Thy1を用いた一次体性感覚野における神経活動のイメージング-GCaMP6s トランスジェニック マウス

サマリー

Thy1で二国間一次体性感覚 corticies (S1) 上記デュアル光学窓から神経細胞の活動を測定するための実験手順について述べる-2 光子 (2 P) 顕微鏡による生体内でを使用して GCaMP6s トランスジェニック マウス。

要約

哺乳類の脳は、矢状面でマークされた対称性を表わします。ただし、大人の哺乳類動物の対称の脳領域におけるダイナミクスの詳細な説明は、とらえどころのないままです。この研究でThy1で二国間一次体性感覚 corticies (S1) 上記デュアル光学窓からカルシウム動態を測定するための実験について述べる-(2 P) 2 光子励起顕微鏡を用いた GCaMP6s 遺伝子改変マウス。このメソッドは、長期間体内実験では同じ時に録音と二国間のマウス脳領域の 1 つにおける神経活動をできます。1 時間以内に完了することができます、このメソッドの重要な側面には、デュアル光学ウィンドウ、および 2 P の画像の使用を作成するための低侵襲手術の手順が含まれます。我々 のみ S1 領域の技術のデモンストレーション、メソッドは脳神経回路網の構造と機能の複雑さの解明を促進する生きている脳の他の領域に適用できます。

概要

カルシウムとその制御複数の生理学的プロセスを調停する際に不可欠です。カルシウム動態を監視、脳疾患^{1,2,3,4,5,6 の病理学の条件と同様、正常な脳機能を理解するために役立ちます ,7,8}。GCaMP6s 蛍光イメージングはタイミング、スパイク数を定量化するための強力なツールで、シナプスのレベルと同様、周波数、入力の in vitroとin vivoの^9,10,11。

哺乳類の脳は、矢状面でマークされた対称性を表わします。ただし、最近の神経学的研究は皮質の改造に光を当てるし、神経細胞の活動によって引き起こされる外傷性脳または脊髄損傷^6、7役割をそのまま組織の対称的に対応する地域再生します。回復はまだはっきりしません。

この研究では、我々 は生体内イメージングのための二国間の対称光学ウィンドウを作成する実験の手順を説明します。これらの光学ウィンドウを使用すると、述べる一次体性感覚野 (S1) からカルシウム動態の測定 2 P 顕微鏡を用いた GCaMP6s 遺伝子改変マウスで。[結果] セクションで、生体内の樹状突起形態 2 P イメージングを用いた EGFP トランスジェニック マウスにおける S1 領域で異なる時点でまた示します。普通の大人の哺乳類の脳における情報処理ローカルと対称をプローブする神経科学者を助けるどのようにデュアル オープン頭蓋 windows の最初の例が、二国間の S1 の領域におけるネットワーク ・ ダイナミクスに関する観察法条件または別の病気での生体のモデルします。

プロトコル

すべての手術と動物の取り扱い手順を行ったガイドの下世話と実験動物の使用 (国立研究評議会)、インディアナ大学学校の医学機関動物ケアと使用のガイドラインを承認しました。委員会。2 光子イメージング セットアップの模式図を図 1に示します。

1. イメージングのため動物の準備

1. オートクレーブ手術器、綿棒、滅菌ガーゼを手術エリア (表 1) に配置します。手術器具の滅菌を intersurgery 用マイクロ ビーズ殺菌装置を入れます。
2. ケタミン (17.2 mg/mL)、キシラジン (0.475 mg/mL) とアセプロマジン (0.238 mg/mL) (6 μ L/g 体重) の混合物 (i. p.) 腹腔内投与によるマウス (男性または女性、1.5-2.5 ヶ月、20-25 g) を麻酔します。動物つま先ピンチ刺激に応答しないし、角膜反射がない適切な麻酔深度に達するまで待機します。外科の間にブースター用量を与える元の麻酔状態を維持するために必要な麻酔薬としてカクテルの量 1/3 の。
3. ブプレノルフィンを皮下注入 (サウスカロライナ; 0.05-0.10 mg/kg) 術前鎮痛剤として。角膜の乾燥と白内障の形成を防ぐためには、動物の目に保護軟膏を適用されます。
4. 低体温症を防ぐため、滅菌手術用覆布でそれをカバーし加熱パッドの GCaMP6s トランスジェニック マウスを配置します。マウスの頭を保持しているアダプターと動物の頭を安定させます。
5. ダブル エッジかみそりの刃で頭皮のほとんどの頭部を剃る。外科領域で準備の滅菌アルコール パッド後ポビドン ヨード液に拭き取ります。

2. 慢性頭蓋ウィンドウ準備

1. 頭蓋骨の片側 (右) にはさみのペアで頭皮 (2 mm × 3 mm) の長方形カットを作る。脇の露出領域を作成して綿棒で皮膚をプッシュ > 3 mm 直径 (図 3 a)。優しく鈍い顕微鏡視下刃 (メス刃 #10; と頭蓋骨を削って頭蓋骨に付着した結合組織を削除します。図 3)。
2. 優しく円を描いて S1 領域のマーク (直径、センター調整 3 mm:-1.50 mm 前から、正中線から 2.5 mm)、歯科を使用して頭蓋骨にドリル (図 2 b)。
3. 左頭蓋骨 (図 2 b) には、同じ手順を実行します。
4. 歯科用セメントのアプリケーションの基盤を提供するために骨にシアノアクリ レート系スーパー接着剤の薄い層を適用されます。
5. 解剖顕微鏡の下で高速ドリル (図 3 D) を使用して、S1 周辺頭蓋骨の円形溝を薄きます。目的は、その上に光学窓の配置のための滑らかなエッジを作成します。
6. 繰り返し掘削を容易にし、熱を放散する間伐のプロセス中に定期的に頭蓋骨に人工髄液 (アプライド、部屋の温度) を適用します。摩擦誘起の過熱を避けるために断続的に掘削を実行します。家の真空ラインまたは真空ポンプと骨の残骸を吸う離れて。
7. 後、骨の約 2/3 の深さに穴を開けて、ゆっくりと慎重に薄い残りの 1/3 骨スカル (骨フラップ) の円形の部分が周囲の頭蓋骨から完全に解放されるまで。
8. ゆっくりと慎重に # 5/45 鉗子のペアを持つ円形の骨弁を除去し、硬膜 (図 2; を公開図 3E)。
9. 露出した脳の領域のアプライド (図 3E) と潤いを保ちます。出血は脳の血流を変更し、脳腫脹を加速し、画像の品質が著しく低下するので、軟膜血管への損傷を避けるため。
10. 頭蓋骨の左側 (反対側) に同じ手順を実行します。
11. 光学窓の組み立て、接着剤と一度に coverglass 層 1 の間治療に光学接着剤を使用します。必要に応じて、接着接合を強化するインキュベーターで光学ウィンドウ (12 h の 50 ° C) を温めます。光学窓には 2 の部分が含まれます: 最上部に直径 5 mm の単一のラウンド カバー ガラスと下の部分には (図 2 D) 3 mm の直径の 1-3 ラウンド カバー ガラスが含まれています。
12. エタノール (70%、巻/巻) に光学窓を格納し、使用前に滅菌生理食塩水ですすいでください。光学窓のインストールの前に欠陥、堅実で光学接着または不正確な配置の不適切な量を含む光学窓を確認します。
13. 開領域 (図 2 D) に光学窓を取り付けます。光学窓の上の部分にかかっている頭蓋骨化と craniotomized の開口部に収まる光学窓の下の部分 (図 2 D, E) は脳脊髄液の存在下で硬膜にかかっています。
14. (図 2 f; シアノアクリ レート系スーパー接着剤で頭蓋骨に光学ウィンドウの端の上の部分をシールします。図 3 f)。
15. シアノアクリ レート系スーパー接着剤が乾燥しているときは黒歯科用セメント (デンツプライ) ガラスのエッジをカバーするために適用されます。公開されているすべての頭蓋骨に歯科用セメントを適用し、(図 2-H; 光を遮断する余白を傷図 3 b)。
16. 左側の同じ手順を実行します。
17. 加熱パッドで回復し、適切な監視下での回復のためのホームのケージに動物を返すには、動物を許可します。咀嚼と水分補給を容易にするウェット フードを提供します。痛みを減らすためには、管理ブプレノルフィン サウスカロライナ (0.05-2.0 mg/kg) ごとの 8-12 h postinjury 2 日間。回復には、マウスを許可するイメージングの前にさらに 7-10 日間。

3. 2 光子イメージング

1. 実験の日、ケタミン ・ キシラジン (用量および麻酔前述のメンテナンス) を持つ動物を麻酔します。エタノール 75% (巻/巻) と頭蓋のウィンドウをクリーニングします。
2. 2 P 顕微鏡とマウス ヘッド ホルダー耳棒を固定化した頭で加熱パッドで休んで、頭を保持のアダプターから成るイメージング設定の下にマウスを配置します。
3. 同時に光学窓の片側をイメージします。光学収差を最小限に抑える、光学窓と右の頭蓋骨が顕微鏡の光軸に対して垂直に方向であることを確認します。
4. 高い倍率 2 P 血管造影 (図 4 a1) に登録の参考地図として 4 倍の倍率で明視野照明と頭蓋ウィンドウの初期画像を取る。
5. 10 倍の倍率 (図 4 a2) を使用して興味の領域を拡大します。
6. S1 の領域で関心のある領域 (軟膜表面の下 150 μ m) まで I または II に、皮質の層で選択します。高倍率が必要な場合は、20 × 対物を使用します。
7. 複数のニューロンとビューのフィールドを検索します。2 P 顕微鏡 (図 4 b) を使用してイメージを取得します。露出時間と深さに基づく励起光レベル (≈910 nm) と GCaMP6s のより長い露光時間を必要とする信号が弱いと的外れ以下の時間分解能での発現レベルを決定します。我々 は通常、ピクセル露光時間あたり ~ 4 μ 秒を使用します。512 × 512 ピクセルの解像度で 3-5 Hz のフレーム レートで画像を取得します。
8. 時系列の記録を開始します。低倍率画像の利益 (率 ROI) 血管パターンを基準にして、基準点のすべての領域の座標を格納します。時間をかけて同じ ROI をイメージします。左の脳半球の S1 領域のカルシウム動態を観察する同じ手順を実行します。各 ROI から蛍光の変化を計算します。
9. 個別に、またはコマ撮りムービー (図 41-C3 D、E) として、画像を取得します。
10. 2 P 顕微鏡と齧歯動物の尾静脈に注射した蛍光デキストラン染料をイメージングによる皮質血流動態体内研究します。ランドマークとして認識し、長時間にわたってセッションをイメージングで同じ ROI をイメージする血管を使用します。

4. データ処理

1. ImageJ と起源を画像解析に使用します。ImageJ (図 5 aB) 画像をインポートします。個々 のイメージ (または t シリーズ映画) イメージのニューロンと 2 別の近くのバック グラウンド測定法 (図 5) の領域内にある投資収益率を選択します。ROI マネージャー (図 5C) と全磁力を取得します。
   注:図 6代表的なカルシウムの画像を示しています。カルシウム過渡 (緑) と血管 (赤) 表示異なる時点で (図 6A-D) 秒で 7 d でマウスでウィンドウの初期インストール後。赤と緑のチャンネル (図 6 e) または緑チャネル (図 6 階) 3 分録画期間の z 投影も表示されます。Z 投影からラフとサークルの境界 (すべてのフレームに関心のオブジェクト ニューロンを含む) を手動で選択してバック グラウンド地域 (近くに独立した 2 の選択だけでなく、映画のすべての画像の圧縮イメージが表示されます。図 6)。
2. 各投資収益率から平均蛍光バック グラウンド FB、FB を計算 (FB1 + FB2) = 2 とソーマ (F) の蛍光変化で表される/ΔF/F、ΔF/F = (F FB)/FB。
3. 一歩一歩 ImageJ 基線補正、ピーク検索/決定、ピークの統合、ピークのフィッティング、Time-Saving ピーク解析機能などの機能を使用してピーク解析を実行します。

結果

二国間の光学窓を使用すると、2 の独立した実験から結果を得た.最初の実験は、イメージ樹状下肢に EGFP 発現マウスを採用しました。図 41-3は、光学窓注入後異なる時点で撮影した画像の例を示します。番号と樹状突起の分岐と棘の場所が 2 つのビュー (図 4 E、z 投影) と非常に安定したことに注意してください。

2 番目の実験は、 Thy1-一時的なしたがって、単一ニューロン生体内で(図 6) のカルシウムの生理学の測定方法を示す細胞内のカルシウムを測定する GCaMP6s トランスジェニック マウスを採用しました。この手法を使用して記録、V 層の錐体細胞深くに位置する個体群の自発活動を定量化しとして > pia 以下 500 μ m。間数多くの試験 (各時点で平均応答として計算) 時間の経過と共に平均自発的な応答を計算できます。2 P 法多録音と比較して脳に少し機械的障害とは長期間にわたって大規模または分散型神経集団の活動を同時に検出の利点があります。

許容可能な平均測定を生成するには、5-10 試験を推奨します。試行回数は、自発的な応答または特定の刺激への応答の自然な可変性に依存されます。厳密には、上記で説明したすべての手順に従っている場合両方薄く頭蓋骨の頭蓋ウィンドウ テクニックの訓練を受けた研究者と 2 P カルシウム イメージング生体内では 1 日あたり 1-2 動物から両側 100-200 ニューロンの録音を取得できる必要があります。

ピーク解析後ピーク、実際の振幅、領域、および各ピークの半値幅で全幅の実質の位置などの結果のコレクションを取得できます。

図 1:2 光子 (2 P) イメージングのための頭蓋光学ウィンドウのコンポーネントの模式図.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 2:図は頭蓋のウィンドウを準備するための重要なステップを示しています。(A) 解剖顕微鏡下外科はさみのペアを使用して外科的領域に皮膚を削除します。骨まで S1 領域上の頭蓋骨の円形溝 (直径 3 mm) を生成する高速ドリル溝内フラップ (B) 使用は、周囲の骨から分離になります。(C) ゆっくりと基になる硬膜を公開する骨弁を削除します。(D) アセンブル 2 異なる直径を持つ coverglasses の光学窓。上部 coverglass 大径 (5 mm) があり (通常 1-3) の下の coverglasses 径 (3 mm) があります。インストールする coverglasses の厚さは頭蓋骨の厚さに依存します。(E) 場所・ スカルの円形の開口部に coverglass 光学ウィンドウを作成します。Coverglasses の下の部分は、頭蓋開口部に収まるようにします。Coverglasses の下部は優しく硬膜をお問い合わせください。(F) シール ウィンドウは、シアノアクリ レート系接着剤と頭蓋骨にエッジします。(G) とき、シアノアクリ レート系、乾燥、接着剤の壁に横黒歯科用セメントを適用します。(H) 塗りつぶし ddH₂O とイメージングの使用水浸漬の目的に頭蓋のウィンドウ。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 3.頭蓋の二国間 windows の作成。(A) A 写真画像 2 頭蓋光 windows S1 領域を覆う頭蓋骨の両側に。(B) 高倍率画像 (A) の箱入り地域の基になる硬膜や血管を公開する二国間の光学ウィンドウを表示します。スケール バー = 680 μ m。 (C) 露出の頭蓋骨。中央の骨弁を見て、円形の溝を作成する (D)。スケール バー = 900 μ m. (E) 骨弁を除去した後、頭蓋開口部を人工髄液 (アプライド) 満ちていた。スケール バー = 720 μ m. (F) 頭蓋開口部と瞬間接着剤をウィンドウの端をシールに光学窓のインストール。硬膜や血管が光学窓を介して表示されます。スケール バー = 600 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 4:カルシウムと樹状イメージングします。(A1)Thy1のランドマークとして血管 (BV) を使用して興味の地域を識別する-GCaMP6s マウス。(A2)同じランドマークとレコードを使用して時間をかけて同じ標識細胞 (赤矢印) を識別します。(B) 代表 Z - 一次体性感覚野 (S1) のニューロン (赤矢印) でカルシウム信号の投影。スケール バー = 10 μ m. (C1 3) 樹状突起 (緑) と (赤) B6 で血管の可視化。Cg Tg (Thy1YFP) HJrs/J 光学窓インストール後 1 日 S1 領域の II 層の異なる深さで。(D) Z-1 日に同じ地域で複数の画像の投影。(E) Z - 光学窓インストール後 7 日間で同じ地域に複数の画像の投影。数の顕著な安定性と大人の棘樹状分枝 1 日、光学窓インストール後 7 日間の場所に注意してください。スケール バー = C E 5 μ m (C ・ E)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5:カルシウム信号トレースします。(A, B)2 ニューロンのデータ解析のための ImageJ でインポートした t シリーズ映画の例 (1 ニューロンとニューロン 2、それぞれ)。(C) A のスプレッドシート興味の地域から照度のデータを示しています (ROI; 対策を背景としてニューロンと 2 別の近くの領域内にある)。ピークの (D) の計算: ΔF/F = (F FB)/FB、FB = (FB1 + FB2)/2 (平均蛍光バック グラウンド [FB] と ΔF/F で表される相馬 [F] の蛍光変化)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 6.代表的なカルシウム イメージ。(A~D)カルシウム過渡 (緑) と血管 (赤) 7 日目にマウスに秒単位で異なる時点で光学窓のインストール後。黄色の矢印: 比較的小さいアクティブなニューロン。白い矢印: スパイキングニューロン。(E, F)Z - 赤 (血管) と緑 (カルシウム) チャンネル (E) と緑のチャネルだけ (F) の 3 分録画期間の投影。(G) 選択されたニューロンとその隣接した背景領域がマークされます。スケール バー = 10 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

ディスカッション

2 光子イメージング脳表面下約 800 μ m までの合理的な解像度で多くの細胞活性の同時測定が可能にします。2 P とデュアル光学窓技術を搭載した V 層神経突起のある集団におけるカルシウムの動態を観察する遺伝的コード化 GCaMP6s > pia 以下 500 μ m。頭蓋骨の両側に開く光学窓、メソッドにより長期かつ安定的なカルシウムのin vivoイメージングの対称の哺乳類の脳の地域間で、神経活動の記録。このメソッドの重要な側面には、S1 の左右対称領域のパフォーマンスのデュアル オープン頭蓋骨光学ウィンドウを作成する低侵襲手術と神経活動の 2 P イメージングがあります。

両側 S1 領域のネットワーク アクティビティを検査はどのようにデュアル頭蓋 windows の例は、成人の脳の生体における情報処理ローカルと対称をプローブにされる可能性があります。このメソッドを使用して、大脳皮質の可塑性 B6 と神経活動 (例えば Thy1 -GCaMP6s マウスを用いた) を勉強することもできます。一方的な中枢神経系の損傷による求心路遮断後の復旧に対応する対称領域のまま組織から cg Tg (Thy1YFP) HJrs/J。メソッドは、光遺伝学的、電気的または化学的刺激など末梢部の刺激戦略に応えて皮質活動を検討するも使用できます。我々 のみ S1 領域の技術のデモンストレーションがこのアプローチは (M1) 一次運動野の V 層ニューロンなど生きた脳の他の対称の地域での活動を調査するため採用される可能性があります。脳領域の再編成に関する観測機能の外傷後の回復に重要な役割を果たしている適応の運動行動の神経基盤があります。頭固定のマウスでの動作中に識別された遺伝子細胞の対称的な活動の慢性的な測定ができます。

技術的には、捜査官は、品質とデュアル頭蓋 windows の一貫性に細心の注意を払う必要があります。非常に薄く頭蓋骨の頭蓋ウィンドウ テクニック¹²初心者のための練習に勧めします。棘が形態およびローカルの流入と押出機構のためカルシウム コンパートメントです。本研究では、B6 を使用しました。樹状突起スパイン動態体内(図 4) を示す例として cg Tg (Thy1YFP) HJrs/J マウス。開く頭蓋骨ガラス窓枠手術¹²後高い脊椎の回転率と反応性グリア細胞応答を引き起こします。対照的に、薄く頭蓋骨ウィンドウを用いた棘と樹状突起も保存できます。

寸法の選択肢と光学ウィンドウの厚さは希望の視野、頭蓋骨曲率、頭蓋骨の厚さ、およびイメージング¹³の種類に依存します。硬膜の光 coverglasses の圧力不足、頭蓋骨の硬膜の肥厚を引き起こす可能性があり、脳の動きを増加します。対照的に、光 coverglasses の過剰な圧力は、皮質の血流を妨げる可能性があります。

光学窓の接着し、光学接着剤と長波長 UV 光時に coverglasses 1 つの追加の層を治します。接着接合を強化するには、インキュベーターで作製したウィンドウ (12 h の 50 ° C) を温めます。(巻/巻) 70% エタノールで光学窓 coverglass を格納し、手術前に滅菌生理食塩水で洗い流してください。光学ウィンドウは、エラーを回避する使用する前に万国実体写真下 (光学接着または不正確な配置の不適切な量) などの欠陥を調べる必要があります。光学接着剤が薄すぎる場合、空気スペースが織り成す、光学収差や移植でカバー ガラス剥離を引き起こすことができます。対照的に、あまりにも多くの光学接着剤頭蓋のウィンドウのエッジを超えてオーバーフローが発生することができます。

要約すると、ここで我々 のカルシウム動態かThy1で 2 対称一次体性感覚皮質領域から頭蓋窓から樹枝状形態を測定するため実験プロシージャを記述する-GCaMP6s とThy1YFP - トランスジェニック マウス、それぞれ、2 P 顕微鏡を用いた。この手法では、ニューラル ネットワークの複雑な構造と機能の関係を解剖を促進するかもしれない大幅。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
C57BL/6J-Tg(Thy1-GCaMP6s)GP4.3Dkim/J	Jackson	24275	皮質の興奮性ニューロンのサブセットにおいて、緑色蛍光カルシウム指標であるGCaMPを発現する遺伝的にコードされたニューロンの指示薬およびエフェクターによって作製された任意の株であり得る。
B6です。Cg-Tg(Thy1-EGFP)OJrs/GfngJ.	Jackson	7919	皮質内の特定の集団内のニューロンのサブセットでEGFPを発現する任意の株であり得る;明るく、生命力のあるゴルジ様染色を提供する。
デュモン No. 5 鉗子、標準、デュモクセル	ファイン サイエンス ツール	11251-30	任意のブランドを選択できます。
デュモン No. 5SF 鉗子	ファイン サイエンス ツール	11252-00	任意のブランドを選択できます。
マイクロビーズ滅菌器	南部実験器具	B1201	任意のブランドを選択できます。
ハリシゲs SG-4N ヘッドホールディングアダプター	Tritech Research	SG-4N	ブランドを選択できます。
理想的なマイクロドリルコンプリートキット	ハーバード装置	72-6065	任意のブランドを選択することができます。
マイクロドリル	ファインサイエンスツール	19007-05	任意のブランドを選択できます。
丸型カバーガラス、3 mm	ハーバードバイオサイエンス	W4 64-0720	任意のブランドを選択できます。
丸型カバーガラス、5 mm	ハーバードバイオサイエンス	W4 64-0700	任意のブランドを選択できます。
Norland光学接着剤	Norland Products	7106	は、任意のブランドを選択できます。
ロックタイト液体瞬間接着剤	WBメイソン	LOC1647358	ブランドを選択できます。
グリップセメントキット、粉末および溶剤	Dentsply	675570	任意のブランドを選択できます。白い歯科用セメントパウダー(グリップセメント)5部と黒いテンペラパウダーペイント1部を混ぜます(光から遮蔽するため、一部のユーザーは10:1の比率を好みます)。
ジェルフォーム	ムーアメディカル	2928	任意のブランドを選択することができます。
マイクロ解剖ハサミ	Roboz	RS-5841	どんなブランドでもお選びいただけます。
人工脳脊髄液(ASF)	-	-	ACSFには、125 mM NaCl、4.5 mM KCl、26 mM NaHCO3、1.25 mM NaH2P4、2 mM CaCl2、1 mM MgCl2、および20 mMグルコースが含まれています。ACSFを酸素(95%酸素、5%二酸化炭素)で泡立て、pHを7.4に調整します。すべての実験の前に、新しいACSF溶液を準備します。