYGEN アルミニウムプレートシールUltiDent Scientific24-PCR-AS-200To seal plates
AXYGEN Wide-bore tips (200 ul)UltiDent Scientific24-T205-WB-CTo transfer samples
Biotin-SP (long spacer) IgG Fraction Monoclonal Mouse Anti-DigoxinJackson ImmunoResearch Lab200062156in situ (ストック濃度 1 mg/ml, ワーキング濃度 2.5 μg / mlまたは1/400希釈。
ブランド 8チャンネルマニホールド(オートクレーブ可能)BrandTech Scientific Inc.70452696ウェルPCRプレートの上部から液体を除去するには
、クロラムフェニコールSigma-aldrichC1919濃度34 mg / mlを溶解し、0.2μ;100% EtOHでろ過されたm(1/1000として使用)
シアニン3チラミド(Cy3-TSA)自家製Perkin-Elmer Cat#から注文することができます#SAT704A001EA
DABCO(1,4-ジアザビシクロ[2.2.2]オクタン)Sigma-aldrichD2522封入剤中の退色防止試薬
Digoxigenin-11-uridine-5'-三リン酸ロシュ11-209-256-910
胚収集ケージホームN/Aサイズ:ポリメチルメタクリレートで作られている 75cm×75cm×75cm
ッペンドルフ5804A-Z-DWPローター上の96ウェルプレート用遠心分離機
ホルムアミドバイオショップFOR001.500
グリセロールバイオショップGLY002.4
グリシンバイオショップGLN001.500
パリンSigma-AldrichH4784-250MGストック:50 mg/ml. ハイブリダイゼーション溶液中の作業濃度 1 mg/ml
ラボアーマービーズDiaMedLAA42370-001加熱ユニットの充填
Labnet Gyro M Mini Nutating MixerFisher Scientific50-998-347サンプルミキシング
メッシュ - 100 miconsFlyStuff57-103胚収集用
メッシュ - 800 ミクロンSEFAR -Nytex06-780/53ゆるいティッシュを捕まえるため/図4の特殊チューブに使用できます。
マイクロカバーメガネVWR48366-067サイズ:22 X 22 mm
マイクロスライド、frstdVWR48312-003サイズ:25 X 75 mm
マルチウェルプレート 真空マニホールドポールコーポレーションP/N 501796ウェルフィルタープレートの底から液体を除去
パラホルムアルデヒド(PFA)バイオショップPAR070.500固定
PCRマシンバイオ・ラッドモデル:DNAエンジン PTC-20096ウェルプレート PCRおよびプローブ変性
ピクリン酸溶液Sigma-aldrich80456組織固定用 I溶液
塩化カリウム (KCL)BioshopPOC308
PP 96ウェルプレート用蓋、100/ケースUltiDent Scientific24-P-LID-PPプレート保存用蓋
Progene 使い捨て試薬リザーバー (50 ml、滅菌)UltiDentScientific825-1-50-5Sリキッドハンドリング
Progene ピアス可能なアルミホイルUltiDent Scientific87-CFILM-ALシール 96ウェルプレート、DNaseおよびRNaseフリー
プロテイナーゼKSigma-aldrichP2308- 5MG胚透過化
リボロック リボヌクレアーゼ阻害剤Thermo ScientificEO038140 Unit/ul
リボヌクレオシド三リン酸(NTP)セットロシュ11277057001RNAプローブsythesis
RNaseフリーウォーターGIBCO10977015-500mlRNAプローブsythesis
RNaseZapAmbionAM9780RNase汚染の除去
本鎖DNASigma-aldrichD9156ハイブリダイゼーション溶液用
スキムミルク(無脂肪電力)BioshopSKI400.500ワーキング濃度は、ブロッキング試薬として1 X PBTまたはPBTTの1%です
酢酸ナトリウム(NaOAc)3 M、pH = 5.2(RNaseフリー)BioshopSAA333ワーキング濃度は、DNAまたはRNA沈殿
SP6 RNAポリメラーゼ ThermoScientificEP013120 Unit/ul
Stainless Steel Shot for Sand BathVWR13259-274.暖房ユニットを充填するには
実体顕微鏡&グースネック光源ライカモデルMZ6組織解剖とマウンティング
ストレプトアビジン、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)コンジュゲート分子プローブS911二次抗体ストック:1 mg/ml、1/1000希釈(1 μg/ml) を in situ に使用しています。
T3 RNAポリメラーゼThermo ScientificEP010120 Unit/ul
T7 RNAポリメラーゼThermo ScientificEP011120 Unit/ul
チップステーション (10 ul)AxygenT-300-STK-SCertified DNase and RNase free
Tip station (200 ul)Sorbio27770TCertified DNase and RNase free
Tips ( 1ml)Sorbio10200CertifiedDNaseおよびRNaseの自由な
TRITON X-100BioshopTRX506働く集中はティッシュのその場Tween 20のための1 X PBTの0.3%である
BioshopTWN510働く集中は胚のin situ Whatmanの質的な濾紙のための1 X PBTの0.1%である
グレード3Sigma-aldrichWHA1003917
NameCompanyカタログ番号コメント
SolutionsPreparation
DABCO(1,4-ジアザビシクロ[2.2.2]オクタン価)グリセロール退色防止封入剤DABCO(1.25 g)、グリセロール(35 mLまたはv/v 70 %)および1 X PBS(15 mlまたはv/v 30 %)。寒い部屋で暗く、岩を保ちます。-20°Cで保管します。C
1 X PBT (1L)1 X PBS と 1 ml Tween 20 (0.1 %)
1 X PBTT (1L)1 X PBS と 1 ml Tween 20 (0.1 %) と 3 ml の Triton-X-100 (0.3 %)
1 X PBTB (1L)1 X PBTB (1L)%
1 X PBTT にスキムミルク
ストック製 エモデルヘ サケ精巣からの 一、1

参考文献

  1. Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nature Rev Genet. 10, 57-63 (2009).
  2. Tautz, D., Pfeifle, C. A non-radioactive in situ hybridization method for the localization of specific RNAs in Drosophila embryos reveals translational control of the segmentation gene hunchback. Chromosoma. 98, 81-85 (1989).
  3. Hughes, S. C., Krause, H. M. Double labeling with fluorescence in situ hybridization in Drosophila whole-mount embryos. Biotechniques. 24, 530-532 (1998).
  4. Lecuyer, E., et al. Global analysis of mRNA localization reveals a prominent role in organizing cellular architecture and function. Cell. 131, 174-187 (2007).
  5. Kosman, D., et al. Multiplex detection of RNA expression in Drosophila embryos. Science. 305, 846-846 (2004).
  6. Raap, A. K., et al. Ultra-sensitive FISH using peroxidase-mediated deposition of biotin- or fluorochrome tyramides. Human Mol Genet. 4, 529-534 (1995).
  7. Lecuyer, E., Parthasarathy, N., Krause, H. M. Fluorescent in situ hybridization protocols in Drosophila embryos and tissues. Methods Mol Biol. 420, 289-302 (2008).
  8. Wilk, R., Murthy, S. U. M., Yan, H., Krause, H. M. Current Protocols Essential Laboratory Techniques. , Wiley Online Library. Vol. 9.3.1-9.3.24 1-9 (2010).
  9. Holt, C. E., Bullock, S. L. Subcellular mRNA Localization in Animal Cells and Why It Matters. Science. 326, 1212-1216 (2009).
  10. Martin, K. C., Ephrussi, A. mRNA Localization: Gene Expression in the Spatial Dimension. Cell. , 719-730 (2009).
  11. Wilk, R., Hu, J., Blotsky, D., Krause, H. M. Diverse and pervasive subcellular distributions for both coding and long noncoding RNAs. Genes Dev. 30, 594-609 (2016).
  12. Zhou, X. L., Vize, P. D. Proximo-distal specialization of epithelial transport processes within the Xenopus pronephric kidney tubules. Dev Biol. 271, 322-338 (2004).

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